Hmotnostní detekce v separačních metodách V. Základní principy interpretace hmotnostních spekter malých molekul Proč je dobré porozumět hmotnostním spektrům? 1. Správné nastavení detektoru pro citlivou detekci (např. volba MS/MS přechodů) 2. Potvrzení očekávané struktury analytu z jeho spekter 3. Objasňování struktury neznámých analytů
Před interpretací spekter Postup před interpretací spekter 1. Zajistíme, aby byl vzorek správně připraven a změřen. 2. V případě neznámých vzorků zjistíme co nejvíce doplňujících informací (původ, další spektrální informace, předpokládané složení, struktura výchozí látky v případě reakčních produktů apod.) 3. V případě chromatografických dat zjistíme, který pík odpovídá hledané látce (např. porovnáním se slepým pokusem, jiným detektorem apod.). Příklad: elektroantennografická detekce feromonu M. Hoskovec, http://www.uochb.cz/
Postup před interpretací spekter 4. Minimalizujeme nebo alespoň identifikujeme signály pozadí. Hmotnostní spektra často obsahují signály kontaminujících látek nečistoty (z rozpouštědel, nádobí, předchozích nástřiků) bleeding kolony (pomalé rozpouštění stacionární fáze) klastrové ionty rozpouštědel, matriční ionty v MALDI Ftaláty: - změkčovadla plastů m/z 149, 279, 301, 317... Polyethylenglykoly: pravidelné píky ve spektru, rozdíl 44 Da O OH + 149 O Postup před interpretací spekter Odečet signálů pozadí u chromatografických dat. GC/MS siloxany z GC kolony bez odečtu pozadí s odečtem pozadí
Interpretace hmotnostních spekter Obecný postup interpretace spekter neznámých látek Spektra interpretujeme vždy s ohledem na použitou ionizační techniku! 1. Je-li to možné, porovnáme spektrum s knihovnou spekter. - Pokud shoda není dostatečná, pokračujeme k bodu 2. - Pokud je shoda dostatečná, pokračujeme k bodu 5. 2. Hledáme ion(ty) nesoucí informaci o celé molekule. - Určíme molekulovou hmotnost. - Určíme nebo odhadneme elementární složení iontu (iontů). 3. Hledáme fragmentové ionty nebo interpretujeme spektra MS n - Určíme neutrální ztráty, charakteristické ionty či série. - Interpretujeme důležité ionty ve spektru na základě znalostí fragmentačních mechanismů, analogií a empirických pravidel. 4. Navrhneme možnou strukturu (struktury). 5. Ověříme shodu spekter a retenčních dat se syntetickým standardem.
1. Prohledávání knihoven hmotnostních spekter Knihovny spekter EI NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library Wiley Registry of Mass Spectral Data 306 622 EI spekter (70 ev) 652 475 MS/MS spekter, retenční indexy látek, strukturní vzorce 775 500 EI spekter (70 ev) strukturní vzorce
Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Problémy s tvorbou knihoven: - vzhled MS spektra velmi silně závisí na experimentálních podmínkách (adukty v závislosti na složení mobilní fáze) - v MS spektrech většinou nejsou fragmentové ionty -> knihovny spekter na úrovni MS n -MS n spektra závisí na experimentálních podmínkách (energie ionizace, typ analyzátoru apod.) spektra v knihovnách jsou měřena při několika experimentálních podmínkách http://www.massbank.jp/ https://www.mzcloud.org/ Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Veřejné uložiště MS dat pro sdílení ve vědecké komunitě (~ 40 tis. spekter). Tvorba spojeného (merged) spektra ze spekter měřených za různých podmínek CID.
