Závěrečná zpráva projektu QJ

Závěrečná zpráva projektu QJ1220218 2012 2016 Vývoj efektivních opatření eliminujících dopad invaze Chalara fraxinea (H. fraxineus) v lesním školkařství a v navazujících aspektech lesního a vodního hospodářství Ludmila Havrdová Karel Černý Karel Dohnal Miloň Dvořák Liliya Fedusiv Šárka Gabrielová Markéta Hrabětová Zuzana Haňáčková Ondřej Koukol Petr Martinec Marcela Mrázková Kateřina Novotná Vítězslava Pešková Veronika Strnadová Petra Štochlová Daniel Zahradník

Obsah Stručné představení projektu..... 3 Výsledek V001 Rozšíření a význam Hymenoscyphus fraxineus v ČR.... 5 Výsledek V002 Populační analýza H. fraxineus v ČR.. 10 Výsledek V003 Citlivost H. fraxineus vůči fungicidním přípravkům. 15 Výsledek V004 Mykoflóra endofytů jasanů.. 22 Výsledek V005 Biologický přípravek využitelný proti H. fraxineus... 26 Výsledek V006 Biologie a etiologie choroby. 30 Výsledek V007 Genotypy jasanu odolné vůči infekci H. fraxineus 37 Výsledek V008 Metodika pěstování jasanů.. 42 RIV výsledky 2012 2016.... 44 Hospodaření 2012 2016... 45 Změny v projektu 2012 2016. 45 Literatura.. 46 Příloha 1 Vyjádření ÚKZÚZ. 48 Příloha 2 Vyjádření ÚPV... 49 2

Stručné představení projektu chalara QJ1220218 Projekt Vývoj efektivních opatření eliminujících dopad invaze Chalara fraxinea v lesním školkařství a v navazujících aspektech lesního a vodního hospodářství ( chalara ) byl podpořen programem KUS (Komplexní udržitelné systémy v zemědělství) NAZV MZe. Cílem podprogramu KUS PP2 (Udržitelný rozvoj lesního a vodního hospodářství a ostatních oblastí zemědělství) je vypracovat nové postupy a systémy opatření v lesním hospodářství, diferencovaně podle intenzity hospodaření, na podporu biodiverzity druhové skladby a odolnosti vůči extrémním vlivům počasí a klimatickým změnám a pro podporu retenčních schopností lesních ekosystémů. Cíle podprogramu byly v rámci projektu splněny. Projekt také velmi dobře navazoval a svými výstupy pomohl splnit cíle mezinárodního projektu FPS COST Action FP1103; Fraxinus dieback in Europe: elaborating guidelines and strategie for sustainable management (FRAXBACK). Projekt chalara řeší aktuální problematiku a dopady invaze cizího mikroskopického organismu Hymenoscyphus fraxineus na různé jasanové porosty v ČR. Cílem projektu je zvýšení konkurenceschopnosti podnikatelských subjektů zabývajících se produkcí sadebního materiálu lesních a okrasných dřevin, které bude dosaženo výrobou uplatňující procesy, které eliminují dopad H. fraxineus (snížení přímých škod), produkcí odolného sadebního materiálu jasanu a uplatněním biologického přípravku, který bude omezovat možnost pronikání H. fraxineus do pletiv hostitele (větší konkurenceschopnost na trhu). V důsledku uplatnění výsledků projektu dojde ke zlepšení dosavadní nepříznivé situace v uplatnění jasanu ve výsadbách v lesním a vodním hospodářství a dojde k udržení a posílení produkčních i mimoprodukčních funkcí lesa a stromových výsadeb v podmínkách biologické invaze H. fraxineus. Cílem projektu je udržení jasanu v současném patosystému:jasan H.fraxineus prostředí. Doba řešení projektu: 04/2012 12/2016 Projektový tým: Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v.v.i. (příjemce-koordinátor) Výzkumný ústav lesního hospodářství a myslivosti, v.v.i. (příjemce) Univerzita Karlova v Praze (příjemce) Mendelova univerzita v Brně (příjemce) Povodí Labe, s. p. (další účastník) Sdružení lesních školkařů ČR, z. s. (další účastník) Na projektu bylo plánováno osm výsledků, viz Tabulka 1., které byly během řešení projektu postupně dosaženy. Jednotlivé výsledky jsou popsány níže v samostatných kapitolách. Tab. 1. Přehled výsledků projektu QJ1220218 Identifikační číslo výsledku Název výsledku Termín dosažení výsledku (rok) V001 Rozšíření a význam Hymenoscyphus fraxineus v ČR 2014 2014 V002 Populační analýza H. fraxineus v ČR 2014 2015 V003 Citlivost H. fraxineus vůči fungicidním přípravkům 2014 2014 V004 Mykoflóra endofytů jasanů 2015 2015 V005 Biologický přípravek využitelný proti H. fraxineus 2016 2018 V006 Biologie a etiologie choroby 2016 2016 V007 Genotypy jasanu odolné vůči infekci H. fraxineus 2016 2018 V008 Metodika pěstování jasanů 2016 2017 Termín realizace výsledku (rok) 3

Poznámka Pro označení původce onemocnění, které způsobuje současné odumírání jasanů nekrózy jasanu bylo dříve používáno jméno anamorfního stádia patogenu Chalara fraxinea. Po nalezení teleomorfního stádia Hymenoscyphus pseudoalbidus (Queloz et al. 2011) došlo v průběhu řešení projektu na sloučení jmen podle nových nomenklatorických pravidel do v současnosti používaného Hymenoscyphus fraxineus (Baral et al. 2014). Proto je možné se v závěrečné zprávě setkat se všemi těmito názvy. V současné době je platné: teleomorfní stádium: Hymenoscyphus fraxineus (T. Kowalski) Baral, Queloz & Hosoya (Baral et al. 2014) anamorfní stádium: Chalara fraxinea T. Kowalski (Kowalski 2006) Jelikož bylo před dokončením projektu zřejmé, že nebudou moci být splněny výstupy 1 P (výsledek V005 u kterého nebyl do současné doby nalezen takový druh endofytu, který by úspěšně potlačoval rozvoj patogenu) a 3 P (výsledek V007, který nemůže být z důvodu legislativního vakua splněn, viz vyjádření ÚKZÚZ, Příloha 1 a vyjádření ÚPV, Příloha 2), bylo ze strany poskytovatele v r. 2016 požadováno jejich nahrazení dalšími publikacemi nad rámec plánovaných a to 4 Jimp (Q1, Q2) a 1 Nmet (vyjádření poskytovatele č. j. 37650/2016-MZE-14152 ze dne 23. 6. 2016). 4

Výsledek V001 Rozšíření a význam Hymenoscyphus fraxineus (Chalara fraxinea) v ČR Cíl výsledku: Identifikovat rozsah rozšíření a význam H. fraxineus (Ch. fraxinea) v ČR. Zodpovědný řešitel: Ludmila Havrdová Termín dosažení výsledku: 2014 Termín realizace výsledku: 2014 Plánovaná forma výsledku dle RIV: 1 Nmap, 2 Jrec Cíl byl splněn a rozšířen o spolupráci s LČR, s. p. Výsledky byly zpracovány do výstupu Nmap (Specializovaná mapa, která byla úspěšně certifikována; smlouva o využití výsledků byla uzavřena s LČR, s. p. a s ÚHÚL) a do výstupu 2 Jimp. U tohoto výsledku došlo oproti projektu k posunutí termínu dosažení výsledku z důvodů opakovaných mateřských a rodičovských dovolených v řešitelském kolektivu. Proto, ale mj. i z důvodu v návrhu projektu neplánované efektivní spolupráce s LČR, s. p., bylo upřednostněno zpracování dat získaných z lesních porostů a publikace jejich výsledků. Specializovaná mapa byla v rámci projektu vytištěna. Mapování LČR Výzkum zabývající se výskytem a významem invazního houbového patogenu Hymenoscyphus fraxineus v lesních porostech se sestával z několika fází. V první fázi (2013) proběhlo mapování výskytu patogenu v lesních porostech ve správě Lesů ČR, s. p., kdy byla zjišťována před prvním opadem listů přítomnost patogenu dle symptomů napadení (k tomuto účelu byl vyhotoven leták LOS Havrdova et al. 2013), míra napadení porostů a vybrané porostní charakteristiky. Do sběru dat se zapojilo 49 lesních správ a dva lesní závody; celkem bylo zmapováno 81 LHC. Informace byly sbírány v nadmořské výšce 150 900 m n. m. s použitím pěti tříd poškození (prosychání) jasanu působeném patogenem H. fraxineus: bez poškození (0 %), s malým poškozením (1 10 %), se středním poškozením (11 25 %), s významným poškozením (26 50 %) a s vysokým poškozením (51 100 %). Pro zpracování dat byly použity průměrné hodnoty těchto kategorií (0,0; 5,0; 17,5; 37,5 a 75 %). Celkem byly po vyčištění dat získány informace k 1169 porostům se zastoupením jasanu v rámci celé ČR. V programu R-plus byla sada získaných 37 vysvětlujících proměnných upravena a za pomocí Obecného lineárního modelu (GLM) a jiných programů vyhodnocena. Poškození bylo v r. 2013 identifikováno v 945 z celkových 1169 porostů (80,8 %). Průměrné poškození korun dosahovalo 27,4 %, s nejčastějším výskytem kategorie 17,5 %. GLM model vysvětlil, téměř 26 % variability dat nekrózy jasanu. V modelu byl rozsah onemocnění pozitivně ovlivněn zakmeněním, AVB (absolutní výškovou bonitou), vertikální terénní heterogenitou, teplotou a přítomností a šířkou vodního toku; negativně byl ovlivněn střední výškou porostu, LVS (lesním vegetačním stupněm) a vzdáleností k nejbližšímu jasanovému porostu. Tento model potvrdil důležitou roli v dřevinné skladbě porostů s jasanem. Rozsah onemocnění byl nejvyšší v přítomnosti Quercus robur a nejnižší v přítomnosti Acer spp. a Abies spp. Toto zjištění je pravděpodobně v důsledku odlišného chemického složení směsného opadu a vyplavováním a translokací živin z javorového opadu do jasanových řapíků, což by mohlo urychlit jejich rozklad a vzhledem k fungistatickým taninům a sekundárním metabolitům z jedlového opadu, což by mohlo inhibovat mikrobiální růst. Rozsah onemocnění se také významně lišil podle ekologických řad, a proto byly GLM modely vytvořeny pro jednotlivé řady samostatně. Tyto modely se od sebe navzájem lišily a vysvětlily 23 5

37 % variability onemocnění; byly také stanoveny další faktory, které ovlivňují rozsah onemocnění v rámci jednotlivých ekologických řad: vzdálenost od vody, směrodatná odchylka sklonu, plocha porostu zastoupení jasanu, zásoba porostu, expozice, TPI (Topographic Position Index), reliéf a přítomnost jiných taxonů stromů, jako Pinus spp., Quercus petraea, Fagus sylvatica a Betula pendula. Výsledky ukázaly, že rozsah onemocnění (nekrózy jasanu) je podstatně ovlivněn environmentálními a stanovištními charakteristikami a že vývoj účinných strategií lesního hospodaření řešící epidemii je alespoň ve střední Evropě možný (Havrdová et al. 2017). Následně bylo 1169 porostů použito jako modelových ploch pro vytvoření predikce pro 164 408 lesních porostů se zastoupením jasanu v ČR. K tomu byla připravena prostorová databáze s využitím datových podkladů LČR, s. p. a ÚHÚL, která obsahovala i některé porostní charakteristiky. Pomocí programu GIS a ArcGIS byla získána data vztahující se k vymezenému okolí porostů (obalová zóna 500 m) a environmentální charakteristiky vztahující se přímo k porostům, celkem byl získán soubor 24 vysvětlujících proměnných. Po úpravě vstupních dat pro potřeby statistického vyhodnocení, bylo při předběžném vyhodnocení zjištěno, že míra poškození jasanů se liší v závislosti na ekologické řadě a v případě různých ekologických řad je ovlivňována různými faktory, proto bylo následné hodnocení míry poškození a environmentálního rizika provedeno pro každou ekologickou řadu samostatně. Některé ekologické řady s malým počtem modelových porostů (tj. řada extrémní a podmáčená) byly spojeny s další nejbližší ekologickou řadou. Data byla pomocí GLM modelu vyhodnocena a pro data porostní a environmentální vyjádřena v programu GIS metodou ( quantile ), jako predikce potenciálního současného poškození lesních porostů ČR nekrózou jasanu (Obr. 1). Do tohoto modelu byly zahrnuty proměnné, jako je např. střední výška porostu, zakmenění, ekologická řada, průměrný úhrn ročních srážek a další. Obr. 1. Predikce potenciálního současného poškození lesních porostů ČR nekrózou jasanu 6

Model predikuje vyšší poškození porostů v oblastech s vyšší dostupností vody, v okolí toků, v nížinách, v údolních a uzavřených polohách apod. Menší poškození je predikováno v polohách sušších, více exponovaných v horních částech svahů, na temenech kopců apod. Vyšší poškození je predikováno v mladších porostech, v porostech s vyšším zakmeněním a vyšší dostupností živin. Velmi ohrožené jsou právě porosty mladé a obecně lze předpokládat velké problémy s odrůstáním mlazin, tyčkovin a tyčovin, a to i v oblastech s nižší mírou rizika. Plně vzrostlé porosty mohou v řadě případů do značné míry chorobě odolávat déle i v oblastech relativně méně příznivých (Slezsko, aj.; Obr. 1). Do predikčního environmentálního modelu popisujícího potenciální trvalé riziko nezávislé na stavu porostů byly zahrnuty proměnné jako je např. průměrná nadmořská výška, dlouhodobé srážky, geomorfologie terénu a další. Data byla vyádřena pomocí Jenksovi metody přirozených zlomů ( natural breaks ). Dílčí modely jednotlivých ekologických řad vysvětlovaly průměrně 15,9 % (rozsah 3,8 32,0 %) variability dat. Mezi proměnné, které byly sdíleny s různými modely, patří např. průměrná nadmořská výška, jiné proměnné byly specifické pro určité ekologické řady jako např. průměrný sklon terénu, expozice apod. Mapa environmentálního rizika výrazně lépe specifikuje oblasti s různou mírou rizika rozvoje, resp. nebezpečnosti choroby, doplněné zřetelnými gradienty různých úrovní poškození (Obr. 2). Z výsledků lze vyčíst, že riziko poškození roste spolu s úživností stanoviště a dostupností vody a teplotou a klesá s nadmořskou výškou, vertikální heterogenitou stanoviště a zvyšujícím se sklonem. Obr. 2. Predikce trvalého environmentálního rizika ovlivňujícího dopad nekrózy jasanu v lesních porostech ČR Výsledné modely a predikce představují významný pokrok v poznání významu nekrózy v krajinném měřítku a jsou cenným podkladem ke středně- a dlouhodobému managementu choroby (Havrdová et al. 2016a; Chumanová et al. v řízení). 7

Mapování VÚKOZ, VÚLHM, PLA V prvé řadě bylo nutné na základě přírodních podmínek (členitost reliéfu, nadmořská výška, průměrné roční srážky a teploty) vytvořit síť map (5 5 km) pro celou ČR, která rozdělovala území do pěti typů krajiny v rámci 3 tis. čtverců. Z těchto pak bylo náhodně vybráno 10% čtverců (z nichž každý byl pro přesnější získání dat rozdělen na třetiny zjištěné hodnoty byly na čtverec zprůměrovány), ve kterých probíhalo hodnocení 3 typů porostů: lesní porost, břehový porost, roztroušená výsadba. Pro každý vybraný čtverec byla vytvořena speciální ortofotomapa propojená s údaji o výskytu jasanů v lesních porostech, hranici lesa, vodních tocích a komunikacích. Geostatistická data o výskytu jasanu v lesních porostech ČR byla získána z Ústavu pro hospodářskou úpravu lesů Brandýs nad Labem a z Lesů ČR, státní podnik. Výskyt jasanů v břehových porostech, volné krajině, či intravilánu obcí bylo nutné vždy ověřit na místě šetření. Intravilány měst, nebyly do výzkumu zahrnovány. Z analýzy získaných dat v rámci plošného průzkumu rozšíření a rozsahu nekrózy jasanu v lesních a břehových porostech a v roztroušených výsadbách vyplývá, že se poškození těchto typů vegetace navzájem průkazně liší. Nejméně jsou poškozovány roztroušené výsadby ve volné krajině (p < 0,001), více pak lesní porosty a nejvíce postiženy jsou porosty břehové. Tyto rozdíly jsou zapříčiněny odlišnou ekologickou vhodností zmiňovaných typů prostředí pro patogen, zejména pak jejich vlhkostí. Výsledky z toho úkolu byly použity při tvorě metodiky (Černý et al. 2016, viz V008). Výstupy RIV V001 Chumanová, E., Romportl, D., Havrdová, L., Zahradník, D., Pešková, V. and Černý, K. (v řízení). Predicting severity of ash dieback in forest stands using regession-based models and GIS. Forest Pathology. Havrdová, L., Černý, K. (2017). Symptomatologie nekrózy jasanu. Certifikovaná metodika. Skovsgaard, J. P., Wilhelm, G. J., Thomsen I. M., Metzler, B., Kirisits, T., Havrdová, L., Enderle, R., Dobrowolska, D., Cleary, M., Clark, J. (v řízení). Silvicultural strategy for Fraxinus excelsior in response to dieback caused by Hymenoscyphus fraxineus. Forestry. Havrdová, L., Zahradník, D., Romportl, D., Pešková, V., Černý, K. (2017). Environmental and silvicultural characteristics influencing the extent of ash dieback in forest stands. Baltic Forestry, Special issue: Susceptibility of European Tree Species to Alien Invasive Pests, přijato. Černý, K., Havrdová, L., Zlatník, V., Hrabětová, M. (2016). Pěstování jasanu v prostředí s výskytem Hymenoscyphus fraxineus. Certifikovaná metodika. Certifikace 30. 12. 2016 Mze (Osvědčení č. 73910/2016-MZE-16222/M140). VÚKOZ, v.v.i., Průhonice, 51 p. ISBN 978-80-87674-18-5, ISBN 978-80-88184-05-8. Havrdová, L., Zahradník, D., Černý, K., Chumanová, E., Romportl, D., Pešková, V. (2016). Mapa potenciálního poškození lesních porostů ČR nekrózou jasanu. Specializovaná mapa s odborným obsahem. Certifikace 2. 11. 2016 MZe (osvědčení č. 60487/2016-MZE-16222/MAPA656). VUKOZ, v.v.i., Průhonice, 27 p. ISBN 978-80-87674-15-4. V rámci nesplněných výsledků 4 P, u kterých bylo ze strany poskytovatele v r. 2016 požadováno jejich nahrazení dalšími publikacemi, byl také požadován výstup 1 Nmet (vyjádření poskytovatele č. j. 37650/2016-MZE-14152 ze dne 23. 6. 2016), který je v současné době dokončován: Havrdová, L., Černý, K.: Symptomatologie nekrózy jasanu (k certifikaci bude odeslán do konce ledna 2017). 8

