Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra fyziologie rostlin Jan Petrášek Hormonal regulation of plant cell division and elongation Hormonální regulace dělení a prodlužování rostlinných buněk Souhrn disertační práce, odborný životopis a seznam publikací Praha 2007

ŠKOLITEL Doc. RNDr. Eva Zažímalová, CSc. Ústav experimentální botaniky AV ČR, Praha, Česká republika Katedra fyziologie rostlin PřFUK, Praha, Česká republika ŠKOLITEL-KONZULTANT Prof. RNDr. Zdeněk Opatrný, CSc. Katedra fyziologie rostlin PřFUK, Praha, Česká republika

OBSAH OBSAH Souhrn disertační práce 1 Summary of dissertation thesis 7 Literatura/References 13 Seznam publikovaných prací 15 Odborný životopis 23

SOUHRN SOUHRN DISERTAČNÍ PRÁCE Tato disertační práce se věnuje principům hormonální regulace dělení a růstu rostlinných buněk. Průběh buněčného dělení a růstu určuje tvar přisedlých rostlinných těl. Existence různých tvarů buněk, orgánů a potažmo celých rostlin je výrazem směrovosti při vytváření buněčné destičky na konci cytokineze a během buněčného prodlužování. Vlastní ustavení, tvoření a udržování povahy pletiva, orgánů a celého rostlinného těla během jeho vývoje, to vše je umožněno na buněčné úrovni procesy ekválního a inekválního dělení a růstu v podobě prodlužování či isodiametrického zvětšování. Vědecký výzkum v této oblasti se vždy upíral ke studiu regulačních látek, které vyvolávají snadno zachytitelnou a pozorovatelnou odpověď. Rozkrýváním mechanismu jejich účinku bylo nalézáno mnoho sloučenin či struktur, které danou odpověď zprostředkují, ale klasický koncept "hlavních regulátorů" přežil do dnešních dnů. Je jisté, že rostlinné hormony jsou typickými představiteli regulačních látek. Tyto látky jsou studovány již okolo sta let a postupně bylo a stále je zjišťováno jak široké spektrum účinků mají. Jsou syntetizovány v různých pletivech rostlinného těla a mohou být také transportovány vodivými pletivy na delší vzdálenosti. Auxiny a cytokininy - regulátory vývoje rostlin V posledních letech vedl vědecký výzkum k pochopení signálních drah, které jsou spouštěny rostlinným hormonem auxinem. Auxin (kyselina indol-3-octová, IAA) se jako endogenní růstový regulátor podílí na řízení procesů buněčného dělení, polárního prodlužování i buněčné diferenciace. Koncentrační gradienty auxinu v pletivu koordinují vývoj rostlin jak v čase tak v prostoru (shrnuto ve Woodward a Bartel, 2005). Podle současných znalostí je účinek auxinu zprostředkován jeho vazbou na specifický(é) receptor(y) (shrnuto v Badescu a Napier, 2006) s následnou aktivací řízené proteolýzy transkripčních regulátorů indukovaných auxinem (shrnuto v Leyser, 2006). Tento mechanismus představuje elegantní a účinný systém kontroly genové exprese. Působení auxinu je však daleko složitější a závisí též na jeho metabolických přeměnách a hlavně na jeho transportu z buňky do buňky. Auxin je jediným rostlinným hormonem, který může být v rostlinách transportován jedním směrem (polarizovaným způsobem) z buňky do buňky. Takový transport zprostředkuje informace o dějích v různých částech rostliny a tak umožňuje sladit průběh mnoha pochodů vývoje rostlin (shrnuto v Blakeslee a kol., 2005; Friml a Wisniewska, 2005; Fleming, 2006). Samotná polarita transportu auxinu je zajišťována nesouměrným rozmístěním auxinových přenašečů v plazmatické membráně zajišťujících přestup auxinových molekul přes membránu, a to především přenašečů auxinu ven z buňky. Mezi již charakterizovanými proteiny jsou vhodnými kandidáty pro přenašeče auxinu dovnitř buňky proteiny rodiny AUX/LAX (Bennet a kol., 1996), pro transport ven z buňky potom proteiny rodiny PIN (Paponov a kol., 2005; Zažímalová a kol., 2007) a rostlinné ortology savčích ABC-transportérů (shrnuto v Geisler and Murphy, 2006). Některé z posledně jmenovaných mohou sloužit jako transportéry auxinů dovnitř buňky, některé jako transportéry ven z buňky. Cytokininy jsou zpravidla definovány jako látky, které indukují buněčné dělení v rostlinných tkáňových kulturách za přítomnosti optimální koncentrace auxinu (Horgan, 1984). Obecně jsou cytokininy deriváty adeninu a jedná se o látky které mají řadu dalších fyziologických účinků (shrnuto v Sakakibara, 2006). Mechanismus účinku 1

SOUHRN cytokininů je založen na jejich vazbě na histidinkinázový receptor v plazmatické membráně. Jeho autofosforylace po vazbě cytokininu vyvolá následnou kaskádu fosforylačních reakcí končící fosforylací regulátorů odpovědi spouštějících transkripci určitých genů (shrnuto v Bishopp a kol., 2006). Dá se říci, že oproti auxinům nepůsobí cytokininy prostřednictvím specifické degradace proteinů, ale jsou spíše pozitivními či negativními regulátory exprese genetické informace. V porovnání s auxiny se nepředpokládá existence specializovaného způsobu transportu cytokininů přes buněčné membrány, ačkoliv existují důkazy o aktivitě malých membránových proteinů permeáz purinu, jejichž aktivita je kompetitivně inhibována cytokininy (Gillissen a kol., 2000). Modelové systémy při studiu hormonální regulace buněčného dělení a prodlužování u rostlin Poměr koncentrací cytokininů a auxinů v tkáňových kulturách určuje povahu morfogeneze a vývojových dějů vůbec. Tato skutečnost byla poprvé demonstrována v tkáňových kulturách tabáku (Skoog a Miller, 1957). Převaha cytokininů vedla k diferenciaci prýtů, převaha auxinů k prorůstání kořenů a vzájemně vyvážené hladiny obou regulátorů způsobovaly růst kalusu. Toto pojetí je dodnes platné a přesně stanovené vzájemné poměry v koncentracích auxinů i cytokininů přidávaných do médií jsou jedinými nezbytnými hormonálními faktory udržujícími opakované buněčné dělení v buněčných systémech in vitro. Pro účely studia procesů buněčného dělení a růstu jsou výhodnými modely buněčné linie kultivované v tekutých médiích. Vysoce rozpadavé linie Nicotiana tabacum, L., cv. Bright Yellow BY-2 (Nagata a kol., 1992) a cv. Virginia Bright Italia VBI-0 (Opatrný a Opatrná, 1976) představují jedny z mála, ne-li jediné modely simulující zhruba v průběhu růstového cyklu chování buněk kořenového meristému, prodlužovací zóny a dokonce kořenové čepičky (Sakai a kol., 2004). V průběhu životního cyklu takové kultury můžeme chápat probíhající buněčné dělení a prodlužování jako zjednodušenou formu vývojového vzorce. V axiálně se dělících buňkách tabáku byla takto ukázána role auxinu při synchronizaci buněčných dělení v buněčném řetízku (shrnuto v Nick, 2006). Cíle a hlavní obrys disertační práce Hlavním cílem předkládané práce bylo přispět k pochopení procesů hormonální regulace dělení a růstu rostlinných buněk. K těmto účelů byly využity zjednodušené modely tabákových buněčných linií VBI-0 a BY-2. V těchto cytokinin-autotrofních liniích je možné intenzitu a polaritu buněčného dělení ovlivnit změnou v koncentraci auxinu v kultivačním médiu. Účinné aktuální koncentrace auxinů a cytokininů uvnitř buněk jsou výsledkem mnoha procesů zahrnujících změny exogenních zdrojů fytohormonů, či biosyntézu, konjugaci a degradaci těchto regulátorů pocházejících z endogenních zdrojů a jejich vnitro- a mezibuněčný transport. V této práci byly změny koncentrací