Knihovny spekter měkkých ionizačních technik Volně přístupná databáze spekter, spektrálních strumů, struktur, fragmentů, chromatografických dat, odkazů apod. (~ 170 tis. spekter, 2600 látek). Spektrální strom: databázová struktura tandemových spekter Identifikace podstruktur možnost identifikace látek které nejsou v databázi 2. Molekulové ionty, molekulové adukty a deprotonované molekuly - Určení molekulové hmotnosti ve spektrech EI - Intenzita molekulového iontu ve spektrech EI - Určení molekulové hmotnosti ve spektrech měkkých ionizačních technik - Nábojový stav iontu - Elementární složení iontu - Dusíkové pravidlo - Ekvivalent počtu cyklů a dvojných vazeb
Určení molekulové hmotnosti ve spektrech EI Hodnota m/z molekulového iontu (M + ) nominálně odpovídá monoizotopické hmotnosti. dekan Mw 142 M + Identifikace molekulového iontu ve spektru EI: 1. Ve spektru nemusí být přítomen. 2. Musí mít nejvyšší m/z ve spektru (s výjimkou těžších izotopologů). 3. Je to ion s lichým počtem elektronů. 4. Poskytuje logické neutrální ztráty. Intenzita molekulového iontu v EI naftalen M + 4-decen 1-nonanol M + M +
Intenzita molekulového iontu v EI Intenzita molekulového iontu odráží jeho stabilitu. pro ~ m/z 150 roste intenzita molekulového iontu Podle intenzity molekulového iontu v EI spektrech lze usuzovat na typ látky. Obrázek podle McLafferty, Tureček, Interpretation of Mass Spectra, 1993 Dovození molekulového iontu z neutrálních ztrát v EI - v případě chybějícího molekulového iontu lze jeho m/z odvodit z logických neutrálních ztrát m/z Int. 182 21.9 183 3.3 184 0.3 193 0.2 208 0.4 M + -H 2 O, tj. (M-18) 211 0.7 M + -CH 3, tj. (M-15) M: 226 Da DOI 10.1007/s10886-012-0214-7
Určení molekulové hmotnosti měkké ionizační techniky Hledáme molekulární adukty ([M+H] +, [M+Na] + ) nebo deprotonované molekuly ([M-H] - ) Molekulový adukt je ion se sudým počtem elektronů a nemusí být nejvyšším iontem ve spektru. vícenásobně nabité ionty molekulární adukty multimery (dimery, trimery..) Určení molekulové hmotnosti měkké ionizační techniky - molekulovou hmotnost určujeme na základě přítomnosti aduktů, dimerů, nebo vícenásobně nabitých iontů M+1 M+1 M+23 (M+2)/2 2M+1 M+39
Určení molekulové hmotnosti ESI+, MS 365.1 347.1 381.0 Určení molekulové hmotnosti ESI+, MS Simulované spektrum pro reserpin určete molekulovou hmotnost.
Určení molekulové hmotnosti nábojové stavy Určení počtu nábojů iontu Počet nábojů lze zjistit ze vzdálenosti mezi píky v izotopovém klastru. Určení molekulové hmotnosti nábojové stavy Příklad: relativní hmotnost 1000 [M + H] + [M + 2H] 2+ Izotopy 1001 1002 1003 1002 1003 1004 12 C 13 C 1 13 C 2 12 C 13 C 1 13 C 2 Spektrum (m/z!) 1001/1=1001 1002/1 = 1002 1003/1=1003 1002/2=501 1003/2 = 501.5 1004/2=502 1 Da 0.5 Da
Určení molekulové hmotnosti ESI-, MS Simulované spektrum pro vankomycin určete molekulovou hmotnost. 723.2 722.7 724.2 723.7 722.7 725.2 724.7 Elementární složení iontu ze spektra změřeného s vysokým rozlišením ze spektra změřeného s nominálním rozlišením I. Spektra vysokého rozlišení Využíváme správnou hodnotu m/z změřenou s vysokou přesností (orbitrap, TOF, sektor, ICR) - počítačový výpočet. Nutno zadat rozsahy pro jednotlivé prvky a předpokládanou chybu měření m/z.