Jiné výstupy V001 Havrdová, L., Zahradník, D., Romportl, D., Černý, K. (2016). Problematika napadení lesních porostů druhem Chalara fraxinea. Setkání lesníků AOPK ČR, 13 14. 10. 2016, Kytlice. Havrdová, L., Zahradník, D., Chumanová, E., Romportl, D., Pešková, V., Černý, K. (2016). Environmentální a porostní charakteristiky ovlivňující dopad Hymenoscyphus fraxineus v lesních porostech ČR. Workshop Micromyco, 30 31. 8. 2016, AV ČR Krč, Praha. Havrdová, L., Zahradník, D., Černý, K. (2016). Environmental factors affecting the impact of ash dieback. COST FRAXBACK (FP 1103) Final Conference, March 29 th April 1 st 2016, Jurmala/Riga, Latvia. Romportl, D., Chumanová, E., Havrdová, L., Černý, K. (2016). Modelling potential occurrence of Hymenoscyphus fraxineus in forests of the Czech Republic. COST FRAXBACK (FP 1103) Final Conference, March 29 th April 1 st 2016, Jurmala/Riga, Latvia. Havrdová, L., Zahradník, D., Romportl, D., Pešková, V., Černý, K. (2016). Environmental and silvicultural characteristic influencing the extent of ash dieback in forest stands. COST FRAXBACK (FP 1103) Final Publication, March 2nd 3rd, Saffron/Bratislava, Slovakia. Havrdová L., Černý K. (2014): Vegetation type and air humidity determine the extent of ash dieback. In: 11th Conference of the European Foundation for Plant Pathology, 8 13. 9. 2014, Kraków, Poland. Book of Abstracts. 323 p. Havrdová, L., Zahradník, D., Černý K. (2014). Environmental factors affecting the impact of ash dieback. COST FRAXBACK (FP 1103) September 15th 18th 2014, Palanga, Lithuana. Participants, Program and Abstracts 3 4 p. Koukol, O. et Havrdová, L. (2014). Vřeckovýtrusá zkáza jasanů. Živa 1/2014, p. 7 10. Havrdová L. et Černý K. (2013). Nekróza jasanu přehled současných znalostí. Zpravodaj Ochrany Lesa 17/2013, p. 56 63. Havrdová L., Černý K., Pešková V. (2013). Hymenoscyphus pseudoalbidus V. Queloz, C. r. Grünig, R. Berndt, T. Kowalski, T. N. Sieber et O. Holderieder (anamorfa Chalara fraxinea T. Kowalski) Nekróza jasanu. Lesnická práce 92 (6), Příloha 4 p. Havrdová, L., Dvořák, M., Jankovský, L., Procházková, Z. (2012). Situation with Ash in the Czech Republic. COST FRAXBACK November 13th 14th 2012, Vilnius, Lithuana. Havrdová L. (2012). Současné plošné odumírání jasanů v ČR. CHKO Lužické hory, 14. 9. 2012, Jablonné v Podještědí. Havrdová L. (2012). Současné plošné odumírání jasanů v ČR. VLS, s. p., 13. 9. 2012, Valeč - vojenský újezd Hradiště Havrdová L. et Černý, K. (2012). Invaze Chalara fraxinea v CHKO Lužické hory předběžné výsledky výzkumu. Workshop MICROMYCO 11 12. 9. 2012, České Budějovice. V rámci tohoto cíle byla také na České zemědělské univerzitě v Praze, Fakultě lesnické a dřevařské v roce 2015 úspěšně obhájena bakalářská práce Tomáše Berana Vliv mikrostanovištních faktorů na distribuci a dopad nekrózy jasanu. Spolupráce na tématu pokračovala a Bc. Tomáš Beran bude na toto rozvinuté téma obhajovat v roce 2017 diplomovou práci Stanovištní faktory ovlivňující intenzitu poškození Fraxinus excelsior invazním patogenem Hymenoscyphus fraxineus v lokálním měřítku. 9

Výsledek V002 Populační analýza H. fraxineus (Ch. fraxinea) v ČR Cíl výsledku: Popis struktury populace patogenu na území ČR a její genetická variabilita. Zodpovědný řešitel: Ondřej Koukol Termín dosažení výsledku: 2014 Termín realizace výsledku: 2015 Plánovaná forma výsledku dle RIV: 1 Jimp Cílem výsledku bylo odhalit populační strukturu původce nekrózy jasanů na různých škálách v rámci celé ČR. Vzhledem k publikovaným zahraničním studiím (Bengtsson et al. 2012) v prvním roce řešení projektu, které odhalily obecně vysokou variabilitu kmenů na všech dosud studovaných lokalitách v Evropě, bylo následně požádáno a i schváleno pozměnění původního cíle výsledku (V002). Novým cílem bylo zaměření na zjištění konkrétních souvislostí mezi kmeny H. fraxineus kolonizujících např. řapíky a výhony, při použití metody založené na sledování mikrosatelitů v genomu H. fraxineus. K původně plánovanému cíli C002 byla provedena analýza DNA z herbářových položek z území ČR, což byla nadstavba cíle. Tato nadstavba cíle byla zvolena kvůli větší spolehlivosti při určování plodnic ve srovnání s klasickou morfologií. Cílem bylo zjistit, zda druh H. fraxineus nahrazuje původní druh H. albidus. Všechny cíle byly naplněny a výsledky byly publikovány ve třech článcích Jimp. Populační studie H. fraxineus V prvé řadě jsme pro prvotní testování metodiky populační studie provedli izolaci kmenů H. fraxineus na čtyřech lokalitách v Libereckém a Ústeckém kraji. Ze všech lokalit bylo izolováno po 20 kmenech H. fraxineus z 20 výhonů na různých stromech. Z kmenů byla extrahována DNA a metodou RAMS (ISSR) byly získány profily amplifikovaných úseků. PCR reakci a gelovou elektroforézu bylo nutno nejprve optimalizovat. Z pěti testovaných primerů se podařilo získat amplifikované úseky pouze ze čtyř, u gelové elektroforézy byla na základě kombinací různých agaróz a pufrů dosaženo dostatečné stability gelu. Každá reakce byla provedena dvakrát kvůli reproducibilitě výsledků. Na získaných profilech (Obr. 3) byly naskórovány proužky a v získané matici byly analyzovány podobnosti profilů na lokalitách pomocí metody PCoA (Principal Coordinates Analysis) v programu PAST (index similarity Dice). Jedna z lokalit se od ostatních tří lokalit výrazně odlišovala složením genotypů H. fraxineus, což zřejmě odpovídá největší geografické izolovanosti od ostatních lokalit. Obr. 3. Profil pro 20 kmenů H. fraxineus z jedné z lokalit. Amplifikace primerem ATG, 1,5 % TBE gel. 10

Metoda RAMS nedokázala spolehlivě odlišit jednotlivé haplotypy v rámci izolátů a proto jsme přistoupili k analýze mikrosatelitových markerů. Čtyři české populace H. fraxineus, u kterých byla na základě publikovaných celoevropských studií předpokládána velmi vysoká genotypová variabilita s minimální mezipopulační diferenciací, byly srovnány s populacemi ze Švýcarska (tj. oblasti s nedávnou invazí H. fraxineus) a Japonska (oblast původního výskytu). Pro srovnání byla použita sada mikrosatelitových primerů, z nichž některé byly testovány poprvé. Jedna z českých lokalit se od ostatních výrazně odlišovala a celkově byla genová diverzita českých populací nižší, než je evropský průměr. Výraznou genovou odlišnost jedné z lokalit přisuzujeme efektu zakladatele, který by mohl být způsoben nedostatkem vhodných stanovišť pro výskyt jasanu v okolí lokality. Celkově nízká genová diverzita může mít příčinu v lokálním omezení šíření spor. Jedním z možných důvodů by mohla být např. rychlejší infekce již přítomnými genotypy v hustších a nízkých porostech jasanu (Haňáčková et al. 2015). Rozšíření H. fraxineus a H. albidus Dále bylo sledováno rozšíření druhu H. fraxineus ve vztahu k výskytu příbuzného nepatogenního druhu H. albidus, který kolonizuje stejnou niku. Hymenoscyphus albidus je původním druhem v Evropě a naším cílem bylo potvrdit, nebo vyvrátit hypotézu, že šířící se druh H. fraxineus nahrazuje původní druh H. albidus na území ČR. Z území ČR bylo nalezeno jen několik publikovaných historických záznamů o výskytu H. albidus a jediné uložené sběry pocházely (celkem devět položek) z Herbáře Národního muzea v Praze. Při morfologickém a molekulárně genetickém studiu těchto položek pocházejících z let 1925 2011 se nám podařilo na základě morfologických znaků a úspěšně amplifikované oblasti ITS rdna z DNA izolované z plodnic potvrdit, že před rokem 2000 byl na našem území sbírán pouze druh H. albidus (Obr. 4). Obr. 4. Hymenoscyphus albidus PRM148993. Plodnice na řapíku, vřecka a askospory. Odlišuje se od velmi podobného druhu H. fraxineus jen absencí hákování na bázi vřecek (viz obr. vpravo nahoře), proto je vhodné kombinovat určení z plodnic i se sekvenčními daty. V rámci projektu byly prováděny sběry plodnic na jasanových řapících na celém území ČR ve všech typech porostu a ve všech nadmořských výškách. Zvláštní pozornost byla věnována lokalitám s výskytem jasanů v nadmořské výšce nad 900 m, protože zde dle údajů z Rakouska a Švýcarska pravděpodobně přežíval původní druh H. albidus (Queloz & al. 2011). Současně byly navštíveny i čtyři lokality s doloženým výskytem H. albidus (lokality z herbářových sběrů). 11

K identifikaci sbíraných plodnic jsme použili jak morfologické znaky, tak metodu genetického fingerprintu a sekvence ITS rdna. DNA byla extrahována ze tří náhodně vybraných plodnic na jedné lokalitě a následně byl po arbitrární PCR s primerem M13-core zjištěn profil amplifikovaných úseků na gelové elektroforéze. Jako kontrola byla přidána i DNA z kmene izolovaného z nekrózy (H. fraxineus) a z kultury H. albidus (získána z Institute of Forest Entomology, Vídeň, Rakousko). Většina vzorků měla identický či velmi podobný profil s DNA pocházející prokazatelně z H. fraxineus a odlišující se od H. albidus. Pouze u vzorků s unikátním odlišným profilem, u nějž nebylo možné jej jednoznačně přiřadit, jsme následně amplifikovali a sekvenovali úsek ITS rdna pro potvrzení identifikace. Tímto způsobem jsme výrazně redukovali počet sekvenčních reakcí a také zrychlili a zpřesnili identifikaci. Na více než 90-ti lokalitách jsme nalezli pouze plodnice druhu H. fraxineus, ale pro potvrzení hypotézy, že H. albidus skutečně už není na území ČR přítomen, jsme zvolili doplňkový přístup k odhalení případného skrytého výskytu a to metodou real-time PCR se specifickými primery pro H. albidus. DNA byla získána ze spor zachycených na lapačích na čtyřech lokalitách (tři na Moravě a jedna v Jižních Čechách). H. albidus byl zaznamenán pravidelně ve všech šesti odběrech během června až září 2014, byť v menších počtech kopií DNA ve srovnání s H. fraxineus. Na základě těchto výsledků jsme usoudili, že H. fraxineus nemá negativní vliv na výskyt druhu H. albidus, který je stále na území ČR přítomen, byť vzácně, a zjevně byl i v minulosti vzácný. Obr. 5. Historické nálezy H. albidus a současné nálezy H. fraxineus, C. fraxinophila a C. coronata v ČR. Vykřičníkem jsou označeny lokality s umístěním lapačů spor. Velikost kruhů odpovídá počtu odběrových míst v daném čtverci (o straně 11 km). Na některých lokalitách (Obr. 5) jsme překvapivě nalezli řapíky zcela nebo částečně bez plodnic H. fraxineus a místo nich další příbuzný druh z řádu Helotiales, Cyathicula fraxinophila. Opět na základě údajů na položkách z Herbáře Národního muzea jsme provedli odběr na lokalitách s historicky doloženým výskytem druhu C. fraxinophila a potvrdili jsme, že je zde stabilně přítomen a krom toho je možné ho najít i na dalších lokalitách. Dále jsme nalezli na několika lokalitách i plodnice druhu C. coronata, což dokazuje, že invaze H. fraxineus nemá negativní vliv na H. albidus ani na další příbuzné druhy (Koukol et al. 2016). 12

Souvislosti mezi kmeny H. fraxineus kolonizujících řapíky a výhony Po srovnání populační struktury na velkém měřítku jsme se rozhodli pro detailní charakteristiku populační struktury na řapících jednotlivých výhonů a odhalení infekční cesty do výhonů. Na konci léta 2014 proběhla terénní část pokusu, který měl odhalit množství haplotypů přecházejících z infikovaného řapíku do výhonu. Pro pokus byly vybrány čtyři liniové porosty jasanu v Českém Středohoří. Na každé lokalitě bylo na třech stromech označeno pět výhonů, které měly na listech příznaky infekce. Jednotlivé řapíky jsme k výhonu přivázali a označili kódem určujícím jejich pozici na výhonu. Celkově tedy bylo připraveno 60 výhonů dohromady s 471 řapíky. Po přirozeném opadu jsme zachycené řapíky odebrali a uložili do -80 C pro pozdější zpracování spolu s nekrotickými výhony. Před samotným pokusem byla optimalizována metodika izolace patogenu z nekrotických řapíků a také byla vyzkoušena možnost izolace patogenu po zmrazení řapíků a výhonů v -80 C. V listopadu 2014 a v lednu 2015 proběhl odběr označených výhonů. Po prohlídce výhonů a odhalení případné nekrózy byly z výhonů v místě listových jizev izolovány kmeny H. fraxineus. Viditelnou nekrózu mělo 25 výhonů (zpracováno 238 segmentů výhonů) z původně 60 připravených k pokusu. Úspěšná izolace z výhonů a současně z přiléhajících řapíků (Obr. 6) byla u 10 výhonů, celkem z nich bylo získáno 89 izolátů H. fraxineus. Z těchto výhonů byly označené řapíky přirozeně opadané v loňském roce rozděleny na fragmenty odpovídající jednotlivým listovým přeslenům a z nich byl rovněž izolován H. fraxineus. Poté byly všechny tyto fragmenty zamrazeny na -80 C pro pozdější extrakci DNA. Z fragmentů řapíků a z izolátů H. fraxineus v čistých kulturách byla následně extrahována DNA (zjednodušenou metodou pomocí NaOH, respektive kitem). Obr. 6. Příklad jednoho z odebraných výhonů a rekonstrukce původního umístění opadaných řapíků. V DNA extrahované z řapíků byly stanoveny haplotypy H. fraxineus na základě analýzy jedenácti mikrosatelitových lokusů. Touto metodou bylo možné odhalit prorůstání nebo současnou přítomnost více haplotypů H. fraxineus v jednom fragmentu. Analýza mikrosatelitů u kmenů v kultuře potvrdila, že tyto haplotypy byly skutečně přítomny v příslušných fragmentech řapíků. Celkově jsme odlišili 150 unikátních haplotypů, přičemž v jednom řapíku jsme detekovali až osm odlišných haplotypů a v souboru všech řapíků náležejících k jednomu výhonu až 27 haplotypů. Tyto haplotypy kolonizovaly většinou jen několik cm řapíku a v některých segmentech se překrývaly. Shodné haplotypy byly zaznamenány v rámci řapíků jednoho výhonu, z různých stromů jedné lokality i z různých lokalit. U žádného ze shodných haplotypů nebyla pravděpodobnost vzniku při různých reprodukčních událostech signifikantní. Opakované záznamy shodných haplotypů mohou být vysvětleny několika faktory. Nejvíce pravděpodobná je nedostatečná rozlišovací schopnost použitých mikrosatelitů. Dalšími možnostmi je infekce řapíků z jednoho zdroje (tj. jedno vřecko popřípadě apothecium), náhodný vznik stejných haplotypů při různých reprodukčních událostech nebo klonalita studovaného organismu. Poslední možnost se zdá méně pravděpodobná vzhledem k evidenci sexuálního rozmnožování H. fraxineus v mnoha studiích (Gross et al. 2014) a naopak nedostatečnému potvrzení klonality pomocí testů klíčivosti konidií. 13