exogenních a endogenních auxinů a cytokininů studovány s ohledem na buněčné dělení a růst. Vzhledem k tom, co bylo naznačeno výše, tj. že směrovaný transport auxinu je v řadě případů určující pro udržování vyvážených hladin auxinu a tím pro ustavení správného vývoje tvaru určitého orgánu, byly nejdůležitější otázky, které povstaly v průběhu této práce, spojeny s mechanismem transportu auxinu. Na počátku práce jsme se však zaměřili také na zjištění poměrů exkretovaných a vnitrobuněčných cytokininů. Kapitola 1 této disertace je pokračováním práce, která započala v laboratoři školitelky, Doc. RNDr. Evy Zažímalové, CSc. Při studiu mechanismů regulujících intracelulární hladiny hormonů zde bylo zjištěno, že snížení hladiny auxinů v kultivačním 2

SOUHRN médiu vedlo k podstatnému zvýšení intracelulárních hladin biologicky aktivních cytokininů během exponenciální fáze růstu buněk VBI-0 (Zažímalová a kol., 1996). V době, kdy byla tato práce započata, nebylo mnoho údajů a tom, jak a zda-li vůbec jsou endogenní cytokininy exkretovány buňkami suspenzních kultur do kultivačního média a v jakých poměrech interní a exkretované cytokininy jsou. V této kapitole je popsáno, jak buňky VBI-0 udržují vyvážené hladiny fyziologicky aktivních cytokininů. Tyto byly uvolňovány do média během celé subkultivace a jejich koncentrace v médiu korelovaly s koncentracemi uvnitř buněk samotných. Exkrece cytokininů tedy může představovat mechanismus kontrolující zpětně jejich interní hladiny. Jak bylo zjištěno v naší další práci (Motyka a kol., 2003), indukovaná exprese genu pro isopentenyltransferasu ( vstupní enzym biosyntézy cytokininů) v suspenzních buňkách tabáku (Nicotiana tabacum, L., cv. Wisconsin 38) zvýšila exkreci cytokininů do média; navíc došlo ke zvýšení dělivé aktivity, která pak vedla ke vzniku většího množství malých buněk. Tyto výsledky naznačují existenci mechanismu(ů), který(é) reguluje(í) transport cytokininů přes buněčnou membránu. Stejně jako v případě cytokininů, i poměr mezi externími a interními koncentracemi auxinů určuje průběh buněčného dělení a růstu. V kapitole 2 je detailně popsán vztah mezi intracelulární akumulací auxinu odrážející aktuální tok auxinu buňkou a buněčným dělením v buňkách VBI-0. Již dříve bylo prokázáno (Zažímalová a kol., 1995), že snížené koncentrace auxinu v kultivačním médiu jsou vyrovnávány zvýšenou syntézou endogenní IAA. V této práci je poprvé na buněčné úrovni popsán účinek inhibitoru polárního transportu auxinu, kyseliny 1-naftylftalamové (NPA). NPA zvyšovala u buněk VBI-0 akumulaci auxinu (v podobě značené kyseliny naftalen-1-octové, [ 3 H]NAA) a současně docházelo k dočasné inhibici dělivé aktivity. Po překonání této inhibice byly pozorovány poruchy v orientaci buněčného dělení vyvolávající malformace buněčných řetízků. Tyto údaje svědčí pro to, že hypotetický regulační protein, který váže NPA, se může podílet na správném (polárním) umísťování přenašeče auxinu z buňky v určitém místě plazmatické membrány. Protokol pro měření akumulace různých auxinů buňkami, založený na postupu podle Delbarre a kol. (1996) byl upraven pro buňky VBI-0 a jeho postup byl publikován v Zažímalová a Petrášek (2000). Kapitola 3 je příspěvkem k výzkumu mechanismu(ů), jakým působí fytotropiny, tj. látky schopné narušit polární transport auxinu. V buňkách BY-2 byly porovnávány účinky fytotropinu NPA a inhibitoru vezikulárního transportu brefeldinu A (BFA) na transport auxinu a současně na stav buněčných struktur cytoskeletu a endoplasmatického retikula. Obě tyto látky silně snižovaly transport