Elementární složení ve spektrech s nominálním rozlišením Využíváme relativní zastoupení iontů v izotopovém klastru. - hledáme takovou kombinaci prvků, která poskytne požadovaný izotopový klastr - v EI-MS uvažujeme chyby měření (±0.2 absolutně, ±10% rel.) Příklad: 1/ výrazný pík X+2, předpokládáme přítomnost O, S, Si (vyloučíme Cl, Br, jejichž X+2 má vyšší intenzitu) 2/ horní hranici pro jednotlivé prvky určíme na základě intenzit X+2 a X+1 píků a m/z iontu: O (0-7), S (0-2), Si (0-1), C (0-6), N (0-8, sudé) 3/ X+2 zhruba odpovídá S 2. Odečteme-li příspěvek S 2 k X+1, je intenzita tohoto píku 4.4 ± 0.4, což odpovídá C 4. Pro C 4 S 2 je molekulová hmotnost 112, zbývá 10. Hledaný sumární vzorec je tedy C 4 H 10 S 2. (diethyldisulfid) m/z Int. 122 100 123 6.0 ±0.6 124 8.9 ±0.9 125 0.5 ±0.2 126 0.2 ±0.2 Využití stabilních izotopů prvků X+1 prvky X prvky X+2 prvky
Dusíkové pravidlo Dusíkové pravidlo: platí pro organické sloučeniny obsahující C, H, N, O, S, P, F, Cl, Br, I. Založeno na faktu, že pouze dusík má lichou vaznost při sudé nominální hmotnosti (ostatní mají sudou nebo lichou vaznost i hmotnost). lichá hmotnost molekuly = lichý počet dusíků sudá hmotnost molekuly = sudý (nulový) počet dusíků EI platí pro M + tak, jak je uvedeno Aplikace pravidla na ionty ESI, APCI, MALDI pro molekulové adukty, platí pravidlo opačně! NH 2 NH 2 + NH 3 + M=93 m/z 93 m/z 94 Ekvivalent počtu cyklů a dvojných vazeb RDBE (Ring and Double Bond Equivalent): konvenční vyjádření stupně nenasycenosti organických molekul Počet cyklů a dvojných vazeb v molekule C x H y N z O n : 1 2 1 2 1 Další prvky přičítáme k CHNO podle jejich valence, Si (+C), P (+N), halogeny (+H) Při aplikaci na ionty: celočíselná hodnota RDBE OE + neceločíselná hodnota RDBE EE +
Ekvivalent počtu cyklů a dvojných vazeb Příklad: methyloktanoát RBDE = 1 C 3 H 6 0 2 RBDE = 1.5 C 4 H 7 0 2 + H 2 C O O CH 3 RBDE = 1 M + C 9 H 18 0 2 3. Fragmentové ionty - Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů (EE + ) - Fragmentace iontů s lichým počtem elektronů (OE + )
Fragmentace iontů se sudým počtem elektronů (EE + ) ESI, APCI (CI, APPI, MALDI, DESI...) Fragmentace EE + CID fragmentace iontů se sudým počtem elektronů ([M+H] +, [M+Na] +, [M-H] - ) štěpení sousední vazby vzhledem k náboji, migrace náboje R-OH + H R-OH + 2 R-OH 2+ R + + H 2 O FRAGMENTACE EE + : vzniká ion se sudým počtem elektronů (EE + ) a neutrální částice EE + EE + +M Ionty EE jsou obecně stabilnější než OE + Spektra jsou jednodušší, poskytují tak méně informací než spektra EI, bývají citlivá na malé změny ve struktuře