Ve výhonech byl zaznamenán nejčastěji jediný haplotyp, který bylo možné ztotožnit s haplotypem v jednom z řapíků, ve fragmentu přiléhajícím k výhonu. Byly nalezeny ale i řapíky se dvěma a třemi haplotypy (Obr. 7) v nekróze výhonu a tudíž více potenciálními vstupními místy. V jednom případě haplotyp infikoval výhon přímo, tj. pravděpodobně přes lenticely. Statistická analýza neprokázala, že by úspěšný vstup konkrétního haplotypu do výhonu byl dán rozsahem kolonizovaného řapíku, ani kompeticí ze strany ostatních haplotypů. Z nesledovaných faktorů by mohla mít svou roli např. virulence jednotlivých haplotypů. Naše výsledky mimo jiné ukázaly i výrazný filtr v místě vstupu nákazy do výhonů a podobný filtr lze předpokládat i mezi jednotlivými lístky a řapíkem (Haňáčková et al. v řízení). GA GA+GB GB GO GM GD GC 4. GM GM+GO+GNGMGM GF+GE GE 3. GH GH GH+GI GUGM GK+GD GD 2. x x x x x GMGM GM GP+GQ 1. dvouleté dřevo GM Legenda GA x segment řapíku s genotypem H. fraxineus neúspěšná izolace nebo nepřítomnost H. fraxineus chybějící řapík v době sběru cesta hlavní infekce výhonu cesta druhé infekce výhonu třetí infekce výhonu Obr. 7. Kolonizační schéma výhonu A3_2 a jeho řapíků infikovaných haplotypy H. fraxineus. Vnější řady reprezentují řapíky a vnitřní sloupce výhon. Tento výhon má tři zdroje infekce, z nichž haplotypy GM and GO pravděpodobně vstoupily do výhonu skrze jeden řapík a haplotyp GU pravděpodobně pochází z přímé infekce výhonu. U haplotypu GM se také předpokládá, že mohl infikovat 1. pravý řapík. Výstupy RIV V002 Haňáčková Z., Koukol O., Čmoková A., Zahradník D., Havrdová L. (v řízení). Shoot colonization by Hymenoscyphus fraxineus is not dependent on the extent of petiole colonization and intraspecific competition. Forest Pathology. Koukol, O., Haňáčková, Z., Dvořák, M., Havrdová, L. (2015). Unseen, but still present in Czechia: Hymenoscyphus albidus detected by realt-time PCR, but not by intensive sampling. Mycological Progress 15(6), 1 9. Haňáčková Z., Koukol O., Havrdová L., Gross A. (2015). Local population structure of Hymenoscyphus fraxineus surveyed by an enlarged set of microsatellite markers. Forest Pathology, 45(55), 400 407. Jiné výstupy V002 Koukol, O., Haňáčková, Z., Čmoková, A., Fedusiv, L., Samek, M., Havrdová, L. (2015). Struktura populace Hymenoscyphus fraxineus na malé škále. 4. Česko-slovenská vědecká mykologická konference, Technická univerzita v Zvoleně, 7 9. 9. 2015, Zvolen. Abstrakty referátov a súhrn posterov, strana 25. Koukol O. & Havrdová L. (2014): Vřeckovýtrusá zkáza jasanů. Živa 1/2014, s. 7 10. 14

Výsledek V003 Citlivost H. fraxineus (Ch. fraxinea) vůči fungicidním přípravkům Cíl výsledku: Znalost citlivosti populace patogenu vůči fungicidním přípravkům registrovaným v ČR Zodpovědný řešitel: Markéta Hrabětová Termín dosažení výsledku: 2014 Termín realizace výsledku: 2014 Plánovaná forma výsledku dle RIV: 1 Jimp, 1 Jrec Cíl byl naplněn a výsledky byly publikovány v Jimp a Jrec a formou přednášek a posterů. Jedním ze způsobů ochrany zejména školkařského materiálu je bezesporu ochrana chemická. Pro cílené použití přípravků je nutné mít k dispozici informace o jejich účinnosti na konkrétní patogeny. Naším cílem proto bylo nalézt účinné přípravky, které by mohly být doporučeny pro použití v praxi. V první fázi byla testována účinnost fungicidních přípravků v in vitro podmínkách. Pro testování byly vybrány přípravky s unikátní účinnou látkou a zejména přípravky použitelné v lesním hospodářství. Celkem bylo otestováno 26 fungicidních přípravků, tři z testovaných přípravků byly vícesložkové, u těchto přípravků nebylo možné zjistit míru účinnosti jednotlivých složek, přehled přípravků je uveden v Tabulce 1, 2. Účinnost fungicidů byla hodnocena podle rychlosti růstu kolonií na Petriho miskách na médiu s přidanými fungicidy v porovnání s koloniemi na médiu bez fungicidů (Obr. 8). Na základě schopnosti inhibovat růst kolonií vyjádřených hodnotami EC 50, EC 90 a MIC byly fungicidy rozděleny do čtyř skupin vysoce účinné, účinné, slabě účinné a neúčinné (Tabulka 1). Jako vysoce účinné anebo účinné bylo klasifikováno dohromady 17 přípravků. Jednalo se o přípravky z chemických skupin: strobilurinové fungicidy, triazoly, dithiokarbamáty, guanidiny, anilinopyrimidiny a anorganické fungicidy. Také statistické zpracování přineslo podobné výsledky, viz Tabulka 2, nejúčinnější byly přípravky s účinnými látkami: azoxystrobin, bitertanol, captan (vícesložková varianta s trifloxystrobinem), kresoxim-methyl, spiroxamine (vícesložková forma s tebuconazolem a triadimenolem), tebuconazole, trifloxystrobin a difenoconazole. Fungicidy proti H. fraxineus v in vitro podmínkách testovali také v zahraničí (Dal Maso et al. 2014; Hauptman et al. 2015), ale s omezeným množstvím přípravků (6-8), proto bylo pouze několik přípravků shodných s námi testovanými. Výsledky ze studie Dal Maso et al. (2014) podporují i naše zjištění, že triazoly patří mezi nejúčinnější. In vitro testy umožňují otestovat širokou škálu přípravků nezávisle na výskytu přirozené infekce, bez velkých nároků na prostor a s nižší časovou náročností oproti testům na rostlinách. Tento typ testů přímo odráží citlivost patogena na daný přípravek za konkrétních podmínek. 15

Tab. 1. Testované přípravky, mechanismus účinku, nejvyšší doporučené aplikační koncentrace (Cmax) a výsledky in vitro testů vyjádřené hodnotami: EC 50, EC 90 (efektivní koncentrace potlačující růst patogena z 50% a 90%) a MIC (koncentrace, při níž již patogen neroste). Kategorie: H (vysoce účinné), E (účinné), L (slabě účinné) a I (neúčinné) Mechanismus účinku Chemická skupina Účinná látka Přípravek C max (µg a.i./ ml) EC50 (µg a.i./ml) EC90 (µg a.i./ml) MIC (µg a.i./ml) 10 dní 20 dní 10 dní 20 dní 10 dní 20 dní Kategorie Inhibitory respirace Strobiluriny azoxystrobin Ortiva 250 0.05 0.13 17.89 25.03 77.26 93.14 H kresoxim-methyl Discus 125 <0.01 <0.01 9.88 46.77 124.19 584.33 E trifloxystrobin Zato 50 WG 75 <0.01 <0.01 2.50 31.83 957.26 3867.37 E Inhibitory biosyntézy sterolu Triazoly bitertanol Baycor 25 WP 500 0.07 0.13 19.02 25.48 78.21 96.07 H difenoconazole Score 250 EC 50 0.03 0.01 15.32 13.10 70.58 72.21 E myclobutanil Talent 120 4.16 2.32 72.84 76.18 149.04 182.47 E penconazole Topas 100 EC 45 0.82 0.44 31.24 30.26 77.52 87.09 E tebuconazole Horizon 250 EW 250 0.01 0.04 14.40 18.16 82.16 81.53 H Hydroxyanilidy fenhexamid Teldor 500 SC 500 62.81 417.67 >10000 >100000 >100000 >100000 L Spiroketal-aminy spiroxamine (tebuconazole, triadimenol) Falcon 460 EC 250 0.14 0.10 16.67 15.91 55.53 57.23 H Vícebodové působení Ftalimidy captan Merpan 80 WG 1600 12.97 19.74 2660.12 3108.04 >10000 >10000 L captan (trifloxystrobin) Flint plus 1080 <0.01 0.05 6.82 23.20 103.69 107.99 H folpet Folpan 80 WG 1600 40.36 40.38 1460.55 3310.49 3582.30 9961.21 L Anorganické látky copper hydroxide Kocide 2000 1600 >100000 >100000 >100000 >100000 >100000 >100000 I copper oxychloride Kuprikol 50 5040 510.28 1036.00 >10000 >100000 >100000 >100000 L sulphur Kumulus WG 4000 4.34 9.19 522.59 861.75 1730.86 2681.81 H Dithiokarbamáty mancozeb Dithane DG Neotec 2250 6.59 6.00 684.16 497.60 2183.92 1501.49 H mancozeb (metalaxyl-m) Ridomil Gold MZ Pepite 1600 8.99 16.84 565.47 1492.50 1592.31 4579.70 E metiram Polyram WG 1400 7.30 9.08 421.75 494.61 1162.66 1343.74 H thiram Thiram Granuflo 2400 7.72 8.19 699.93 608.42 2160.02 1786.43 H Chinony dithianon Delan 700 WDG 700 17.44 21.66 1622.75 1935.99 5039.99 5952.45 L Transdukce signálu Ovlivnění syntézy lipidů Dikarboximidy iprodione Rovral aquaflo 750 2.66 15.88 116.98 1297.12 301.25 3899.64 L Karbamáty propamocarb Proplant 2888 3078.04 >10000 >100000 >100000 >100000 >100000 I Ovlivnění syntézy NK a proteinů Anilinopyrimidiny pyrimethanil Mythos 30 SC 750 6.49 7.79 512.33 747.67 1526.93 2340.03 E Neznámý Guanidiny dodine Syllit 65 WP 650 1.91 1.87 130.64 131.32 375.66 380.20 H Fosfonáty fosetyl-al Aliette 80 WG 2000 >100000 >100000 >100000 >100000 >100000 >100000 I 16

Obr. 8. Vliv fungicidů na růst kolonií (6 koncentrací účinné látky vlevo nejvyšší, vpravo nejnižší, dole dvě misky kontrolní) Tab. 2. Výsledek in vitro testů vyjádřený ve formě homogenních skupin (p < 0,05); relativní inhibice = procento inhibice po 20 dnech po odečtení vlivu použitelné koncentrace Účinná látka Relativní Homogenní skupina inhibice 20 dní (%) copper hydroxide 9.02 ǀ fosetyl-al 1.56 ǀ ǀ fenhexamid 11.97 ǀ ǀ propamocarb 20.44 ǀ ǀ ǀ copper oxychloride 20.89 ǀ ǀ folpet 25.11 ǀ ǀ ǀ dithianon 25.11 ǀ ǀ ǀ iprodione 28.08 ǀ ǀ ǀ ǀ myclobutanil 33.04 ǀ ǀ ǀ mancozeb (metalaxyl-m) 33.32 ǀ ǀ ǀ captan 33.75 ǀ ǀ ǀ pyrimethanil 34.84 ǀ ǀ ǀ metiram 36.71 ǀ ǀ ǀ ǀ penconazole 41.00 ǀ ǀ ǀ ǀ thiram 42.34 ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ mancozeb 44.90 ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ sulphur 45.47 ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ dodine 46.65 ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ difenoconazole 54.80 ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ azoxystrobin 59.04 ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ kresoxim-methyl 59.09 ǀ ǀ ǀ ǀ ǀ trifloxystrobin 61.25 ǀ ǀ ǀ ǀ spiroxamine (tebuconazole, 62.16 ǀ ǀ ǀ tebuconazole 63.15 ǀ ǀ ǀ bitertanol 64.08 ǀ ǀ captan (trifloxystrobin) 72.42 ǀ Z důvodu, že in vitro podmínky jsou umělé a účinnost v přirozených podmínkách nemusí vždy zcela odpovídat, druhou fází bylo ověření účinnosti vybraných přípravků na rostlinách přímo ve školkařských provozech. V průběhu tří let probíhaly pokusy na rostlinách v několika lesních školkách a to v Přerově nad Labem (Školky Montano s.r.o.), v Řečanech nad Labem (Lesoškolky s.r.o.), v Chřibské (Uniles a.s./wotan Forest a.s.), ve Valšově Dole (KATR a.s.) a ve Františkových Lázních (Lesoškolky s.r.o.). Celkem bylo otestováno 8 fungicidních přípravků: kresoxim-methyl (Discus), tebuconazole (Horizon 250 EW), azoxystrobin (Ortiva), difenoconazole (Score 250 EC), trifloxystrobin (Zato 50 WG), mancozeb (Dithane DG Neotec), pyrimethanil (Mythos 30 SC) a myclobutanil (Talent; viz Tabulka 3). 17

Tab. 3. Přehled přípravků použitých v in planta testech a použité koncentrace Přípravek Účinná látka (a.i.) Použitá koncentrace µg a.i./ ml Použitá koncentrace přípravku Ortiva azoxystrobin 250 0,1% Discus kresoxim-methyl 125 0,025% Zato 50 WG trifloxystrobin 75 0,015% Dithane DG Neotec mancozeb 2250 0,3% Score 250 EC difenoconazole 50 0,02% Talent myclobutanil 120 0,06% Horizon 250 EW tebuconazole 250 0,1% Mythos 30 SC pyrimethanil 750 0,25% Pokusy se v jednotlivých školkách a jednotlivých letech lišily v použitém rostlinném materiálu (prostokořenné-krytokořenné), rozvržením pokusných ploch, počtem použitých stromků, testovanými fungicidy a počtem ošetření porostů v průběhu sezóny. Ošetření stromků přípravky probíhalo v období od června do září, tedy v souladu s dosavadními znalostmi o době největšího infekčního tlaku patogena (Timmermann et al. 2011; Hietala et al. 2013; Chandelier et al. 2014). Pokusy byly vždy vyhodnoceny v březnu následujícího roku (Obr. 9), stromky byly pečlivě zkontrolovány, zda mají typické symptomy infekce (Gross et al. 2014; Kowalski et Holdenrieder 2009). A Obr. 9. Vyhodnocení pokusných ploch v lesní školce Valšův Důl - březen 2015. Vyzvednuté stromky, roztřízené na zdravé a symptomatické. A: Kontrolní plocha K2 (61,9% nemocných - vpravo); B: Plocha Z3 ošetřená přípravkem Horizon (13,9% nemocných - vpravo) B Zdárný průběh in planta testů je závislý na průběhu počasí a s tím související míře infekce v daném roce. V případě nízké míry infekce je obtížné dosáhnout průkazných výsledků. Výsledky vybraných pokusů z prvních dvou let jsou shrnuty v Tabulce 4. V prvním roce řešení bylo infikováno v průměru 38,4% stromků na kontrolních plochách. Nejúčinnější byl přípravek Horizon 250 EW, na plochách ošetřených tímto přípravkem bylo v průměru pouze 5,1% stromků symptomatických. V roce 2014 byla v porovnání s předchozím rokem vyšší míra infekce, v průměru 63,6% stromků na kontrolních plochách bylo symptomatických. Nejlepších výsledků bylo dosaženo s přípravkem Horizon 250 EW, stejně jako v předešlé sezóně. Na plochách ošetřených přípravkem Horizon bylo v průměru pouze 16,3% stromků nemocných. Dále následovali přípravky Zato 50 WG, Discus a Dithane DG Neotec s průměrným počtem nemocných stromků okolo 25%. Celkem byla v roce 2014 účinnost vůči H. fraxineus statisticky průkazná u čtyř fungicidů (p < 0,05; Obr. 10, Tab. 4). 18