auxinu z buňky, BFA však na rozdíl od NPA v daném časovém horizontu silně narušil také aktinové a endomembránové struktury. Tyto výsledky spolu s koncentračními závislostmi ve vztahu k exportu auxinů z buněk naznačují, že působení NPA a možná i dalších fytotropinů na transport auxinů není zprostředkováno inhibičním účinkem na vezikulární transport obecně (Geldner a kol., 2001), ale že tyto látky velmi specificky inhibují proteiny exportující auxin z buněk. Navíc naše data ukazují na důležitou roli aktinových filament a možná endomembrán při transportu membránových váčků a v cyklování vlastního transportéru auxinu z buňky. Vedle výše zmíněných rolí fytotropinů může být regulace aktivit auxinových transportérů pod kontrolou auxinu samotného. Ovlivnění vnitrobuněčné translokace proteinů je totiž jedním z možných mechanismů, kterým signální molekuly mohou kontrolovat chování buněk. V živočišných buňkách je taková regulace často založena na tzv. konstitutivním cyklování proteinů, které sestává z opakovaných internalizací proteinů z plazmatické membrány a jejich recyklování zpět. Ačkoliv několik proteinů, včetně proteinů PIN, podléhá u rostlin konstitutivnímu cyklování, žádná hormonální 3

SOUHRN regulace takového procesu nebyla dosud u rostlin prokázána. V kapitole 4 je taková regulace naznačena. Mezi jinými důkazy jsou výsledky našich experimentů s buňkami VBI-0 a BY-2. Předpůsobení syntetickým auxinem, kyselinou 2,4-dichlorfenoxyoctovou (2,4-D, která je v buňkách BY-2 slabým substrátem pro transportér auxinu ven z buňky), na tyto buňky významně zvýšilo výtok auxinu, který je v buňkách BY-2 naopak dobrým substrátem pro transportér auxinu ven z buňky (NAA), z buněk a současně zrušilo inhibiční účinek BFA. Toto naznačuje, že auxin stimuluje svůj vlastní export z buněk tím, že ovlivní vezikulární transport proteinů PIN: inhibice internalizačního kroku jejich konstitutivního cyklování vede k vyššímu množství proteinů PIN na plazmatické membráně a tím i k vyšší kapacitě exportu auxinu z buněk). Takto může auxin regulovat množství svých vlastních transportních molekul na membráně. Rostlinná pletiva jsou velmi obtížně přístupná pro přímé měření akumulace auxinu v buňkách. To je jeden z důvodů, proč až doposud chyběl jasný důkaz, že proteiny rodiny PIN jsou opravdovými přenašeči auxinu ven z buňky. V kapitole 5 je v buňkách BY-2 detailně popsána rychlost-limitující funkce těchto proteinů. Navíc je ukázáno, že proteiny PIN zprostředkovávají transport auxinu ven z buněk i v heterologních systémech savčích buněk a kvasinek. Fenotyp podmíněných aktivačních transformantů a kvantitativní měření akumulace auxinu v Arabidopsis a tabákových buňkách naznačují, že působení proteinů PIN v transportu auxinu je odlišné od role proteinů PGP, že limituje rychlost transportu auxinu, je specifické pro auxiny a citlivé na inhibitory jejich transportu. Toto vše naznačuje, že proteiny PIN jsou přímo zahrnuty v procesu přenosu auxinu z buněk, velmi pravděpodobně jako vlastní přenašeče. Kapitola 6 byla publikována v knize věnované tabákové buněčné linii BY-2 jako modelovému systému v biologii rostlin. Tento příspěvek shrnuje a diskutuje současný stav poznání na poli auxinového transportu a zejména tu část, která byla objasněna pomocí tabákových buněčných linií. Vyzdviženy jsou zejména jejich výhody při studiu takových procesů, jako jsou buněčné dělení a prodlužování a také ustavení buněčné polarity. Na obr. 3 této kapitoly je shrnutí našich posledních výsledků. Ukazuje fenotypové změny buněk, které byly pozorovány v