Fragmentace EE + Př. Fragmentační mechanismy terciárních aminů dva konkurenční procesy N + R 1 H R 3 R 2 + H 2 C N R 1 H R 3 R 2 A. Indukční štěpení (kladný náboj si přitáhne elektronový pár původně tvořící C-N vazbu; migrace náboje) - Neutrální ztráta sekundárního aminu N + R 1 H R 3 R 2 H H 2 C N + R 1 H R 3 H R 2 B. Přesmyk β-vodíku (přesun vodíku na dusík doprovázený štěpením N-C vazby; retence náboje na dusíku) - Neutrální ztráta alkenu. Fragmentace EE + Fieldovo pravidlo: při disociaciaci se nejsnadněji ztrácí neutrální molekula s nejnižší protonovou afinitou. - fragmentace je ovlivněna stabilitou vznikajícího iontu, roli hrají sterické faktory a intramolekulární H-vazby - Fieldovo pravidlo určuje relativní poměr fragmentů pro konkurenční štěpení (indukční, přesmyk β-vodíku) (suma fragmentů odpovídá [M+H]+1
Fragmentace EE + Fragmentace EE + je často možné popsat jako sérii následných ztrát neutrálních molekul. Typické ztráty neutrálních částic: 17: NH 3 aminy alifatické, aromatické (+) 18: H 2 O kyslíkaté sloučeniny, hydroxyderiváty(+/-) 27: HCN - aminy alifatické, aromatické, nitrily arom. (+/-) 28: CO aldehydy, ketony, nitroaromáty (+/-) 32: CH 3 OH methyl estery (+) 42: CH 2 C=O N-acetyl deriváty (+/-) 44: CO 2 karboxylové kyselin, karbamáty (+/-) 80: SO 3 sulfonové kyseliny (+/-) 162: anhydroglukosa glukosidy (+/-) Zakázané neutrální ztráty: 3-14, 21-25, 37-40 Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid ESI+, MS 152.0 C 8 H 9 NO 2 ; M=151.1 303.1 Mass Intensity 152 100.0 153 8.7 154 0.7 153.0 325.1
Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid ESI+, MS/MS 110.0 152.0 134.0 Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid ESI+, MS 3 110.0 92.0 82.1 93.0
Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid ESI+, MS/MS Jaké produktové ionty očekáváte v MS/MS spektru dimeru [2M+H] +? m/z 303.1? Paracetamol N-(4-hydroxyfenyl)acetamid ESI+, MS/MS 152.0 303.1
Kyselina menthyloxyoctová ESI-, MS/MS 75.3 C 12 H 22 O 3 ; M=214.2 213.3 73.3 167.3 169.2 195.2 Kyselina 2-merkaptonikotinová ESI+, MS/MS 138.1 C 6 H 5 NO 2 S; M=155.0 156.1
Kyselina 2-merkaptonikotinová ESI+, MS 3 138.1 110.1 128.1 100.1 Cyklopentafuranol-deriv ESI+, MS/MS 311.2 C 18 H 26 O 4 ;M=306.2 329.2 269.2
Cyklopentafuranol-deriv, disil ESI+, MS/MS 557.3 C 30 H 54 O 4 Si 2 ; M=534.4 293.1 425.1 275.1 497.2 539.2 PGF 2 -methylester, dithp ESI+, MS/MS 459.3 457.3 475.3 C 31 H 52 O 7 ; M=536.4 373.1 375.1 559.3
Chloroxin 214.1 APCI+, MS 216.1 C 9 H 5 Cl 2 NO; M=213.0 215.1 217.1 218.1 219.1 Chloroxin 179.1 APCI+, MS/MS 214.1 150.1 186.1
Chloroxin APCI+, MS/MS Jaké ionty očekáváte v MS/MS spektru při fragmentaci izotopických píků m/z 216 a m/z 218? Chloroxin 216.1 APCI+, MS/MS 179.1 181.1 150.1 152.1 188.1
Chloroxin APCI+, MS/MS 181.1 218.1 190.1 152.0 Chloroxin C 9 H 5 Cl 2 NO; M=213.0
Triacylglyceroly APCI+, MS/MS 18:1 14:1 16:1 801.7 547.5 18:1 14:1 547.5 OMoPo C 51 H 92 O 6 ; M=800.7 18:1 575.5 16:1 14:1 519.4 519.4 575.5 801.7 16:1 818.7 Triacylglyceroly APCI+, MS Určete strukturu triacylglycerolu. 876.4 577.4 603.4 859.5
Triacylglyceroly Určete strukturu triacylglycerolu. APCI+, MS 635.5 Alkaloidy - morfin ESI+, MS 286.2 Mass Intensity 286 100.0 287 19.7 288 2.6 289 0.5 287.2 MORFIN C 17 H 19 NO 3 ; M mi =285.1 288.2