Tab. 4. Výsledky Bonferroniho mnohonásobného porovnání (p < 0,05) vyjádřeno homogenními skupinami. Výsledky z let 2013 a 2014. Červeně statisticky průkazná účinnost Rok Fungicid Přípravek % nemocných Homogenní skupiny tebuconazole Horizon 250 EW 3.3 10.0 ǀ trifloxystrobin Zato 50 WG 3.3 25.0 ǀ ǀ kresoxim-methyl Discus 17.2-40.0 ǀ azoxystrobin Ortiva 16.7-43.3 ǀ difenoconazole Score 250 EC 35.7-41.4 ǀ control 26.7-53.3 ǀ tebuconazole Horizon 250 EW 9.5-25.0 ǀ trifloxystrobin Zato 50 WG 13.9-37.0 ǀ ǀ kresoxim-methyl Discus 15.7-33.5 ǀ ǀ mancozeb Dithane DG Neotec 22.6-33.1 ǀ ǀ myclobutanil Talent 27.7-64.7 ǀ ǀ pyrimethanil Mythos 30 SC 42.4-62.2 ǀ control 44.9-76.9 ǀ 2013 2014 80 70 60 % nemocných stromků 50 40 30 20 10 0 Horizon Zato Discus Dithane Talent Mythos Control přípravek Obr. 10. Účinnost in planta testovaných fungicidních přípravků v lesní školce KATR Valšův Důl Zjištěné účinné přípravky jsou z různých chemických skupin (triazoly, strobiluriny a dithiokarbamáty), díky tomu bude možné při ošetření přípravky střídat a předcházet tak vzniku rezistence, na což je potřeba dbát zejména v souvislosti se strobiluriny (Leadbeater, 2012). In planta pokusy v roce 2015 byly proto zaměřeny na otestování střídání přípravků s cílem navrhnout vhodné schéma postřiků. Byly testovány dvě schémata postřiků, varianta A: Discus, Horizon, Dithane, Discus, Horizon, Dithane a varianta B: Horizon, Dithane, Horizon, Zato, Dithane, Zato. Počet ošetřovaných stromků byl přibližně 3000 ks pro každou variantu a kontrolu. Přípravky byly aplikovány v termínech od počátku července do poloviny září. Pro každou pokusnou plochu byl zjišťován podíl napadených stromků (Tabulka 5). Podíl nemocných stromků se pohyboval v rozmezí 14,6 39,3 %. Zjištěná míra nové infekce byla ale velmi nízká, v kontrolních plochách se pohybovala v rozmezí 3,5 5,1 %. Na plochách ošetřovaných fungicidy bylo pouze 0 0,4 % stromků nově nemocných. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny, k porovnání intenzity výskytu infikovaných stromů u jednotlivých variant byl 19

použit Fisherův faktoriálový test. Rozdíl mezi variantou A a kontrolou a také mezi variantou B a kontrolou je vysoce významný (p < 0,01). Rozdíl mezi sloučenými variantami A a B a kontrolou je také vysoce významný (p < 0,01). Rozdíl mezi A a B je statisticky nevýznamný (p = 0.0985). Přesto, že výsledky byly statisticky průkazné, z důvodu velmi nízké míry infekce bylo rozhodnuto, že bude ještě jednou zopakován v následujícím roce 2016 i přes to, že bude vyhodnocen až po ukončení projektu (jaro 2017). Náklady s tím spojené nebudou nárokovány. Tab. 5. Výsledky in planta pokusu 2015/2016, Lesoškolky s. r. o., středisko Františkovy Lázně Pokusná plocha Zdravé stromky (ks) Nemocné celkem (ks) Nemocné celkem (%) Nemocné z předchozích let (ks) Nově infikované (ks) Nově infikované (%) Celkem (ks) A1 797 310 28.0 308 2 0.3 1107 A2 727 124 14.6 122 2 0.3 851 A3 836 236 22.0 233 3 0.4 1072 B1 795 160 16.8 160 0 0 955 B2 877 207 19.1 206 1 0.1 1084 B3 864 239 21.7 238 1 0.1 1103 Kontrola1 1008 188 15.7 151 37 3.5 1196 Kontrola2 844 254 23.1 209 45 5.1 1098 Kontrola3 478 309 39.3 290 19 3.8 787 Výsledky in vitro a také větší části in planta pokusů byly zpracovány do manuskriptu Hrabětová et al. (2016), jedná se o vůbec první studii zabývající se testováním účinnosti fungicidních přípravků proti patogenu H. fraxineus v podmínkách lesních školek a to i na mezinárodní úrovni. Studium účinnosti fungicidů proti tomuto patogenu je dosud v počátcích, v předchozích letech byly publikovány pouze dvě studie s touto tematikou. Hauptman et al. (2015) zkoušeli použití fungicidů pro sanaci opadu s cílem omezit množství spor ale pouze v in vitro podmínkách. Druhá studie (Dal Maso et al. 2014) se zabývala aplikací fungicidů formou injektáže. Aby bylo použití chemických přípravků co nejúčinnější, je nutné správné načasování postřiků. Jakmile stromky jasanů začnou na jaře olisťovat, je důležité sledovat průběh počasí a výskyt plodniček na opadu přímo pod pěstovanými stromky, ale i v okolních porostech. Vlhčí období s vyšším úhrnem srážek je předpokladem pro vývoj a dozrávání plodniček patogena. Mělo by být signálem pro zvýšení pozornosti a kontrolu výskytu plodniček. Jakmile se plodničky objeví, je vhodné ošetřit porosty nějakým preventivním fungicidem např. trifloxystrobinem nebo kresoxim-methylem. Pokud vlhké období přetrvává, je nutné ošetřovat porost každých 14 dnů. Z důvodu omezení vzniku rezistence je nutné střídat strobilurinové fungicidy s fungicidy z jiných chemických skupin. Jako druhý postřik v sezóně je vhodný mancozeb, pokud se ještě na listech neobjevily žádné symptomy. Pokud ale již na listech pozorujeme malé hnědé skvrnky nebo jsou napadené i větší plochy listů, je vhodnější použít tebuconazole, jelikož se jedná o fungicid jak s preventivní, tak i kurativní účinností. V suchých obdobích roku, pokud sucho přetrvává delší dobu, není aplikace fungicidů zcela nutná, jelikož plodničky patogena zaschnou a spory nemají vhodné podmínky k šíření. Vždy je ale nutné vzít v úvahu mikroklima dané oblasti. Počet potřebných ošetření je z velké míry závislý na průběhu počasí v daném roce. Výsledky z toho úkolu byly použity při tvorě metodiky (Černý et al. 2016, viz V008). 20

Výstupy RIV V003 Hrabětová, M., Černý, K., Zahradník, D., Havrdová, L. (2016). Efficacy of fungicides on the in vitro growth of Hymenoscyphus fraxineus and their potential control of ash dieback in the forest nurseries. Forest Pathology, doi 10.1111/efp.12311. Černý, K., Havrdová, L., Zlatník, V., Hrabětová, M. (2016). Pěstování jasanu v prostředí s výskytem Hymenoscyphus fraxineus. Certifikovaná metodika. Certifikace 30. 12. 2016 Mze (Osvědčení č. 73910/2016-MZE-16222/M140). VÚKOZ, v.v.i., Průhonice, 51 p. ISBN 978-80-87674-18-5, ISBN 978-80-88184-05-8. Dvořák, M., Humplíková, Z., Hejná, M., Havrdová, L., Fedusiv, L. (2013). Současné poznatky o nekróze jasanů a výzkum biologie jejího původce za účelem vývoje metod obrany. Zahradnictví 9/2013, p. 56 58. ISSN 1213-7596. Jiné výstupy V003 Hrabětová M., Havrdová L., Zahradník D., Černý K. (2015): Effect of different fungicides on Hymenoscyphus fraxineus (Ch. fraxinea) and their potential for control of ash dieback in forest nurseries. XX česká a slovenská konference o ochraně rostlin, Česká zemědělská univerzita v Praze, 1 3. 9. 2015, Praha. Hrabětová, M., Havrdová, L. Černý, K. (2015): Evaluation of fungicides for control of ash dieback in forest nurseries. IUFRO 7.02.02 & 7.03.04 working party meeting, 7-12 June, 2015 in Uppsala, Sweden, Book of abstracts, SLU, p. 29. Hejná, M., Havrdová, L., Černý, K. (2014). Effect of different fungicides on Chalara fraxinea and their potential for control of ash dieback. Workshop Micromyco 2014, 17 18. 9. 2014, Praha. Hejná, M., Havrdová, L., Černý, K. (2014). Effect of different fungicides on Chalara fraxinea and their potential for control of ash dieback. 11th Conference of the European Foundation for Plant Pathology: Healthy plant healthly people, 8 13 September 2014, Kraków, Poland. Hejná, M., Havrdová, L., Fedusiv, L., Černý, K. (2013). The influence of selected fungicides on in vitro growth of Chalara fraxinea isolates. 4th 6th September 2013, Malmö, Sweden, Abstracts of Posters p. 28 29. Hejná. M., Havrdová. L., Fedusiv. L., Černý. K. (2013). Efficacy of some selected fungicides on the in vitro growth of Chalara fraxinea causing ash dieback na konferenci IUFRO 2013 WP 7.02.02. Foliage, shoot and stem diseases, May 20th - 25th 2013, Brno and Černá Hora, Czech Republic, Book of Abstracts p. 111. Hejná, M., Havrdová, L., Fedusiv, L., Černý, K. (2013). Citlivost patogenu Chalara fraxinea vůči fungicidním přípravkům v in vitro podmínkách. Škodliví činitelé v lesích Česka 2012/2013, 11. 4. 2013, Průhonice. 21

Výsledek V004 Mykoflóra endofytů jasanů Cíl výsledku: Stanovit diverzitu kultivovatelných endofytických hub v letorostech jasanu s ohledem na výskyt H. fraxineus. Použít získané izoláty hub k antagonistickým pokusům proti H. fraxineus. Zodpovědný řešitel: Zuzana Haňáčková Termín dosažení výsledku: 2015 Termín realizace výsledku: 2015 Plánovaná forma výsledku dle RIV: 1 Jimp Cíle byly naplněny; výsledky byly publikovány ve článku Jimp a prezentovány na řadě mezinárodních odborných konferencí. Vybrané izoláty byly použity k antagonistickým testům. Pro odběr vzorků jasanových výhonů pro studium asociované mykobioty byly vybrány dvě lokality lišící se nadmořskou výškou (horská vs. střední poloha). Na těchto lokalitách, které jsou obě dlouhou dobu vystaveny infekčnímu tlaku, byly vybrány tři dvojice přibližně 60-ti letých jasanů. Vybraní jedinci byli vystaveni stejným klimatickým a geomorfologickým podmínkám, rostli vedle sebe, nebo v těsné blízkosti. Jeden z dvojice byl viditelně poškozen H. fraxineus (defoliace koruny 30-50%) a druhý byl relativně resistentní (defoliace koruny do 10%). Z každého stromu bylo odebráno osm zdravých jednoletých výhonů přibližně ve výšce 6m. Odběry byly provedeny v červenci 2012 a únoru 2013. V laboratoři byly vodou omyté výhony rozděleny na kůru a dřevní část a z těchto částí byly připraveny segmenty o velikosti cca 5 3-4 mm. Po povrchové sterilizaci (dle typu vzorku kombinací ethanolu a chlornanu sodného) byly kousky kůry a dřeva z jednoho výhonu umístěny na Petriho misku se sladinovým agarem. Takto upravené vzorky byly inkubovány při 20 C v termostatu po dobu 4-6 týdnů (dle sezóny). Kolonie vyrostlé z kousků dřeva a kůry byly rozčleněny do morfotypů podle fenotypových znaků a byla zaznamenána jejich četnost výskytu. Identifikace morfotypů probíhala na základě porovnání shody morfologických a molekulárních znaků. Pro sekvenování DNA byla používána oblast ITS rdna, u problematicky určitelných druhů také oblast LSU rdna nebo TEF-1α.. Na 1920 fragmentech jasanových výhonů bylo celkově zaznamenáno 884 kolonií hub, které byly rozděleny do 58 taxonů. Tyto druhy byly roztříděny do ekologických skupin (patogeni, saprotrofové, druhy s obojí strategií, Tab. 6) dle dostupných informací z literatury. Nejčastěji zaznamenanými druhy v letním období (viz Tab. 7) byl blíže neurčený druh kvasinky (21%), Aureobasidium pullulans (19%) a Phoma macrostoma var. incolorata (10%), zatímco druhy Dothideomycetes sp. 1 (20%), Diaporthe sp. 2 (13%) a Lophiostoma sp. (12%) dominovaly v zimním období (Tab. 7) Tab. 6. Druhové bohatství endofytů v závislosti na sezóně a zařazení do ekologické skupiny (druhy s neznámou ekologickou strategií nezařazeny) Léto Zima Ecologická skupina hub počet kolonií počet druhů počet kolonií počet druhů saprotrofové 149 16 167 13 patogeni 5 2 41 7 obě strategie 105 10 55 8 22

Druhová diverzita byla vyšší v zimním odběru, Shannonův index diverzity nabýval signifikantně vyšší hodnoty (p < 0.001). Bez ohledu na zdravotní stav stromů, převažovaly saprotrofové v létě a parazité v zimě, viz Tab 6. Sezónní změny byly signifikantní pro 23 zjištěných druhů. Počet druhů byl celkově vyšší ve výhonech resistentních stromů než v citlivých (32 a 26 resp.), přitom počet kolonií hub byl u obou skupin stejný. Statisticky významná byla vyšší přítomnost druhu Diaporthe sp. 2 na citlivých stromech (druh zaznamenán pouze v zimním období). Podobně, ačkoliv nesignifikantně, byl také druh Diaporthe sp. 1 (zaznamenaný pouze v letním období) přítomen ve vyšší míře na citlivých. Celkově se však společenstva hub mezi citlivými a resistentními stromy významně nelišila (Tabulka 7; Haňáčková et al. 2017). Stromy citlivé k poškození H. fraxineus pravděpodobně umožňují větší expanzi i dalších patogenů, jak je vidět na příkladu rodu Diaporthe. Druhy rodu Diaporthe (s anamorfou Phomopsis) jsou častými patogeny rostlin (Tan et al. 2013) a při zhoršeném zdravotním stavu stromu se mohou více prosadit v rostlinném pletivu (př. P. oblonga na jilmech, Webber a Gibbs 1984). Zároveň však není možné vyloučit, že zdravotní stav citlivých stromů byl zhoršený již před invazí H. fraxineus a zvýšená kolonizace původními patogenními druhy by tak byla preindikátorem náchylnosti. Tab. 7. Druhové složení endofytů jasanových výhonů letního a zimního odběru (uvedeno v %) Order Fungal taxa Ecology Pleosporales Summer (all ) Summer (susceptible resistant) Winter (all) Winter (susceptible resistant) Alternaria alternata ps 1.83 (1.52 2.16) 1.99 (2.04 1.95) Coniothyrium sp.* ps (- -) 0.8 (1.63 -) Dendrothyrium sp. p (- -) 1.39 (- 2.72) Lophiostoma corticola* s 1.31 (2.03 0.54) 6.18 (6.12 6.23) Lophiostoma sp.* s (- -) 12.35 (15.5 9.34) Phoma macrostoma* ps 4.97 (5.08 4.86) (- -) Phoma macrostoma var. ps 10.21 (8.12 12.43) 2.79 (2.86 2.72) incolorata* Phoma sp. s 0.79 (0.51 1.08) 1.59 (- 3.11) Pleospora herbarum ps 0.26 (- 0.54) (- -) Pleosporales sp. 1*? 4.45 (2.54 6.49) 0.4 (- 0.78) Pleosporales sp. 2 s 0.79 (0.51 1.08) (- -) Pleosporales sp. 3*? (- -) 8.76 (6.94 10.5) Pyrenochaeta corni ps 1.83 (1.02 2.7) 1.39 (0.82 1.95) Dothideales Aureobasidium pullulans* s 19.11 (20.81 17.3) 5.98 (4.9 7) Capnodiales Cladosporium sp.*? 2.88 (2.54 3.24) (- -) incertae sedis Dothideomycetes sp. 1*? 0.79 (1.02 0.54) 20.32 (22.0 18.6) Dothideomycetes sp. 2? 0.52 (1.02 -) (- -) Dothideomycetes sp. 3 s (- -) 0.2 (0.41 -) Dothideomycetes sp. 4? (- -) 0.2 (- 0.39) All Dothideomycetes 49.74 (46.72 52.96) 64.34 (63.27 65.38) 23

Order Fungal taxa Ecology Xylariales Summer (all) Summer (susceptible resistant) Winter (all) Winter (susceptible resistant) Annulohypoxylon cohaerens s 0.26 (0.51 -) 0.2 (- 0.39) Annulohypoxylon multiforme s 0.26 (0.51 -) 1 (0.41 1.56) Anthostomella pinea ps 2.88 (1.02 4.86) 1.99 (1.63 2.33) Lopadostoma turgidum s (- -) 0.2 (0.41 -) Nemania serpens s 0.26 (0.51 -) (- -) Xylaria longipes s 0.26 (0.51 -) (- -) Xylariales sp. 1*? (- -) 0.8 (0.82 0.78) Xylariales sp. 2? (- -) 0.2 (0.41 -) Diaporthales Apiognomonia errabunda p (- -) 0.2 (- 0.39) Cryptodiaporthe hystrix ps (- -) 0.6 (0.82 0.39) Diaporthe sp. 1*? 4.97 (6.6 3.24) (- -) Diaporthe sp. 2*? (- -) 13.35 (17.5 9.34) Prosthecium platanoidis* p (- -) 2.79 (2.04 3.5) Prosthecium pyriforme p 0.26 (0.51 -) (- -) Valsa sp.* p 1.5 (0.51 1.62) (- -) Hypocreales Gibberella avenacea ps 1.83 (2.54 1.08) 1 (- 1.95) Gibberella baccata* ps 3.14 (3.05 3.24) 0.4 (- 0.78) Sordariales Chaetomium globosum* s 1.5 (1.52 0.54) (- -) Sordaria fimicola s 0.79 (1.02 0.54) (- -) Coniochaetales Coniochaeta sp. ps 0.26 (- 0.54) (- -) incertae sedis Sordariomycetes sp. 1? 0.26 (- 0.54) (- -) Sordariomycetes sp. 2? (- -) 1 (0.41 1.56) Sordariomycetes sp. 3? (- -) 0.4 (0.82 -) All Sordariomycetes 17.54 (18.81 16.2) 24.1 (25.32 22.97) Helotiales incertae sedis Botrytis cinerea ps 0.52 (0.51 0.54) (- -) Bulgaria inquinans s 0.79 (1.02 0.54) (- -) Helotiales sp.* s (- -) 4.58 (4.49 4.67) Pezicula sporulosa p (- -) 1 (2.04 -) Phialocephala sp. s (- -) 0.4 (0.41 0.39) Leotiomycetes sp. 1*? (- -) 1 (1.22 0.78) Leotiomycetes sp. 2? (- -) 0.2 (- 0.39) All Leotiomycetes 1.31 (1.53 1.08) 7.17 (8.16 6.23) Eurotiales Aspergillus pseudoglaucus s 1.57 (2.03 1.08) (- -) Aspergillus versicolor s 0.52 (- 1.08) 0.2 (- 0.39) Penicillium citrinum* s 2.88 (4.06 1.62) (- -) Chaetothyriales Phaeomoniella sp.* p (- -) 2.79 (2.04 3.5) All Eurotiomycetes 4.97 (6.09 3.78) 2.99 (2.04 3.89) Polyporales Bjerkandera adusta s (- -) 0.2 (- 0.39) Agaricales Coprinellus disseminatus s (- -) 0.2 (- 0.39) All Agaricomycetes (- -) 0.4 (- 0.78) Sporidiobolales Rhodotorula mucilaginosa* s 4.97 (7.11 2.7) (- -) All Microbotryomycetes 4.97 (7.11 2.7) (- -) Pezizales Desmazierella acicola s 0.26 (- 0.54) (- -) All Pezizomycetes 0.26 (- 0.54) (- -) incertae sedis unidentified yeast*? 21.2 (19.8 22.7) 1 (1.22 0.78) All incertae sedis 21.2 (19.8 22.7) 1 (1.22 0.78) 24