reakci na nadprodukci proteinů PIN a které byly dříve popsány jako reakce na auxinové hladovění. Jedná se o zastavení buněčného dělení, tvorbu škrobových zrn a stimulaci buněčného prodlužování. Důležité přitom je, že aplikace NPA, stejně tak jako zvýšené koncentrace přidávaných auxinů odvrátily všechny tyto projevy. To jasně ukazuje, že příčinou těchto fenotypových projevů byly změny v aktivitě přenašeče auxinu ven z buněk. Kapitoly (publikované původní práce) tvořící disertační práci Kapitola 1 Exkrece cytokininů do kultivačního média u buněk tabáku kultivovaných v buněčné suspenzi Jan Petrášek, Alena Březinová, Josef Holík, Eva Zažímalová Plant Cell Reports 21, 97-104, 2002 Dynamika koncentrací jednotlivých cytokininů byla stanovena současně v buňkách a v kutivačním médiu během subkultivačního intervalu buněčné suspenze Nicotiana tabacum L., linie VBI-0. Obsah cytokininů v kultivačním médiu byl méně než 1 pmol/ml suspenze. V pozdní stacionární fázi růstu zde docházelo k významnému nárůstu koncentrace izopentenyladenozinu, dihydrozeatinu a jeho ribozidu. Při vztažení hodnot na buněčný počet byly koncentrace cytokininů zeatinového a izopentenyladeninového typu v buňkách a v médiu maximální na počátku subkultivačního intervalu a poté postupně klesaly. Cytokininy byly exkretovány z buněk během celého subkultivačního intervalu a jejich koncentrace v médiu vždy 4

SOUHRN přibližně korelovala s koncentrací cytokininů v buňkách. Exkrece tak může představovat jeden z mechanismů kontrolujících endogenní hladinu cytokininů. Kapitola 2 Aktivita přenašeče auxinu z buněk a akumulace auxinu regulují buněčné dělení a polaritu v buňkách tabáku Jan Petrášek, Miroslav Elčkner, David A. Morris, Eva Zažímalová Planta 216, 302-308, 2002 Dělení a růst většiny typů rostlinných buněk kultivovaných in vitro vyžaduje externí zdroj auxinu. V takových kulturách poměr koncentrací externího a interního auxinu určuje průběh životního cyklu. V této práci byla interní koncentrace auxinu v suspenzních kulturách tabáku Nicotiana tabacum L. kmene VBI-0 cíleně změněna buď (i) desetinásobným zvýšením koncentrace kyseliny naftalen-1-octové (NAA) a 2,4- dichlorfenoxyoctové a nebo (ii) přidáním inhibitoru přenosu auxinu z buněk kyseliny 1- naftylftalamové (NPA). Obě tato působení oddálila počátek buněčného dělení o 6-7 dnů bez snížení buněčné viability. V obou případech se buněčné dělení opět obnovilo současně se snižující se schopností buněk akumulovat [ 3 H]NAA z externího média. Polarita buněčného dělení po jeho obnovení byla u podstatné části buněk ovlivněných NPA narušena, zatímco po zvýšení koncentrace auxinů k tomuto efektu nedošlo. Tyto výsledky naznačují, že zvýšení koncentrace auxinu nad kritickou mez inhibuje buněčné dělení, zatímco buněčná elongace probíhá dále a že směrované ukládání auxinových přenašečů na plazmatickou membránu může regulovat orientaci buněčného dělení. Kapitola 3 Inhibují fytotropiny transport auxinu z buněk narušením vezikulárního transportu? Jan Petrášek, Adriana Černá, Kateřina Schwarzerová, Miroslav Elčkner, David A. Morris, Eva Zažímalová Plant Physiology 131, 254-263, 2003 Fytotropiny, jako například kyselina 1- naftylftalamová (NPA), jsou látky, které silně snižují polární transport auxinu. Mechanismus tohoto snížení však není znám. Přenos auxinu ven z buněk je také silně potlačován inhibitorem vezikulárního transportu, brefeldinem A (BFA). S využitím suspenzních interfázových buněk tabákové buněčné linie BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow) jsme porovnávali účinek NPA