Alkaloidy - morfin ESI+, MS/MS Alkaloidy Pokuste se odhadnout strukturu alkaloidu. ESI+, MS/MS
Cukry - sacharóza ESI+, MS/MS štěpení glykosidické vazby 203.0 MS 2 185.0 365.1 Digalaktosyldiacylglyceroly ESI+, MS/MS 681.2 DGDG 18:3/16:0 C 49 H 86 O 15 ; M mi =914.6 659.3 497.3 519.3 775.3 937.4
Glykosidy Saponin AGINOSID C 50 H 82 O 24 ; M mi =1066.5 Glykosidy - aginosid ESI+, MS/MS Na + 927.3 957.3 1089.3 633.3 795.4 479.1 641.1
Fragmentace iontů s lichým počtem elektronů (OE + ) EI Fragmentace OE + Při EI vznikají fragmenty již v MS kroku (nejsou nutné fragmentační techniky jako CID apod.) FRAGMENTACE OE + I. vzniká ion se sudým počtem elektronů a radikál OE + EE + +R II. vzniká ion s lichým počtem elektronů a neutrální částice OE + OE + +M Spektra jsou bohatá, informačně obsažná, mohou být použita jako fingerprint pro tvorbu knihoven spekter Probíhají pouze monomolekulární reakce
Neutrální ztráty - nízkomolekulární neutrální částice (včetně radikálových), které se běžně odštěpují z molekulových iontů. Většinou vznikají štěpením jednoduché vazby. - ionty vzniklé neutrální ztrátou jsou důležité pro správné určení molekulového iontu i pro určování struktury - zakázané neutrální ztráty: 3 14, 21 25 a 37 40 Da ztráta složení ztráta složení ztráta složení 1 H 19 F 30 CH 2 O 2 H 2 20 HF 31 CH 3 O 3-14 - 21-25 - 32 CH 4 O, S 15 CH 3 16 NH 2, O 17 OH, NH 3 18 H 2 O 26 C 2 H 2, CN 27 C 2 H 3, HCN 28 C 2 H 4, CO 29 HCO, C 2 H 5, CH 3 N 33 SH 34 H 2 S 35 Cl 36 HCl Neutrální ztráty dimethyldisulfid chlorbenzen 15 35 CH 3 Cl
Charakteristické ionty ve spektru - některé charakteristické hodnoty m/z umožňují učinit typ sloučeniny m/z složení 19 F +, H 3 O + 20 HF + (F v molekule) 30 CH 2 NH + 2 (aminy) 33, 34 HS +, H 2 S + (S v molekule) 35-38 Cl +, HCl + (Cl v molekule) 46 NO + 2 (nitrolátky) 73 (CH 3 ) 3 SiH 2+ (TMS deriváty) 60 mastné kyseliny 74, 87 methylestery mastných k. 77 C 6 H + 5 (fenyl) 149 C 8 H 5 O + 3 (ftaláty) McLaffertyho ionty (alifatické sloučeniny) Charakteristické iontové série - homologické série v oblasti nízkých m/z mohou podat informace o strukturních prvcích v molekule
Klasifikace fragmentačních reakcí při EI Přímá štěpení vazeb - štěpení σ-vazby - α-štěpení - indukční štěpení Přesmyky - přesmyky vodíků - další reakce Štěpení σ vazby je-li při ionizaci vyražen elektron ze -vazby, dojde k jejímu štěpení typická fragmentace pro alkany, případně pro F-, Cl-, CN- substituované alkany 100 43 57 H 3 C CH 3 dekan 50 27 29 41 71 85 39 99 142 36 53 63 77 113 126 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 (mainlib) Decane