Výstupy RIV V004 Haňáčková, Z., Havrdová, L., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (2017). Fungal endophytes in ash shoots diversity and inhibition of Hymenoscyphus fraxineus. Baltic Forestry, Special issue: Susceptibility of European Tree Species to Alien Invasive Pests, přijato. Jiné výstupy V004 Haňáčková, Z., Havrdová, L., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (2016): Endofytické houby jasanových výhonů diverzita a inhibice druhu Hymenoscyphus fraxineus. Workshop Micromyco, 30 31. 8. 2016, AV ČR Krč, Praha. Haňáčková, Z., Havrdová, L., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (2016). Fungal endophytes in ash shoots diversity and inhibition of Hymenoscyphus fraxineus. COST FRAXBACK (FP 1103) Final Conference, March 29 th April 1 st 2016, Jurmala/Riga, Latvia. Haňáčková, Z., Havrdová, L., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (2016). Fungal endophytes in ash shoots diversity and inhibition of Hymenoscyphus fraxineus. COST FRAXBACK (FP 1103) Final Publication, March 2nd 3rd, Saffron/Bratislava, Slovakia. Haňáčková, Z., Koukol, O., Havrdová, L. (2015). Endophytic fungi in Fraxinus excelsior shoots and their antagonistic activities against Hymenoscyphus fraxineus. COST 7th MC Meeting & Workshop, 12 16th of April 2015, in Cavtat, Croatia. Program and Abstracts, p. 14. Haňáčková, Z., Havrdová, L., Koukol, O., Fedusiv, L., Černý, K. (2014). Diversity of fungal community in Fraxinus excelsior shoots with respect to level of ash dieback and season. Micromyco 2014, 17 18. 9. 2014, Praha. Kolářová, Z., Havrdová, L., Koukol, O., Fedusiv, L., Černý, K. (2013). Endophytic community in shoots of Fraxinus excelsior and its competitive potential against Chalara fraxinea.; na konferenci IUFRO 2013 WP 7.02.02. Foliage, shoot and stem diseases, May 20th - 25th 2013, Brno and Černá Hora, Czech Republic, Book of Abstracts p. 97. Kolářová, Z., Havrdová, L., Koukol, O., Fedusiv, L., Černý, K. (2013). Endophytic community in shoots of Fraxinus excelsior and its competitive potential against Chalara fraxinea.; 3 Česko-slovenské mykologické konferenci v Olomouci, 29-31. 8. 2013, Mykologické Listy 125, p. 48 Kolářová, Z., Havrdová, L., Koukol, O., Fedusiv, L., Černý, K. (2013). Endophytic community in shoots of Fraxinus excelsior and its competitive potential against Chalara fraxinea.; COST FRAXBACK, 4th 6th September, 2013, Malmö, Sweden, Abstracts of Posters p. 28. 25

Výsledek V005 Biologický přípravek využitelný proti H. fraxineus (Ch. fraxinea) Cíl výsledku: Provedení in vitro testů u vybraných druhů a kmenů hub, které potlačují růst, anebo sporulaci druhu H. fraxineus a budou využitelné pro biologický přípravek k ošetření před vstupem H. fraxineus do hostitelské rostliny. V případě úspěšného potlačení rozvoje patogenu budou provedeny testy in planta na sazenicích jasanu, kdy v případě úspěchu (průkazného snížení rozvoje patogenu na jasanu), bude výsledek uplatněn jako patent. Zodpovědný řešitel: Zuzana Haňáčková Termín dosažení výsledku: 2016 Termín realizace výsledku: 2018 Plánovaná forma výsledku dle RIV: 1 Jimp, 1 P První dílčí část cíle (in vitro pokusy) byla dokončena, výsledek byl publikován v Jimp a prezentován na řadě mezinárodních odborných konferencí. Druhá dílčí část cíle (in planta pokusy) byla dokončena, nyní probíhá její vyhodnocení a po zpracování dat budou výsledky publikovány. Výsledek 1 P byl v souladu s vyjádřením poskytovatele nahrazen (viz níže). Pro vývoj biologického prostředku proti H. fraxineus byly testovány antagonistické reakce endofytů izolovaných z jasanových výhonů. Schopnost endofytů potlačovat růst H. fraxineus in vitro byla vyhodnocena na základě porovnání jejich inhibičního efektu v párových testech. Jako vhodné médium byl vybrán agar s výluhem z jasanových výhonů, do kterého byla přidána mikrokrystalická celulóza jako zdroj uhlíku. Projevy antagonismu na tomto médiu nebyly tak markantní, ale médium lépe simuluje podmínky in vivo. Antagonistické pokusy byly provedeny u dvou kmenů H. fraxineus s 31 endofyty z letního odběru a 18 endofyty z odběru zimního (Obr. 11). Každé párování bylo opakováno třikrát. Jako kontrolní varianta bylo použito párování s čistým agarovým diskem a také párování se stejným kmenem H. fraxineus. Růst patogenu byl měřen směrem k antagonistovi na spojnici obou kolonií, a ve 45 pod a nad spojnici. Změny růstu byly zaznamenány po 14 a 28 dnech. Obr. 11. Příklad silné (vlevo) a slabé inhibice (vpravo) druhu H. fraxineus při párovacím testu s druhy Alternaria alternata (vlevo) a Aureobasidium pullulans (vpravo) 26

Jelikož se rozptyly růstu obou izolátů H. fraxineus nelišily, byla data sloučena a dále posuzována dohromady. Průměrný růst kolonií izolátů H. fraxineus (růst = součet růstu ve třech směrech) v přítomnosti endofytů byl převeden na relativní škálu (1 = maximum růstu kolonie H. fraxineus bez jakékoliv houby, 0 = H. fraxineus neroste), následně byla vypočítána míra inhibice endofyta a rozdílnost výsledných hodnot byla statisticky testována pomocí analýzy variance a Tukeyho mnohonásobného porovnání průměru. Když byly výsledky pro oba použité kmeny H. fraxineus zkombinovány, 36 endofytů signifikantně inhibovalo růst H. fraxineus (v porovnání s kontrolou). Tato míra inhibice se pohybovala od 42 do 83%. Při porovnání výsledků s variantou vlastní inhibice pouze 17 endofytů mělo signifikantně vyšší inhibiční vliv než patogen sám na sebe. Největšího inhibičního efektu dosáhly druhy Botrytis cinerea, Phoma macrostoma var. incolorata 2, Alternaria alternata, Bjerkandera adusta, Gibberella avenacea, Apiognomonia errabunda a Chaetomium globosum (Obr. 12). Mezi druhy s nejlepšími inhibičními účinky patřili rychle rostoucí druhy s vyšší četností v letní sezóně. Ty by tak mohly mít v létě synergistický efekt proti H. fraxineus nebo by mohly využít oslabené pletivo pro přechod do patogenní formy, která by původní nekrózu předešla. Dá se předpokládat, že proti původním patogenům by se pak strom dokázal efektivněji bránit. Na druhou stranu i H. fraxineus je silně kompetiční a výsledné interakce budou mít spíše neutrální efekt. Naopak, v zimním období, kdy začínají být viditelné první čerstvé nekrózy s H. fraxineus, může být pro patogena nedostatek některých letních druhů výhodou (Haňáčková et al. 2017). Obr. 12. Průměrná inhibice růstu H. fraxineus způsobená endofyty izolovanými ze zdravých jasanových výhonů (mimo Biatriospora sp., zdroj CCF). K testování vlastní inhibice byl použit stejný kmen H. fraxineus (=selfinhibition) a jako kontrolní varianta párování s agarovým diskem (=control). 27

V roce 2015 se dále uskutečnil antagonistický pokus in planta inokulací endofytů a H. fraxineus přímo do semenáčků jasanu. Semenáčky byly 2,5 let staré o výšce cca 11 20 cm. Pokus probíhal v klimatizovaném boxu s umělým osvětlením na 590 rostlinách. Na základě průměrného pořadí inhibičního účinku endofytů v in vitro pokusech a dostupných informacích o jednotlivých druzích bylo pro antagonistické pokusy in planta vybráno osm druhů hub: Sordariomycetes sp. 2, Sordaria fimicola, Phoma macrostoma var. incolorata, Aureobasidium pullulans, Biatriospora sp., Anthostomella pinea, Chaetomium globosum a Phoma macrostoma. Anthostomella pinea byla do pokusu zařazena jako negativní kontrola. Semenáčky byly vysazeny do quickpotů se sterilní půdou po 10 ks, každý druh v šesti opakováních. Pro 5 různých variant kontrol bylo celkem vysazeno 150 ks semenáčků. Po 60 dnech aklimatizace byly do kmenové části, cca 2 cm od krčku stromků, vloženy jasanové štěpiny porostlé endofytem. Po dalších 60 dnech byla cca 2 cm nad inokulací štěpinky s endofytem vložena jasanová štěpina porostlá kolonií H. fraxineus. Jako kontrola bylo zvoleno několik kombinací variant, kdy byl endofyt nebo patogen nahrazen sterilní jasanovou štěpinkou nebo nebyl proveden žádný zásah do rostlinných pletiv. Pokus byl po dalších 60 dnech ukončen a částečně vyhodnocen. Nejdůležitějším znakem pro vyhodnocení byla délka nekrózy a vitalita semenáčků. Pro velké množství pokusných semenáčků nebylo možné všechny rostliny vyhodnotit jednorázově. Proto byly všechny rostliny sklizeny ve stejném období a ty, které se nepodařilo ihned zpracovat, byly uloženy v -80 ºC. Reizolace endofytů i H. fraxineus proběhly ve stejné době jako vyhodnocení. Podle předběžných výsledků byla nejúspěšnější reizolace endofytů u druhů Sordaria fimicola a Chaetomium globosum. Reizolace H. fraxineus byla nejúspěšnější u semenáčků s endofyty Phoma macrostoma var. incolorata, kontrola 5, Anthostomella pinea a Chaetomium globosum. V roce 2016 byl dokončen sběr dat z in planta pokusu, jejich digitalizace a úprava a nyní probíhá jejich vyhodnocení. Publikace výsledků in planta pokusů je plánovaná v následujícím období. Výstupy RIV Haňáčková Z., Havrdová L., Černý K., Zahradník D., Koukol O. (2017). Fungal endophytes in ash shoots diversity and inhibition of Hymenoscyphus fraxineus. Baltic Forestry, Special issue: Susceptibility of European Tree Species to Alien Invasive Pests, přijato. Výsledek 1 P nebyl splněn, jelikož do současné doby nebyl nalezen takový druh endofytu, který by úspěšně potlačoval rozvoj patogenu, dle vyjádření poskytovatele č. j. 37650/2016-MZE- 14152 ze dne 23. 6. 2016 nahrazen výstupem: Haňáčková, Z., Koukol, O., Čmoková, A., Zahradník, D., Havrdová, L. (v řízení). Shoot colonization by Hymenoscyphus fraxineus is not dependent on the extent of petiole colonization and intraspecific competition. Forest Pathology (Q2); viz V002. Jiné výstupy Haňáčková, Z., Havrdová, L., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (2016): Endofytické houby jasanových výhonů diverzita a inhibice druhu Hymenoscyphus fraxineus. Workshop Micromyco, 30 31. 8. 2016, AV ČR Krč, Praha. Haňáčková, Z., Havrdová, L., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (2016). Fungal endophytes in ash shoots diversity and inhibition of Hymenoscyphus fraxineus. COST FRAXBACK (FP 1103) Final Conference, March 29 th April 1 st 2016, Jurmala/Riga, Latvia. 28

Haňáčková, Z., Havrdová, L., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (2016). Fungal endophytes in ash shoots diversity and inhibition of Hymenoscyphus fraxineus. COST FRAXBACK (FP 1103) Final Publication, March 2nd 3rd, Saffron/Bratislava, Slovakia. Haňáčková, Z., Koukol, O., Havrdová, L. (2015). Endophytic fungi in Fraxinus excelsior shoots and their antagonistic activities against Hymenoscyphus fraxineus. COST 7th MC Meeting & Workshop, 12 16th of April 2015, in Cavtat, Croatia. Program and Abstracts, p. 14. Haňáčková, Z., Havrdová, L., Koukol, O., Fedusiv, L., Černý, K. (2014). Diversity of fungal community in Fraxinus excelsior shoots with respect to level of ash dieback and season. Micromyco 2014, 17 18. 9. 2014, Praha. Kolářová, Z., Havrdová, L., Koukol, O., Fedusiv, L., Černý, K. (2013). Endophytic community in shoots of Fraxinus excelsior and its competitive potential against Chalara fraxinea.; na konferenci IUFRO 2013 WP 7.02.02. Foliage, shoot and stem diseases, May 20th - 25th 2013, Brno and Černá Hora, Czech Republic, Book of Abstracts p. 97. Kolářová, Z., Havrdová, L., Koukol, O., Fedusiv, L., Černý, K. (2013). Endophytic community in shoots of Fraxinus excelsior and its competitive potential against Chalara fraxinea.; 3 Česko-slovenské mykologické konferenci v Olomouci, 29-31. 8. 2013, Mykologické Listy 125, p. 48 Kolářová, Z., Havrdová, L., Koukol, O., Fedusiv, L., Černý, K. (2013). Endophytic community in shoots of Fraxinus excelsior and its competitive potential against Chalara fraxinea.; COST FRAXBACK, 4th 6th September, 2013, Malmö, Sweden, Abstracts of Posters p. 28. 29

Výsledek V006 Biologie a etiologie choroby Cíl výsledku: Shrnutí, doplnění a ověření znalosti ohledně rozvoje choroby, symptomů, šíření, přežívání v prostředí školek a lesních kultur, fenologie patogenu. Zodpovědný řešitel: Miloň Dvořák Termín dosažení výsledku: 2016 Termín realizace výsledku: 2016 Plánovaná forma výsledku dle RIV: 1 Jrec Cíl byl splněn, výsledky z výskytu vzdušného inokula byly publikovány v Jimp a Jrec publikacích, výsledky byly také prezentovány na mezinárodních odborných konferencích. V rámci studia biologie patogenu H. fraxineus jsme se zaměřili na sezónní výskyt vzdušného inokula (askospor, popr. konidií). Přítomnost inokula (především askospor) ve vzduchu porostu s náchylnými jasany je klíčový předpoklad ke vzniku infekce a rozvoji nekrózy jasanu. Proto je nezbytné získat co nejvíce informací o zákonitostech šíření tohoto inokula, jeho závislosti na průběhu počasí a výskytu během roku, abychom dokázali časově optimalizovat případné použití metod obrany proti tomuto patogenu. Metody obrany, případně i ochrany, mohou být různé a jsou předmětem výzkumu ostatních aktivit tohoto projektu. Jde především o aplikaci chemických přípravků, biologických přípravků a lesotechnických opatření. Abychom získali co možná nejobecnější informaci o sezónnosti výskytu inokula a jeho závislosti na počasí, rozhodli jsme se nepřetržitě sledovat výskyt inokula během vegetačního období od samého začátku projektu v roce 2012 až do předposledního roku jeho řešení v roce 2015, a to na co nejrůznějších lokalitách v ČR. V prvním roce řešení se jednalo především o odzkoušení a optimalizaci techniky lapáni spor a meteorologického měření. Zároveň už v prvním roce vznikla poptávka po těchto datech v rámci řešení jiného tématu tohoto projektu testování chemických prostředků, kdy bylo potřeba alespoň přibližně správně experiment načasovat. V tomto prvním roce řešení probíhal odchyt spor pouze na jedné lokalitě. V druhém, třetím i čtvrtém roce se rozšířil na lokality čtyři, přičemž některé z nich se v průběhu let obměňovaly. Také metodika lapaní spor a jejich kvantifikace se v průběhu let řešení měnila. Systém odchytu spor zůstal stejný, ale vzhledem k postupujícímu poznání o nekróze jasanu a jejím původci bylo nutné přejít z manuálního sčítání spor pomocí mikroskopu ke kvantifikaci na bázi detekce specifické DNA pomocí real-time PCR. Alternativně byl také odzkoušen systém levných rotačních lapačů pro rychlou a intenzivní detekci inokula ve vzduchu, opět spojeny s kvantifikací pomocí molekulárně-biologických metod. Závěrečný rok 2016 už polní pokusy neprobíhaly, práce byly zaměřené na dokončení zpracování vzorků a vyhodnocování dat. Lokality odchytu spor 1. Hackerova školka na území Školního lesního podniku Masarykův les Křtiny, GPS: 49 19'23.962"N, 16 44'39.419"E, 470 m n. m. Jde o zapojený smíšený porost v údolí Křtinského potoka s jednotlivými jasany s jasnými příznaky nekrózy. Lapač byl umístěn 5 m od paty kmene asi 20letého jasanu ztepilého s jasnými příznaky infekce nekrózou jasanu už v předchozích letech. Lapač byl napájen autoakumulátory a solárními panely. Lapání probíhalo v letech 2012-2015. 30