a BFA na akumulaci auxinu a na uspořádání cytoskeletu a endoplasmatického retikula (ER). Snížení přenosu auxinu z buněk (zvýšení čisté akumulace) způsobené jak NPA tak i BFA se projevilo okamžitě bez znatelné prodlevy. NPA neměla žádný pozorovatelný účinek na uspořádání mikrotubulů, aktinových filament a ER. Její inhibiční účinek na přenos auxinu z buněk tedy nebyl zprostředkován narušením cytoskeletu a ER. Naproti tomu BFA způsobil podstatné změny v uspořádání aktinových filament a ER, které zahrnovaly shlukování aktinu v perinukleární cytoplazmě. NPA snižovala přenos auxinu z buněk s daleko větší účinností než BFA. To znamená, že část auxinových přenašečů citlivých na NPA může být chráněna proti účinku BFA. Maximální snížení přenosu auxinu z buněk se projevovalo při použití koncentrací NPA, které byly podstatně nižší, než koncentrace, které jsou uváděny v recentní literatuře jako koncentrace nezbytné k narušení vezikulárního transportu. Nenalezli jsme žádný důkaz, který by podporoval nedávné náznaky, že působení inhibitorů transportu auxinů je zprostředkováno celkovým snížením vezikulárního transportu směrem k plazmatické membráně. Kapitola 4 Auxin inhibuje endocytózu a podporuje svůj vlastní export z buněk Tomasz Paciorek, Eva Zažímalová, Nadia Ruthardt, Jan Petrášek, York-Dieter Stierhof, Jürgen Kleine-Vehn, David A. Morris, Neil Emans, Gerd Jürgens, Niko Geldner, Jiří Friml Nature 435(7046), 1251-1256, 2005 5

SOUHRN Jedním z mechanismů, kterým signální molekuly mohou regulovat fungování buňky, je ovlivnění vnitrobuněčného transportu proteinů. Tento způsob regulace je často založen na specializovaném vezikulárním transportu, tzv. konstitutivním cyklování. Tento proces sestává z opakující se internalizace proteinů a jejich transportu zpět na plazmatickou membránu (PM). U rostlin nebyl žádný obdobný mechanismus působení hormonů dosud prokázán, i když některé proteiny, včetně regulátorů přenosu auxinů z buňky přes PM typu PIN, konstitutivně cyklují. Tato práce ukazuje, že auxin, jeden z hlavních regulátorů vývoje rostlin, inhibuje endocytosu. Tento účinek je specifický pro biologicky aktivní auxiny a zahrnuje aktivitu proteinu BIG, příbuzného Calossinu. Auxin inhibuje internalizační krok konstitutivního cyklování proteinů PIN a tím zvyšuje výskyt těchto proteinů na PM. Takto auxin podporuje svůj vlastní export z buněk mechanismem závislým na vezikulárním transportu. Asymetrická translokace auxinu během gravitropní odezvy navíc koreluje se sníženou internalizací proteinů PIN. Tato pozorování odrážejí dosud nepopsaný mechanismus působení rostlinných hormonů: auxin reguluje transport proteinů PIN a tím i jejich výskyt a aktivitu na buněčném povrchu, čímž může zpětně regulovat svůj vlastní transport. Kapitola 5 Proteiny PIN vymezují rychlost přenosu auxinu z buněk Jan Petrášek, Jozef Mravec, Rodolphe Bouchard, Joshua J. Blakeslee, Melinda Abas, Daniela Seifertová, Justyna Wiśniewska, Zerihun Tadele, Martin Kubeš, Milada Čovanová, Pankaj Dhonukshe, Petr Skůpa, Eva Benková, Lucie Perry, Pavel Křeček, Ok Ran Lee, Gerald R. Fink, Markus Geisler, Angus S. Murphy, Christian Luschnig, Eva Zažímalová, Jiří Friml Science 312, 914-918, 2006 Mezibuněčný transport fytohormonu auxinu je základem pro mnohé vývojové procesy u rostlin. Klíčovými faktory pro tyto procesy jsou proteiny PIN, specifické pro rostliny, a některé transportéry typu PGP. Molekulární funkce proteinů PIN však dosud není známa. V naší práci jsme prokázali, že proteiny PIN umožňují export auxinových molekul z kvasinek a savčích buněk, aniž