Pravidlo ztráty největšího alkylu - Pro alkylové skupiny vázané ke stejnému nebo ekvivalentnímu uhlíku platí, že relativní zastoupení vznikajících iontů je nepřímo úměrné velikosti ztrácejícího se alkylu. CH 3 + CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 CH 3 + H C CH 3 CH 3 H 3 C CH + CH 3 H 3 C CH + CH 3 100 43 57 71 85 56 57 50 41 29 71 27 39 55 70 85 44 53 62 74 77 83 100 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 (mainlib) Pentane, 2,3-dimethyl- Štěpení σ vazby intenzita fragmentových iontů závisí na jejich schopnosti stabilizovat náboj 100 57 253 43 50 71 57 85 253 99 113 141 169 197 225 267 282 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 (mainlib) Nonadecane, 3-methyl-
Štěpení σ vazby Určete polohu methylového větvení u methyltridekanů 155 4-methyltridekan 71 169 57 3-methyltridekan Chloromethan EI M + CH 3 + Cl +
Unknown Jaká je struktura látky? EI α-štěpení: fragmentace vyvolaná radikálem - štěpení vyvolané tendencí elektronů tvořit páry lichý elektron je poskytnut na tvorbu nové vazby, štěpí se sousední vazba - přímé štěpení vazby - homolytické štěpení - retence náboje Schopnost vyvolat α-štěpení klesá v řadě: N > S, O, R > Cl, Br > H
α-štěpení: fragmentace vyvolaná radikálem Př. diethylether m/z 59 100 31 59 50 29 45 74 27 15 19 26 28 41 43 73 30 32 39 44 46 57 60 75 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 (mainlib) Ethyl ether α-štěpení: benzylové štěpení 100 91 50 106 51 65 77 39 15 27 74 86 89 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 (mainlib) Ethylbenzene
α-štěpení: allylové štěpení Př. 1-buten m/z 41 Indukční štěpení: fragmentace vyvolaná nábojem - štěpení vyvolané přitahováním elektronového páru nábojem - přímé štěpení vazby - heterolytické štěpení - rmigrace náboje Schopnost vzniku R + z R-Y klesá v řadě: Cl, Br, NO 2 > O, S > N, C
Indukční štěpení: fragmentace vyvolaná nábojem Př. diethylether 100 31 59 50 29 45 74 27 15 19 26 28 41 43 73 30 32 39 44 46 57 60 75 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 (mainlib) Ethyl ether Fragmentace cyklických struktur Retro Diels-Alder -elektrony dvojné vazby u cyklických struktur jsou primárním místem ionizace 4-fenylcyklohexen
Přesmyky vodíku McLaffertyho přesmyk přesmyk -vodíku na nenasycenou skupinu přes 6-členný kruh. Nové radikálové místo vyvolá -štěpení Přesmyky vodíku McLaffertyho přesmyk Vziklé OE + jsou typické pro řadu funčních skupin aldehydy, ketony, estery, kyseliny, amidy, karbonáty, fosfonáty apod. 100 74 O O 87 50 41 55 29 15 101 129 143 171 214 115 157 0 10 40 70 100 130 160 190 220 (mainlib) Dodecanoic acid, methyl ester
Přesmyky vodíku McLaffertyho přesmyk Literatura ESI APCI CI Wilfried M. A. Niessen, Ricardo A. Correa C.: Interpretation of MS- MS Mass Spectra of Drugs and Pesticides, John Wiley & Sons (2017), ISBN: 978-1-118-50018-7 Alex. G. Harrison: Chemical Ionization Mass Spectrometry, CRC(1992). ISBN-10: 0849342546, ISBN-13: 978-0849342547 EI Fred W. McLafferty and Frantisek Turecek: Interpretation of Mass Spectra. University Science Books (1993). ISBN-10: 0935702253, ISBN-13: 978-0935702255 Fulton G. Kitson, Barbara S. Larsen, and Charles N. McEwen: Gas Chromatography and Mass Spectrometry. Academic Press (1996). ISBN-10: 0124833853, ISBN-13: 978-0124833852