2. Vranovice jsou součástí LZ Židlochovice, GPS: 48 56'39.857"N, 16 36'8.842"E, 170 m n. m. Plocha se nachází uvnitř rozlehlého jasanového porostu na lužním stanovišti, který je téměř kompletně napaden nekrózou jasanu. Lapač byl napájen autoakumulátorem a solárním panelem. Odchyt spor probíhal v letech 2013 2015. 3. Hlincova Hora se nachází na okraji Českých Budějovic, jedná se o městskou zeleň, GPS: 48 58'35.610"N, 14 30'42.228"E, 407 m n. m. Zdrojem spor byly dva vzrostlé jasany s mírným napadením nekrózou jasanu, lapač byl umístěn 10 m od paty kmene a napájen z elektrické sítě. Odchyt spor probíhal v roce 2013. 4. Líska je lokalita umístěná na okraji vsi v Lužických horách, GPS: 50 49'38.185"N, 14 27'43.283"E, 568 m n. m. Jedná se o liniovou výsadbu vzrostlých jasanů podél nezpevněné cesty v mírném svahu, které jsou citelně napadeny nekrózou. Lapač byl instalován 10 m od paty kmene a napájen z elektrické sítě. Odchyt spor probíhal v roce 2013. 5. Boršov nad Vltavou je obec na břehu Vltavy, 5 km jižně od Českých Budějovic. Pokusná plocha byla instalována na zahradě domu č. p. 186 u pana Ilji Urbánka, GPS: 48.9247053N, 14.4396442E, 407 m n. m. Zdrojem spor byly jeden velmi vzrostlý jasan, staří přes 80 let s příznaky silného napadení v koruně a okolní, silně chřadnoucí, nárost o stáří i více než 10 let. Lapač byl umístěn 15 m od paty kmene vzrostlého jasanu a 7 m od napadeného nárostu a napájen z elektrické sítě. Odchyt spor probíhal v letech 2014 2015. 6. Horní Benešov je lokalita umístěná na okraji Jeseníků, GPS: 49.9692286N, 17.5921575E, 502 m n. m. Jedná se o vzrostlý strom s mírnými příznaky napadení a okolní několikaletý nárost s jasnými symptomy infekce. Lapač byl umístěn na zahradě domu č. p. 95 přímo pod napadeným nárostem, cca 30 m od vzrostlého jasanu, napájen z elektrické sítě. Odchyt spor probíhal v roce 2014. 7. Jelení Hora je lokalita v jádru Novohradských hor na území LS Nové Hrady. Jde o jasanovou skupinu ve smíšeném buko-smrkovém lesním porostu o stáří cca 50 60 let, GPS: 48 36'38.934"N, 14 38'11.528"E, 883 m n. m. Vzrostlé stromy vykazují příznaky napadení nekrózou jasanu jak v korunách, tak na kmenových výmladcích. Odchyt spor probíhal v roce 2015. Technika použitá pro odchyt spor Na každé lokalitě byl instalován jeden lapač spor (Amet, Velké Bílovice; Obr. 13). Tento lapač spor je vyroben podle principu Burkardova lapače spor (http://www.burkard.co.uk/). Jde tedy o automatický sedmidenní volumetrický lapač pracující následujícím způsobem (Hirst 1952). Vzorkovaný vzduch je nasáván úzkou štěrbinou do válce, uvnitř kterého se pomocí hodinového strojku otáčí kotouč rychlostí jedna otáčka za sedm dní. Na obvod kotouče se upevňuje melinexova páska potřená vazelínou. Nasátý vzduch je se vším svým obsahem vrhán přímo na lep pásky, čímž se veškeré částice na pásce zachycují. Exponovaná páska se po sedmi dnech vyměňuje za novou. Válec lapače je volně otočný a pomocí korouhve je jeho ústí stále směřováno proti směru větru. Ventilátor lapače je napájen stejnosměrným proudem cca 0,5 A o napětí 12 V. Prakticky bylo toto napájení zajištěno přes transformátorek z elektrické sítě nebo z autobaterie dobíjené 120W solárním panelem. Každá lokalita byla vybavena automatickou meteorologickou stanici SIGNALIZATOR (Amet, Velké Bílovice), která každou hodinu zaznamenávala teplotu a vlhkost vzduchu, rosný bod a ovlhčení listu. Takto osázená pokusná plocha byla obsluhována vždy od jara (duben červen) do podzimu (září prosinec). Obsluha spočívala v každotýdenní výměně lepicí pásky, občasné údržbě senzoru ovlhčení listu příp. výměně baterie nebo stažení dat meteorologické stanice (min. 2x během sezóny). 31

Obr. 13. Automatický sedmidenní lapač spor v pozadí, pár rotačních lapačů v popředí Rotační lapače spor Za účelem získání praxe a studia konstrukce absolvoval spoluřešitel Miloň Dvořák krátkodobou vědeckou stáž na CRAW Gembloux (Belgie). Po návratu zkonstruoval několik desítek lapačů v rámci tohoto projektu a otestoval je v praxi. Konstrukce lapačů byla prvně publikována Perkinsem (1957), jejich účinnost byla experimentálně i teoreticky vypočtena a publikována McCartneyem (1997). Námi použité provedení bylo publikováno a prvně vyzkoušeno na detekci H. fraxineus Chandelierovou et al. (2014). Tyto lapače se skládají z raménka, které pomoci elektromotorku rotuje 2400 ot./min. (viz Obr. 13). Do raménka jsou vsazovány tyčky s lepovým médiem. Tato technologie je velmi úsporná. Tyčky jsou v podstatě zápalky s odštípnutou hlavičkou, na jejichž dříku je v délce 2,5 cm po celém obvodu fixována oboustranná lepicí páska. Tyto lapače jsou exponovány na pokusné ploše vždy 48 hodin a napájeny motoakumulátorem. Po 48 hodinách lapání jsou lapací tyčky vyjmuty z raménka a okamžitě uschovány v 1,5ml zkumavce a před dalším zpracováním skladovány v -20 C. Rotační lapače byly použity na lokalitě Vranovice a několikrát také na lokalitě Hackerova školka, pro porovnání jejich účinnosti s lapačem spor Burkardova typu. Zpracování vzorků z lapačů spor Páska z lapače spor byla nejprve rozdělena podle jednotlivých dnů lapání. V roce 2012 a 2013 byly askospory sčítány mikroskopicky. Již během roku 2012 ale bylo zřejmé, že H. fraxineus je možné při morfologické identifikaci zaměnit s původním saprofytickým druhem H. albidus, se kterým není totožný (Gross et al. 2012). V roce 2013 jsme spoléhali na domněnku, že saprofytický druh je v místech infekce vytlačen druhem parazitickým (Hietala et al. 2013). Protože ale sám posledně citovaný autor určitý podíl saprofytickému druhu přiznává i v oblastech s méně rozšířenou infekcí nekrózy jasanu, rozhodli jsme se od roku 2014 vzorky z lapače vyhodnocovat přesněji. Pásky z lapačů spor jsme podrobili extrakci DNA pomoci komerčního kitu DNEasy Plant Mini Kit (Qiagen) a k detekci a kvantifikaci daného druhu askospor použili metodu 32

kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qpcr/real-time PCR) se specifickými primery a duálně značenou specifickou sondou. Postup extrakce DNA byl optimalizován do následující podoby. Extrakce DNA byla provedena podle návodu výrobce kitu s několika modifikacemi. V prvním kroku bylo potřeba provést důkladnou disrupci spor. Proto byla k pasce v mikrozkumavce přidána balotinova zrna (400 mg frakce 0,1 mm) a 0,25 ml Nonidetu P40 (substitute). Tato suspenze byla třepána v homogenizátoru kmitočtem 30 Hz po dobu 10 minut. Následovalo přidání lyzačního pufru z balení kitu, ribonukleázy podle protokolu výrobce, ale následná inkubace byla prodloužená z 10 minut na 1 hodinu. Na konci procesu extrakce byla DNA eluována 0,1 ml elučního pufru při inkubaci prodloužené z 1 minuty na 10 minut. V případě extrakce DNA ze vzorku z rotačních lapačů byl proces naprosto shodný. Tyčky s lepovým médiem (zápalky) se celé vkládaly do mikrozkumavek, a to vždy obě zápalky z jednoho lapače do jedné zkumavky. Zpracování vzorků DNA metodou qpcr proběhlo kompletně v režii Dr. Gabriely Rotkové z Masarykovy univerzity. Nastavení cykleru a složení reakční směsi bylo provedeno podle Chandelier et al. (2014). Pro stanovení absolutního množství askospor v každém vzorku byly připraveny suspenze askospor. Během fruktifikační sezóny H. fraxineus 2015 a 2016 byla celkem čtyřikrát odebrána apothecia narůstající na loňských řapících jasanového listí. Apothecia byla neprodleně po odběru smáčena v 0,8 ml 0,1% roztoku Nonidetu P40. Po smočení cca 50 ks apothecií byla obdržena suspenze podrobená sčítání askospor pomoci Burkerovy komůrky. Suspenze o známé koncentraci spor byla sériově zředěna a do mikrozkumavek pipetována tak, aby byly k dispozici vzorky s 1, 10, 100, 1000, 10000 a 100000 askospor. Do každé zkumavky byla přidána melinexova páska s vazelínou pro co nejpreciznější simulaci vzorku z lapače spor. Vyhodnocení dat Během řešení projektu byla data vyhodnocována několikrát, k různým účelům, ale souhrnné vyhodnocení teprve momentálně probíhá. Prvně byla data vyhodnocována na konci roku 2012. Jednalo se o data z prvního roku řešení, tedy pouze z lokality Hackerova školka. Výstupem bylo pouze grafické znázornění výskytu a množství spor během sledované sezóny pro účely řešení ostatních úkolů projektu. Podobnou úroveň mělo vyhodnocování dat po roce 2013. Data z roku 2014 a 2015 byla zkompletována až v druhé půlce roku 2016, přesto ale bylo možné již v roce 2015 vyhodnotit lokalitu Hackerova školka z roku 2014. Mimo obvyklého grafického výstupu (Obr. 14) byly provedeny statistické analýzy. Závěry byly interpretovány na základě porovnání neparametrických korelačních koeficientů při různém časovém posunu meteorologických veličin vůči detekovaným množstvím inokula. Do hledání souvislostí mezi výskytem spor a průběhem počasí (naměřených meteorologických veličin) jsme nově v roce 2016 zapojili pokročilejší statistické metody. Jako nejvhodnější se jeví analýza časových řad, konkrétně model typu VARIMA. Výsledky a diskuze První výsledky z roku 2012 poukázaly na přítomnost inokula H. fraxineus od začátku července do první dekády srpna. Tyto výsledky se opíraly o sčítání askospor pomoci mikroskopu a také samotný sběr vzorku se řídil podle sledování výskytu apothecií a jejich zralosti. Poměrně brzký konec fruktifikace bylo možné vysvětlit velmi suchým počasím v pozdějším létě. Výsledky za rok 2013 stále pocházejí z mikroskopického sčítání. Kvalitní byly výsledky z lokalit Hackerova školka a Hlincova hora. Vranovické měření utrpělo mimořádně vysokými srpnovými teplotami (vysoko pres 40ºC), kdy docházelo k rozpouštění lepového média. Na lokalitě Líska byly ztráty dat způsobené lidským faktorem špatnou obsluhou místními obyvateli. Konkrétní a spolehlivé, statisticky vyhodnocené a publikované výsledky prozatím máme z lokality Hackerova školka, z roku 2014. Jejich grafické znázornění je na Obr. 14. Mimo výskytu inokula parazitického druhu H. fraxineus byl detekován také saprofytický druh H. albidus. Aplikaci linearní regrese logarytmicky transformovaných dat byla zjištěna velmi významná vzájemná pozitivní závislost mezi výskyty obou druhů, což poukazuje na jejich koexistenci. Tímto výsledkem lze popřít 33

tvrzení, že v oblastech s rozšířením patogenního druhu dochází k eliminaci druhu saprofytického (Hietala et al. 2013). Z hlediska závislosti výskytu inokula na meteorologických veličinách byly nalezeny signifikantní korelace zejména s ovlhčením listů a relativní vlhkostí vzduchu. Vztah mezi výskytem spor a průběhem počasí byly vyhodnoceny také vzhledem k jejich vzájemnému časovému posunu. Obr. 14. Průběh výskytu vzdušného inokula H. fraxineus (červená plocha) a H. albidus (černá plocha), minimální relativní vlhkosti vzduchu (RH) a minimálního ovlhčení listů (LW) Podle porovnání korelačních koeficientů je množství inokula ve vzduchu ovlivněno relativní vlhkostí vzduchu před 11 12 dny a ovlhčením listů před 1 2 dny. Tyto časové body by mohly odpovídat počátku rozvoje apotecií, pro které je nutná vzdušná vlhkost a následně dozrání a uvolnění askospor, které je podmíněno ovlhčením listů (potažmo řapíků, na nichž apotecia rostou; Gross et al. 2012). Velmi zarážející je fakt, ze DNA byla detekována ve vzorcích mimo období výskytu apothecií, tudíž v dubnu, květnu, červnu a říjnu. Toto zjištění je částečně vysvětleno nastíněným pravděpodobným životním cyklem patogenu. Gross et al. (2012) popisuje nepohlavní konídie jako spermacie, které se šíří v období před nárůstem apothécií, jejichž vznik podmiňují. Není vyloučeno, že detekovaná DNA pochazí právě z těchto nepohlavních výtrusů. Výsledky z ostatních lokalit z roku 2014 i 2015 výskyt inokula mimo období produkce apothecií potvrzují. V současné době jsou zkompletované výsledky z let 2014 a 2015 ze všech lokalit. Jako nejvhodnější model analýzy časových řad se jeví VARIMA, který podle předběžné aplikace na data ze čtyř lokalit potvrzuje výsledky analýzy lokality Hackerova školka z roku 2014. Konkrétně jde o vliv vlhkosti vzduchu a nově také teploty na determinaci výskytu spor, který se projevuje nejvíce 12 dní a poté 1 2 dny před detekovaným množstvím spor ve vzduchu. Na základě tohoto výsledku lze tento VARIMA model použít pro predikci výskytu spor na základě průběhu počasí a v konečné aplikaci umožní naprogramovat meteorologickou stanici k signalizaci vhodnosti provedení obranných opatření k eliminaci šíření infekce. Velmi uspokojivé výsledky také podalo srovnání rotačních lapačů (Obr. 15, RAST) s volumetrickým lapačem (Obr. 15, SAVST). Statistickou analýzou sedmi porovnávacích měření nebyl 34

odhalen v naměřených hodnotách rozdíl. Daleko vyšší vzorkovaný objem rotačních lapačů byl vyrovnán jejich nižší účinností pro odchycení askospor H. fraxineus. Tento test potvrzuje vhodnost použití levných, jednoduchých a lehkých rotačních lapačů zkontruovaných podle Chandelier et al. (2014) při detekci původce nekrózy jasanu ve vzduchu. Obr. 15. Srovnání množství detekovaného inokula rotačním lapačem (RAST) a volumetrickým lapačem (SAVST) Výstupy RIV Dvořák, M., Rotková, G., Botella, L. (2016). Detection of airborne inoculum of Hymenoscyphus fraxineus and H. albidus during seasonal fluctuations associated with absence of apothecia. Forests 7(1), 1, doi:10.3390/f7010001. Koukol, O., Haňáčková, Z., Dvořák, M., Havrdová, L. (2015). Unseen, but still present in Czechia: Hymenoscyphus albidus detected by realt-time PCR, but not by intensive sampling. Mycological Progress 15(6), 1 9. Dvořák, M., Humplíková, Z., Hejná, M., Havrdová, L., Fedusiv, L. (2013). Současné poznatky o nekróze jasanů a výzkum biologie jejího původce za účelem vývoje metod obrany. Zahradnictví 9/2013, p. 56 58. ISSN 1213-7596 Plánované výstupy V tuto chvíli je rozepsán manuskript článku pojednávajícího o predikci výskytu vzdušného inokula na základě průběhu počasí podle právě zdokonalovaného modelu. Tento model bude sestaven analýzou časových řad za použití co největšího množství obdržených dat ze všech pokusných ploch z let 2014 a 2015. Bude se jednat o unikátní výstup, který bude publikován na konferenci IUFRO 7.02.02 v Kanadě v květnu 2017 a posléze publikován v impaktovaném periodiku. 35

Jiné výstupy Dvořák, M., Rotková, G. (2015): Spore dispersal of Hymenoscyphus fraxineus in the Czech Republic. IUFRO 7.02.02 - Foliage, shoot and stem diseases of forest trees & 7.03.04 -Diseases and insects in forest nurseries working party meeting, 7-12 June, 2015 in Uppsala, Sweden, Book of abstracts, SLU, p. 30. Dvořák, M., Humplíková, Z. (2013): Hymenoscyphus pseudoalbidus spore trapping in the Czech Republic 2012, 4th 6th September, 2013, Malmö, Sweden, Abstracts of Posters p. 22 23. Dalším výstupem jsou také ukončené závěrečné práce studentů, kteří se podíleli na pracích spojených s řešením tohoto projektu. Jsou to práce následující: 1. Jana Hrnčiříková: Detekce výskytu Hymenoscyphus fraxineus pomocí lapačů spor a molekulárně biologických metod v Hackerově školce (bakalářská práce obhájená v červnu 2016) 2. Daniela Smetanová: Detekce výskytu Hymenoscyphus fraxineus pomocí lapačů spor a molekulárně biologických metod ve Vranovickém lese (bakalářská práce obhájená v červnu 2016) 3. Cristina Zamora Ballesteros: Seasonal fluctuations of airborn inoculum of Hymenoscyphus fraxineus in Czech Republic (diplomová práce obhájená v srpnu 2016) 36