by zde byly třeba další rostlinné faktory. S využitím indukovatelné exprese a kvantitativních měření akumulace auxinů v buňkách Arabidopsis a tabáku kultivovaných in vitro jsme objasnili, že působení proteinů PIN se liší od působení transportérů typu PGP, vymezuje rychlost přenosu auxinů z buněk, je specifické vůči auxinům a citlivé vůči inhibitorům transportu auxinu. Tyto poznatky svědčí pro přímou funkci proteinů PIN v katalyzování exportu auxinů z buněk. Kapitola 6 Buněčná linie tabáku BY-2 jako nástroj pro studium transportu auxinu Jan Petrášek, Eva Zažímalová Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 58 "Tobacco BY-2 Cells: From Cellular Dynamics to Omics", Nagata, T., Matsuoka, K., Inzé, D. (eds), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 107-115, 2006 Transport auxinu hraje klíčovou roli při řízení růstu a vývoje rostlin. Probíhá buď v apoplastu hromadným tokem společně s dalšími metabolity a/nebo je auxin transportován z buňky do buňky pomocí přenašečů uspořádaných polárním způsobem. Výzkum na úrovni celistvých rostlin představuje největší příspěvek k pochopení fyziologie a molekulární podstaty polárního toku auxinu. Během posledních několika let se pro pochopení buněčné podstaty toku auxinu velmi dobře osvědčila buněčná linie tabáku BY-2. V této kapitole jsou shrnuty čerstvé poznatky o molekulárním mechanismu transportu auxinu a jsou diskutovány s ohledem na roli auxinu ve vývoji rostlin. Výsledky dosažené s využitím tabákové linie BY-2 a dalších buněčných linií ukazují jasně na výhody takových modelů při výzkumu auxinem regulovaných procesů jako je buněčné dělení, prodlužování a ustavení buněčné polarity. 6

SUMMARY SUMMARY OF DISSERTATION THESIS This thesis is focused on the hormonal regulation of plant cell division and growth. Both these processes are crucial in shaping sessile plant body. The manifestation of directionality in cell plate formation during cytokinesis as well as in cell elongation could be found in a form of various shapes of cells, organs and whole plants. Equal and inequal cell division, cell elongation and isodiametric cell growth - they all allow establishing, forming and maintaining character of tissues, organs and whole bodies during plant development. Scientific research has always been focused on regulatory compounds, the action of which induces detectable and observable responses. By uncovering the exact mechanisms of their mode of action, many intermediate messengers were found. However, classical concept of major regulators survived until these days. Indeed, plant hormones, small organic molecules with wide range of effects, are typical representatives of such compounds, which are studied already around one hundred years. They are synthesised and utilised in various tissues throughout the whole plant and they could be transported in vasculature to long distances. Auxins and cytokinins regulators of plant development The research of recent years contributed remarkably to the understanding of signalling cascades triggered by plant hormone auxin. Auxin (indole-3-acetic acid, IAA) as an endogenous plant compound participates on control of cell division, polar elongation and differentiation. Gradients of auxin concentration in a tissue coordinate both spatial and temporal aspects of plant growth and development (review by Woodward and Bartel, 2005). According to present knowledge, the mechanism of action of auxin includes its binding to specific binding protein(s) (review by Badescu and Napier, 2006) and subsequent activation