Výsledek V007 Genotypy jasanu odolné vůči infekci H. fraxineus (Ch. fraxinea) Cíl výsledku: Otestovat variabilitu populace jasanu v ČR vůči infekci H. fraxineus; v případě nálezu více rezistentních genotypů jejich uchování a patentování. Zodpovědný řešitel: Kateřina Novotná Termín dosažení výsledku: 2016 Termín realizace výsledku: 2018 Plánovaná forma výsledku dle RIV: 1 Jimp, 3 P Cíle výsledku byly splněny. Proběhlo ověření metodik testů rezistence; proběhl výběr fenotypově odolnějších genotypů jasanu, odběr a jejich uchování. Část výsledků byla publikována v Jimp. Výsledek 3 P byl v souladu s vyjádřením poskytovatele nahrazen (viz níže). A. Ověření metodiky testů rezistence V rámci ověřování vhodnosti použité metody k ověření citlivosti F. excelsior vůči H. fraxineus bylo provedeno testování na segmentech větví jasanu a následně na roubovancích vybraných genotypů jasanu a na sazenicích v lesní školce. Testování na segmentech větví jasanu Infekční testy byly prováděny v létě na segmentech větví odebraných ze dvou stromů Fraxinus excelsior. Na každém testovaném vzorku byl pomocí raznice vytvořen otvor o průměru 5 mm, do kterého byl vložen stejně velký segment mycelia různých izolátů H. fraxineus (izolát C9/12 a izolát C28/12, oba uloženy ve sbírce VÚKOZ,v.v.i.). Po třech týdnech byly u inokulovaných segmentů větví porovnávány plochy nekróz. V rámci předběžného testování citlivosti jedinců F. excelsior vůči H. fraxineus byl zjištěn rozdíl v citlivosti a to jak mezi jednotlivými genotypy tak i při použití jednotlivých izolátů. Inokulace segmentem mycelia se proto zdála být vhodnou metodou pro infekční testy. V rámci inokulace segmentem mycelia do segmentu odebraných větví 6 genotypů jasanu byl také zjišťován případný vliv faktorů prostředí na rozvoj umělé in vitro infekce H. fraxineus u F. excelsior. Mezi sledované faktory patřily: délka inkubace patogenu (1 až 4 týdny), vliv in situ infekce (rezistentní jedinec x citlivý jedinec) a termín odběru vzorků (únor, duben, červenec, říjen). Bylo prokázáno, že vyhodnocení úspěšnosti testu je nejvhodnější provádět 4 týdny po inokulaci. Dále bylo zjištěno, že průkazně menší léze, způsobené H. fraxineus měly segmenty větví ze zdravých stromů oproti stromům infikovaným a jako nejvhodnější termín odběru pletiv pro infekční pokusy bylo vyhodnoceno letní období. Testování na roubovancích a sazenicích jasanu Na roubovancích vybraných genotypů F. excelsior (dva genotypy s předpokládanou vyšší mírou resistence luž 1 a luž 4, a dva citlivé genotypy luž 6 a luž 8) byly ověřovány výsledky infekčních testů provedených na segmentech větví stejných genotypů jasanu a to třemi způsoby: 37

i) suspenzí askospor H. fraxineus, ii) inokulací segmentem mycelia H. fraxineus a iii) inokulací pomocí štěpinky porostlé myceliem H. fraxineus. Pro ověření úspěšného infekčního pokusu je potřeba vyhodnocení provádět až v následující vegetační sezóně (v roce inokulace nejevily infikované stromky viditelné příznaky poškození), nejlépe na začátku jara, kdy je rozvoj nekróz nejpatrnější. i) inokulace pomocí suspenze askospor H. fraxineus Inokulace pomocí suspenze askospor byla nejprve testována v klimatickém boxu na 2letých sazenicích jasanu. Opakování pokusu probíhalo na roubovancích ve skleníku s automatickou závlahou pro zajištění ideálních podmínek pro rozvoj infekce. Aplikace suspenze byla prováděna mezi 7 8 hod. v denních intervalech v letním období (v době dozrání plodniček H. fraxineus). Suspenze byla připravována z čerstvých plodniček H. fraxineus, které byly mechanicky narušeny a v suspenzi s destilovanou vodou aplikovány pomocí ručního rozprašovače na listy roubovanců. Rozvoj infekce H. fraxineus pomocí suspenze na 2letých sazenicích v klimatickém boxu byl sice patrný, avšak nedosahoval takové účinnosti jako v přirozeném prostředí. U žádných z testovaných jasanů nedošlo k prorostení mycelia patogenu až do výhonu testovaných rostlin. Testy provedené ve skleníku s automatizovanou závlahou se znovu projevily jako neúčinné. U žádného z testovaných genotypů F. excelsior, ani u kontrolních rostlin ošetřovaných pouze suspenzí destilované vody, nebyla potvrzena úspěšná infekce ve formě nekrotizovaného výhonu ani jinak poškozeného roubovance. Výsledky pokusu jsou shodné s dosavadními výsledky německého týmu B. Schulz (pers. common). ii) inokulací segmentem mycelia H. fraxineus na roubovancích a sazenicích Závislost rozvoje umělé infekce H. fraxineus pomocí segmentu mycelia byla také zjišťována v podmínkách in situ na semenáčcích pěstovaných v lesní školce. Do pokusu bylo zařazeno 15 20 rostlin pro každou variantu (izolát C9/12 a C28/12) ve třech pakováních v různých termínech. Hodnoty všech sledovaných rozměrů lézí se průkazně lišily mezi jednotlivými použitými izoláty v obou termínech i mezi jednotlivými termíny u obou izolátů. Pro potvrzení rozdílů byl pokus opakován na roubovaných stromcích. Použity byly stejné izoláty a stromky byly po celou dobu umístěny ve skleníku pro zamezení přirozené infekce sledovaných jasanů. U rostlin inokulovaných segmentem mycelia izolátu C28/12 a na všech kontrolních rostlinách inokulovaných čistým agarem SL 2% nedošlo k rozvoji onemocnění. Naopak u rostlin inokulovaných segmentem mycelia izolátu C9/12 se projevila infekce rozvojem nekróz v inokulovaném kmínku, či odumřením celé dřeviny u 43 % ze všech testovaných rostlin genotypů s předpokládanou vyšší mírou rezistence a u 54 % rostlin citlivých genotypů F. excelsior. iii) inokulace pomocí štěpinky porostlé myceliem H. fraxineus Na základě předchozích infekčních pokusů byly v letním období inokulovány dva genotypy jasanu s předpokládanou vyšší mírou resistence a dva citlivé genotypy jasanovými štěpinkami porostlými myceliem H. fraxineus. Čtyři kontrolní rostliny byly inokulovány pouze zklávovanou jasanovou štěpinkou vloženou na čistý agar SL 2%. Celkem 99 testovaných rostlin bylo po celou dobu trvání pokusu z důvodu zamezení vlivu přirozené infekce umístěno ve skleníku. U každého testovaného roubovance byl po očištění povrchových pletiv měřen rozsah povrchových nekróz způsobených H. fraxineus a po podélném rozříznutí kmínku stromku byl měřen rozsah nekróz vnitřního xylému. U kontrolních rostlin nebyl žádný z projevů infekce identifikován. U rostlin inokulovaných izolátem C 28/12 došlo opětovně k výrazně menšímu poškození, nekrózy pletiv byly identifikovány pouze ve vnitřním xylému a to u 4 % testovaných rostlin. U rostlin inokulovaných izolátem C9/12 došlo výrazně častěji k poškození vnitřních pletiv a to ve 41 %. Rozdíl mezi rezistentními a 38

senzitivními genotypy jasanu nebyl infekčním pokusem potvrzen, ani interakce mezi genotypem jasanu (rezistentní/senzitivní) a izolátem nebyla významná, významný rozdíl byl ale potvrzen mezi izoláty a i kontrolou (Tab. 16). Výsledky z průběžných zpráv projektu opakovaně potvrzují, že izolát C9/12 je více virulentní oproti izolátu C28/12, to potvrzuje i Tukeyovo mnohonásobné porovnání z výsledků z r. 2016; izolát C28/12 naopak nebyl významně odlišný od kontroly (viz Tab. 16). Z toho vyplývá, že pro infekční pokusy je zcela zásadní výběr a množství testovaných izolátů. Tab. 16. Testování jasanu na míru rezistence (rezis x senzi) pomocí štěpinky porostlé myceliem H. fraxineus izoláty C9/12 (A) x C28/12(B) a kontroly (K); vpravo Tukeyovo mnohonásobné porovnání izolátů Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) rezis 1 1232 1232 1.89 0.17247 K 0.00 izolat 2 7181 3590 5.508 0.00549 ** B 0.48 rezis:izolat 2 1193 597 0.915 0.40403 A 17.55 Residuals 93 60622 652 Na základě výsledků provedených testů nelze v současné době doporučit testování rezistence fenotypově odolnějších jedinců formou infekčních pokusů. Nedostatečně průkazné výsledky mohly být zapříčiněny chybnou metodikou vlastní inokulace nebo špatnými klimatickými podmínkami, ve kterých byl pokus proveden (tj. ve sklenících s cílem zamezit vzniku přirozené infekce). Obecně je pro ověřování testování rezistence v Evropě doporučováno pouze testování pomocí přirozeného infekčního tlaku, i když první výsledky při hledání molekulárních markerů rezistence již byly nalezeny (Harper et al. 2016). V hledání vhodné metody k testování odolnosti jednotlivých genotypů budeme v dalších letech pokračovat. B. Fenotypově více odolní jedinci Podle metodiky vytvořené v roce 2012 byli na základě terénního šetření v terénu vyhledáváni zdraví jedinci F. excelsior, kteří se vyskytují v bezprostřední blízkosti již dlouhodobě infikovaných jasanů a mají stejné či podobné stanovištní podmínky. Celkem bylo nalezeno, označeno a odebráno 46 takových genotypů jasanu. Dále bylo provedeno terénní hodnocení vlivu H. fraxineus na jasany vysazené na provenienční ploše Zakšín a v jediném semenném sadu ČR Motykov. Hodnoceno bylo proschnutí korun, přítomnost nekrózy krčku, jiné poškození (Armillaria sp., Hylesinus varius), výška stromu, tloušťka kmínku ve výčetní výšce aj. Proschnutí korun se u jednotlivých stromů na Zakšíně pohybovalo mezi 5 a 90 % a v Motykově mezi 2 a 50 %. Na pokusné ploše Zakšín byla zjištěna vyšší citlivost k H. fraxineus u F. excelsior oproti F. angustifolia, navíc byl zjištěn mezi jednotlivými proveniencemi F. excelsior rozdílný stupeň rezistence (provenience z vyšších nadmořských výšek byly méně napadené nekrózou jasanu oproti proveniencím z nižších poloh). Rozdíl v citlivosti mezi ekotypy nebyl zjištěn, ale v rámci jednotlivých proveniencí byla nalezena vysoká variabilita v rezistenci (slibné genotypy s proschnutím korun do 5 % byly identifikovány ve všech testovaných proveniencí). Zdá se, že hlavní zdroj rezistence k patogenu je spíše na úrovni genotypu než provenience (viz Havrdová et al. 2016b), to potvrzuje i řada evropských studií (např. Kjær et al. 2012; Stener 2013; Pliūra et al. 2014) 39

C. Ověření metodiky odběru, uchování a napěstování materiálu Na základě dostupné literatury a vlastních pokusů (množení pomocí bylinných řízků, roubování) bylo pro množení odebraného materiálu vybráno roubování jako nejvhodnější způsob. Celkem bylo v rámci ČR naroubováno 46 vybraných fenotypově odolnějších genotypů F. excelsior (Obr. 8). Pro infekční pokusy byly zvlášť roubovány 2 genotypy rezistentnějších a 2 genotypy senzitivnějších jasanů (viz bod A). Z celkového počtu 1838 naroubovaných rostlin bylo získáno 1150 roubovanců, přičemž úspěšnost roubování byla u jednotlivých genotypů 17 100 %, průměrně 64 % (úspěšnost se postupně se zkušenostmi týmu zvyšovala). Podnože F. excelsior a květináče byly získány na základě spolupráce se Sdružením lesních školkařů ČR, z.s. (LŠ Kladíkov, LESOŠKOLKY s.r.o. Řečany n. L., Montano Přerov n. L.). Všechny genotypy označené jako odolnější byly po 4 ks vysazeny do matečnice na lokalitu Michovky v Průhonicích. Zbylé roubovance byly a další budou vysazeny na známé lokality Povodí Labe, s. p. V příštích letech plánujeme pokračovat v kontrole zdravotního stavu stromků a průběžně vyhodnocovat jejich schopnost rezistence vůči napadení H. fraxineus v přirozeném prostředí. Matečnice v Průhonicích bude navíc sloužit jako zdroj materiálu k dalšímu šlechtění či množení. Obr. 8. Přehled genotypů F. excelsior naroubovaných v letech 2013 2016 40

Výsledky RIV Havrdová L, Novotná K, Zahradník D, Buriánek V, Pešková V, Šrůtka P, Černý K. (2016b): Differences in susceptibility to ash dieback in Czech provenances of Fraxinus excelsior. Forest Pathology 46, 281 288. Výsledek 3 P nebyl z důvodu legislativního vakua splněn (viz vyjádření ÚKZÚZ a Patentového úřadu, Příloha 1 a 2) a byl dle vyjádření poskytovatele č. j. 37650/2016-MZE-14152 ze dne 23. 6. 2016 nahrazen výstupy: Skovsgaard, J. P., Wilhelm, G. J., Thomsen I. M., Metzler, B., Kirisits, T., Havrdová, L., Enderle, R., Dobrowolska, D., Cleary, M., Clark, J. (v řízení). Silvicultural strategie for Fraxinus excelsior in response to dieback caused by Hymenoscyphus fraxineus. Forestry (Q1); viz V001 Černý, K., Hrabětová, M., Svobodová, I., Mrázková, M., Kowalski, T. (v řízení). Eutypella parasitica naturalised in Bohemian and Polish Silesia. Forest Pathology (Q2); viz V008 Kelnarová, I., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (v řízení). Widespread latent infection of Cryptostroma corticale in asymptomatic Acer pseudoplatanus as a risk for its urban plantations. Forest Pathology (Q2); viz V008 Jiné výstupy Novotná, K., Štochlová, P., Havrdová, L., Strnadová, V., Černý, K. (2014). Resistance screening of A. glutinosa and F. excelsior to invasive pathogens P. alni and H. fraxineus. 11th Conference of the European Foundation for Plant Pathology: Healthy plants healthy people, 8 13 September 2014, Kraków, Poland. Novotná, K., Štochlová, P., Havrdová, L., Strnadová, V., Černý, K. (2013). Testování odolnosti vybraných autochtonních dřevin vůči invazním houbovým patogenům. 29-31.8. 2013, Olomouc, Mykologické Listy 125, p. 54. Novotná, K., Štochlová, P., Havrdová, L., Strnadová, V., Černý, K. (2013). Průzkum odolnosti A. glutinosa a F.excelsior vůči invazním patogenům P. alni a Ch. fraxinea. Škodliví činitelé v lesích Česka 2012/2013, 11. 4. 2013, Průhonice. Založení matečnice s vybranými genotypy F. excelsior na lokalitě Michovky a výsadba rezistentnějších genotypů do břehových porostů Povodí Labe, s. p. V rámci tohoto cíle byla také na České zemědělské univerzitě v Praze, Fakultě lesnické a dřevařské v roce 2015 úspěšně obhájena diplomová práce Marka Krause Citlivost českých proveniencí jasanu ztepilého a jasanu úzkolistého vůči invaznímu patogenu Hymenoscyphus fraxineus. 41

Výsledek V008 Metodika pěstování jasanu Cíl výsledku: Na základě předchozích výsledků vytvořit metodiku, která umožní efektivní pěstování jasanů i v prostředí zatíženém H. fraxineus. Zodpovědný řešitel: Karel Černý Termín dosažení výsledku: 2016 Termín realizace výsledku: 2017 Plánovaná forma výsledku dle RIV: 1 Nmet Cíl výsledku byl splněn. V rámci projektu byla vypracována metodika ochrany jasanu vůči H. fraxineus: Černý et al. (2016): Pěstování jasanu v prostředí s výskytem Hymenoscyphus fraxineus. Certifikovaná metodika MZe QJ1220218, Průhonice, Brandýs n. L., VÚKOZ, ÚHÚL. 52 p. ISBN: 978-80-87674-18-5, 978-80-88184-05-8. Metodika byla úspěšně certifikována a smlouva o využití tohoto výsledku již byla uzavřena s Lesy České republiky, s. p., Povodím Labe, s. p., Sdružením lesních školkařů ČR, z.s. a využívána bude spoluautorskou organizací Ústavem pro hospodářskou úpravu lesů. Metodika byla v rámci projektu vytištěna. Metodika byla vypracována rešeršní metodou na základě sumarizace ekologických, epidemiologických a dalších dat (např. výsledků testů účinnosti fungicidů). Při vypracování metodiky byly v první řadě využity vlastní znalosti, které byly získány v průběhu řešení výzkumného projektu NAZV QJ1220218 Chalara v letech 2012 2016 zejména pak dílčích cílů C001, C002, C003, C006 a C007 a výzkumných aktivit dalších (z části získaných v rámci projektu NAZV QI92A207 Břehové porosty ukončeného v r. 2013). Dále byly jako zdroje informací použity i nejnovější publikované práce řady zahraničních autorů a informace získané v rámci akce COST FP 1103 FRAXBACK. Velká část z prací odvedených zejména v rámci projektu Chalara byla v současnosti publikována vesměs ve vědeckých zahraničních periodicích, některé práce jsou v recenzním řízení či jsou dokončovány. Hlavním cílem metodiky je napomoci jejím uživatelům (majitelům a správcům lesů, odborným pracovníkům v lesnictví a vodohospodářství, školkařům, ochraně přírody a krajiny, státní správě a samosprávě, odborníkům zabývajícím se údržbou zeleně a dalším subjektům) v péči o jasan v prostředí zatíženém invazí nepůvodního patogenu jasanu Hymenoscyphus fraxineus. Cílem metodiky je co možná nejvíce snížit současné ztráty způsobené patogenem ve všech typech výsadeb a porostů jasanu a umožnit udržitelné hospodaření s touto dřevinou s co nejmenšími škodami (ekonomickými, environmentálními, krajinářskými, estetickými a dalšími) i do budoucna. Účelem metodiky je pak dlouhodobě udržet vliv H. fraxineus v porostech s výskytem jasanu na takové úrovni, aby nebyly výrazně narušeny jejich funkce produkční, ekologické, technické a další. V metodice je předložen integrovaný soubor opatření (agrotechnických, fyzických, chemických a dalších), která, pokud budou používána, mohou výrazně přispět ke snížení škod, které invaze H. fraxineus přináší ve všech oblastech pěstování jasanu od lesního hospodářství, přes výsadby v břehových porostech, výsadby ve volné krajině až po okrasné výsadby v intravilánech obcí a školkařské provozy. Metodika je oproti původnímu plánu komplexní, přičemž důvodů tohoto rozšíření je několik. Jedním z nich je fakt, že H. fraxineus je dnes již extrémně rozšířený patogen poškozující všechny druhy výsadeb jasanu bez výjimky, další pak je fakt, že řada opatření v různých typech výsadeb má díky ekologii patogenu a hostitele a epidemiologii choroby mnohé styčné body a nabízí podobná řešení a konečně důvodem je i dnešní situace, kdy nelze očekávat, že by bylo možné 42

organizačně a finančně zajistit vypracování paralelních metodik pro jednotlivé provozní oblasti. Velkou výhodou široce koncipované metodiky je z hlediska řešení konkrétních praktických problémů možnost získání inspirace nahlédnutím i do oblastí jiných (zejména lesního hospodářství). Vypracovaná metodika vyplňuje významnou mezeru v praktické ochraně dřevin vůči invazním patogenům. ČR se touto metodikou řadí po bok dalších států, které na národní úrovni podobnou metodiku pěstování jasanu už vypracovány mají a v praxi je používají. Pěstování jasanu se nemůže vrátit zpět do doby před počátkem invaze patogenu a k tomu ani předložená metodika nesměřuje. Jejím cílem je přispět k šetrnějšímu dosažení určitého budoucího rovnovážného stavu celého patosystému, minimalizovat škody, které se v procesu jeho ustavování mohou objevovat a podpořit přežití a obnovu tolerantních genotypů. Výsledky RIV Černý, K., Havrdová, L., Zlatník, V., Hrabětová, M. (2016). Pěstování jasanu v prostředí s výskytem Hymenoscyphus fraxineus. Certifikovaná metodika. Certifikace 30. 12. 2016 Mze (Osvědčení č. 73910/2016-MZE-16222/M140). VÚKOZ, v.v.i., Průhonice, 52 p. ISBN 978-80-87674-18-5, ISBN 978-80-88184-05-8. Vzhledem k tomu, že jednou z dřevin, které připadají nejčastěji v úvahu jako náhrada za odumírající jasany je javor (j. klen, J. mléč, j. babyka), byla věnována pozornost přítomnosti nebezpečných invazních patogenů této dřeviny v ČR Cryptostroma corticale a Eutypella parasitica, které představují potenciálně velmi významné riziko. V rámci úkolu byly vypracovány tři články (2xJimp a 1x Jrec) zabývající se výskytem těchto patogenů v ČR. Černý, K., Mrázková, M., Zýka, V., Hrabětová, M., Svobodová, I. (2016). Významný patogen javorů bradavkatka parazitická Eutypella parasitica R. W. Davidson & R. C. Lorenz v ČR. Rostlinolékař 6/2016, 26 29. Černý, K., Hrabětová, M., Svobodová, I., Mrázková, M., Kowalski, T. (v řízení). Eutypella parasitica naturalised in Bohemian and Polish Silesia. Forest Pathology. Kelnarová, I., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (v řízení). Widespread latent infection of Cryptostroma corticale in asymptomatic Acer pseudoplatanus as a risk for its urban plantations. Forest Pathology. 43

RIV výsledky 2012 2016 V projektu byly pro roky 2012 2016 naplánovány tyto RIV výsledky: 4 P, 1 Nmet, 1 Nmap, 5 Jimp, 4 Jrec; dohromady celkem 15 výstupů. Jelikož nebylo možné RIV výsledek 4 P splnit (1 P výsledek V005 u kterého nebyl do současné doby nalezen takový druh endofytu, který by úspěšně potlačoval rozvoj patogenu; 3 P výsledek V007, který nemůže být z důvodu legislativního vakua splněn, viz vyjádření ÚKZÚZ, Příloha 1 a vyjádření ÚPV, Příloha 2), bylo ze strany poskytovatele v r. 2016 požadováno jejich nahrazení alternativními excelentními typy výsledků 4 Jimp v časopisech z oboru rostlinolékařství a lesnictví umístěných v Q1 nebo Q2 podle pořadí kvality (např. Forestry, Forest Ecology and Management, Plant Pathology) a 1 certifikovanou metodikou (vyjádření poskytovatele č. j. 37650/2016-MZE-14152 ze dne 23. 6. 2016). Během řešení projektu bylo dosaženo 1 Nmap, 2 Nmet (z toho 1 Nmet před dokončením), 12 Jimp (z toho 5 Jimp v recenzním řízení), 2 Jrec; dohromady 17 výstupů, viz Tab. 17. Výsledky, které nahrazují 4 P, jsou 3 v časopise Q2 a 1 v časopise Q1 (viz závěrečná zpráva Výsledek V005 a V007). K posunutí termínu výsledků V001 došlo především z důvodu opakovaných mateřských a rodičovských dovolených v řešitelském kolektivu; tato změna byla poskytovatelem schválena. Z tohoto důvodu byly některé výstupy opožděny, oproti plánovaným termínům. Tab. 17. Přehled dosažených výsledků RIV projektu QJ1220218 Přehled výsledků RIV dosažených tímto projektem podle jednotlivých druhů výsledku RIV Počet výsledků RIV 2012 Počet výsledků RIV 2013 Počet výsledků RIV 2014 Počet výsledků RIV 2015 Počet výsledků RIV 2016 Počet výsledků CELKEM P - patent 0 0 0 0 0 0 plán 0 0 0 0 4 4 Nmet, Nmap 0 0 0 0 3 3 plán 0 0 0 0 2 2 Jimp 0 0 1 5 6 12 plán 0 0 2 1 2 5 Jrec 0 1 0 0 1 2 CELKEM ZA PROJEKT plán 0 0 3 0 1 4 0 1 1 5 10 17 Celkem PLÁN 0 0 5 1 9 15 44

Hospodaření 2012 2016 Hospodaření všech příjemců podpory i dalších účastníků probíhalo po celou dobu řešení projektu podle plánu a v souladu s pravidly poskytovatele. Mezi jednotlivými položkami došlo k přesunům v souladu s Všeobecnými podmínkami MZe (čl. 13. 7.), kdy přesuny finančních prostředků mezi jednotlivými schválenými položkami uznaných nákladů u každého příjemce zvlášť činily v maximální částce 20 tis. Kč. Tyto přesuny byly vždy za každou jednotlivou organizaci detailně popsány v elektronických závěrečnýh zprávách pro poskytovatele. V současné době jsou finanční prostředky dočerpány a u režijních nákladů dochází k jejich dopočítání. Pokud byl FÚUP během doby trvání projektu zřízen, byl v následujícím roce v souladu s pravidly poskytovatele dočerpán. V celém průběhu projektu se všichni příjemci chovali hospodárně a finance byly vynakládány účelově pro získání potřebných výsledků. Detailní analytické členění jednotlivých nákladových položek bude za poslední rok projektu dodáno v elektronické závěrečné zprávě. Změny v projektu 2012 2016 V průběhu řešení projektu došlo několikrát k doplnění řešitelského týmu (Mgr. Z. Haňáčková, Mgr. M. Hrabětová, doc. D. Zahradník), ke změně statutárního zástupce v projektovém týmu (VÚLHM, v.v.i., PLA, s. p., VUKOZ, v.v.i., Sdružení lesních školkařů ČR, z.s.), ke změnám v rozpočtu a k změně typu výsledku (viz výše). Všechny změny byly poskytovatelem schváleny. Ludmila Havrdová a kol., 17. 1. 2017 45

Literatura Baral, H.-O., Queloz, V., Hosoya,T. (2014). Hymenoscyphus fraxineus, the correct scientific name for the fungus causing ash dieback in Europe. IMA Fungus 5(1), 79 80. Bengtsson, S.B.K., Vasaitis, R., Kirisits, T., Solheim, H., Stenlid, J. (2012). Population stucture of Hymenoscyphus pseudoalbidus and genetic relationship to Hymenoscyphus albidus. Fungal Ecology 5, 147 153. Černý, K., Havrdová, L., Zlatník, V., Hrabětová, M. (2016). Pěstování jasanu v prostředí s výskytem Hymenoscyphus fraxineus. Certifikovaná metodika. Certifikace 30. 12. 2016 Mze (Osvědčení č. 73910/2016-MZE-16222/M140). VÚKOZ, v.v.i., Průhonice, 52 p. ISBN 978-80-87674-18-5, ISBN 978-80-88184-05-8. Dal Maso, E., Cocking, J., & Montecchio, L. (2014). Efficacy tests on commercial fungicides against ash dieback in vitro and by trunk injection. Urban Forestry & Urban Greening, 13, 697 703. Gross, A., Zaffarano, P.L.., Duo, A., Grünig, C.R. (2012). Reproductive mode and life cycle of the ash dieback pathogen Hymenoscyphus pseudoalbidus. Fungal Genet. Biol. 49, 977 986. Gross, A., Holdenrieder, O., Pautasso, M., Queloz, V., Sieber, T.N. (2014). Hymenoscyphus pseudoalbidus, the causal agent of European ash dieback. Molecular Plant Pathology 15(1), 5 21. Chandelier, A., Helson, M., Dvorak, M., Gischer, F. (2014). Detection and quantification of airborne inoculum of Hymenoscyphus pseudoalbidus using real-time PCR assays. Plant Pathology 63, 1296 1305. Chumanová, E., Romportl, D., Havrdová, L., Zahradník, D., Pešková, V. and Černý, K. (v řízení). Predicting severity of ash dieback in forest stands using regession-based models and GIS. Forest Pathology. Haňáčková, Z., Koukol, O., Havrdová, L., Gross, A. (2015). Local population structure of Hymenoscyphus fraxineus surveyed by an enlarged set of microsatellite markers. Forest Pathology 45(5), 400 407 Haňáčková, Z., Havrdová, L., Černý, K., Zahradník, D., Koukol, O. (2017). Fungal endophytes in ash shoots diversity and inhibition of Hymenoscyphus fraxineus časopis. Baltic Forestry, Special issue: Susceptibility of European Tree Species to Alien Invasive Pests, přijato. Haňáčková, Z., Koukol, O., Čmoková, A., Zahradník, D., Havrdová, L. Shoot colonization by Hymenoscyphus fraxineus is not dependent on the extent of petiole colonization and intraspecific competition. Forest Pathology (v řízení) Harper, A. L., McKinney, L. V., Nielsen, L. R., Havlickova, L., Li, Y., Trick, M., Fraser, F., Wang, L., Fellgett, A., Sollars, E. S. A., Janacek, S. H., Downie, J. A., Buggs, R. J. A., Kjar, E. D., Bancroft I. (2016). Molecular markers for tolerance of European ash (Fraxinus excelsior) to dieback disease identified using Associative Transcriptomics. Science Report 6, 19335, doi: 10.1038/srep19335. Hauptman, T., Celar, F.A., de Groot, M., & Jurc, D. (2015). Application of fungicides and urea for control of ash dieback. iforest, 8, 165 171. Havrdová L., Černý K., Pešková V. (2013). Hymenoscyphus pseudoalbidus V. Queloz, C. r. Grünig, R. Berndt, T. Kowalski, T. N. Sieber et O. Holderieder (anamorfa Chalara fraxinea T. Kowalski) Nekróza jasanu. Lesnická práce 92 (6), Příloha 4 p. Havrdová, L., Zahradník, D., Černý, K., Chumanová, E., Romportl, D., Pešková, V. (2016a). Mapa potenciálního poškození lesních porostů ČR nekrózou jasanu. Specializovaná mapa s odborným obsahem. Certifikace 2. 11. 2016 MZe (osvědčení č. 60487/2016-MZE-16222/MAPA656). VUKOZ, v.v.i., Průhonice, 27 p. ISBN 978-80-87674-15-4. Havrdová L, Novotná K, Zahradník D, Buriánek V, Pešková V, Šrůtka P, Černý K. (2016b): Differences in susceptibility to ash dieback in Czech provenances of Fraxinus excelsior. Forest Pathology 46: 281 288. DOI: 10.1111/efp.12265. 46

Havrdová, L., Zahradník, D., Romportl, D., Pešková, V., Černý, K. (2017). Environmental and silvicultural characteristics influencing the extent of ash dieback in forest stands. Baltic Forestry, Special issue: Susceptibility of European Tree Species to Alien Invasive Pests, přijato. Hietala, A.M., Timmermann, V., Borja, I., Solheim, H. (2013). The invasive ash dieback pathogen Hymenoscyphus pseudoalbidus exerts maximal infection pressure prior to the onset of host leaf senescence. Fungal Ecol. 6, 302 308. Hirst, J.M. (1952). An automatic volumetric spore-trap. Ann. App. Biol. 36, 257 265. Hrabětová, M., Černý, K., Zahradník, D. Havrdová, L. (2016). Efficacy of fungicides on the in vitro growth of Hymenoscyphus fraxineus and their potential control of ash dieback in the forest nurseries. Forest Pathology, doi 10.1111/efp.12311. Kjær, E. D., McKinney, L. V., Nielsen, L. R., Hansen, L. N., Hansen, J. K. (2012). Adaptive potential of ash (Fraxinus excelsior) populations against the novel emerging pathogen Hymenoscyphus pseudoalbidus. Evolutionary Applications 5(3), 219 228. Koukol, O., Haňáčková, Z., Dvořák, M., Havrdová, L. (2016). Unseen, but still present in Czechia: Hymenoscyphus albidus detected by real-time PCR, but not by intensive sampling. Mycological Progress 15 (6), 1 9. Kowalski, T. (2006). Chalara fraxinea sp. nov. associated with dieback of ash (Fraxinus excelsior) in Poland. Forest Pathology 36, 264 270. Kowalski, T., & Holdenrieder, O. (2009). Pathogenicity of Chalara fraxinea. Forest Pathology, 39, 1 7. Leadbeater, A. (2012). Resistance Risk to Qol Fungicides and Anti- Resistance Strategies. In T. S. Thind (Ed.), Fungicide resistance in crop protection: Risk and management (pp. 141 154). Int. UK: CABI. McCartney, H.A., Fitt, B.D.L., Schmechel, D. (1997). Sampling bioaerosols in plant pathology. J. Aerosol Sci. 28, 349 364. Perkins, W.A. (1957). The Rotorod Sampler; 2nd Semiannual Report; Aerosol Laboratory Department of Chemistry and Chemical Engineering, Stanford University; CML: Stanford, CA, USA, Volume 66, p. 186. Pliūra, A., Lygis, V., Marčiulynienė, D., Bakys, R., Suchockas, V. (2014). Dynamics of genetic resistance to Hymenoscyphus pseudoalbidus in juvenile Fraxinus excelsior clones. Baltic Forestry 20, 10 27. Queloz, V., Grünig, C.R., Berndt, R., Kowalski, T., Sieber, T.N., Holdenrieder, O. (2011). Cryptic speciation in Hymenoscyphus albidus. Forest Pathology 41(2), 133 142. Stener, L.-G. (2013). Clonal differences in susceptibility to the dieback of Fraxinus excelsior in southern Sweden. Scandinavian Journal of Forest Research 28, 205 216. Tan, Y.P., Edwards, J., Grice, K.R.E. and Shivas, R.G. (2013). Molecular phylogenetic analysis reveals six new species of Diaporthe from Australia. Fungal Diversity 61(1), 251 260. Timmermann, V., Břrja, I., Hietala, A. M., Kirisits, T., & Solheim, H. (2011). Ash dieback: Pathogen spread and diurnal patterns of ascospore dispersal, with special emphasis on Norway. EPPO Bulletin, 41, 14 20. Webber, J.F. and Gibbs, J.N. (1984). Colonization of elm bark by Phomopsis oblonga. Transactions of the British Mycological Society 82(2), 348 352. 47

Příloha 1. Vyjádření Ústředního kontrolního a zkušebního ústavu zemědělského (ÚKZÚZ) ve věci možného udělení ochranných práv ke klonům olše a jasanu odolným vůči invazním patogenům 48

Příloha 2. Vyjádření Úřadu pro průmyslové vlastnictví (UPV) ve věci patentovatelnosti rezistentních klonů dřevin 49

50