of nuclear proteasome-mediated specific degradation of auxin-inducible transcriptional regulators (review by Leyser, 2006). This mechanism represents an elegant and efficient control of gene expression. However, auxin action is much more complex and depends on the metabolism and cell-to-cell transport of auxin molecules. Auxin is the only plant hormone that undergoes polarized transport in the cell-to-cell manner and this transport coordinates many processes of plant development (recent reviews by Blakeslee et al., 2005; Friml and Wisniewska, 2005; Fleming, 2006). The polarity of auxin transport is provided by the asymmetric distribution at the plasma membrane of auxin influx and mainly efflux carriers for which good candidates were proposed and extensively studied. These include auxin influx facilitators of AUX/LAX family (Bennett et al., 1996), auxin efflux facilitators of PIN family (reviewed by Paponov et al., 2005) and plant orthologs of mammalian ABC-type transporters of MDR/PGP family (review by Geisler and Murphy, 2006), members of which might serve as either auxin influx or auxin efflux facilitators. Cytokinins, often defined as substances promoting cell division in plant tissue cultures with optimal concentration of auxins (Horgan, 1984), are adenine derivatives with pleiotropic physiological effects (Sakakibara, 2006). Their mechanism of action is based on their binding to receptor histidine kinase and subsequent autophosphorylation of receptor molecule and phosphotransfer protein followed by phosphorylation of response regulator that initiates transcription of cytokinin response genes (review by Bishopp et al., 2006). So, in contrast to auxin, cytokinins do not act via specific 7

SUMMARY degradation but their response regulators are positive or negative regulators of a specific expression. Although there are some evidences about the existence of small purine permease, activity of which is competitively inhibited by cytokinins (Gilliseen et al., 2000), a possible directional cell-to-cell transport of cytokinins has not been demonstrated. Simplified models for studying hormonal regulation of plant cell division and elongation When studying the hormonal regulation of cell division and growth, various cultures of in vitro propagated organ, tissue or cell cultures are often used. These models allow investigation of morphogenetic processes leading to particular organogenesis. Auxins and cytokinins are among the most intensively studied plant hormones and their balanced levels in tissue culture are determining pattern of development. Morphoregulatory effect of auxin-cytokinin ratio was described in tobacco tissue culture, where more cytokinins induced shooting, more auxins rooting and balanced levels of both regulators induced callus formation (Skoog and Miller, 1957). Today, this concept is still valid and balanced levels of exogenously applied auxins and cytokinins are used as the only essential hormonal factors maintaining repeated cell division in cell cultures. With respect to processes of cell division, growth and elongation, cell lines cultured in liquid medium could serve as suitable models. Highly friable cell lines of Nicotiana tabacum, L., cv. Bright Yellow BY-2 (Nagata et al., 1992) and cv. Virginia Bright Italia VBI-0 (Opatrný and Opatrná, 1976) are among only very few models, if not the only ones, which simulate in their growth phases roughly the behaviour of meristematic, elongating and even root cap cells (Sakai et al., 2004). In the life cycle of such cell culture, cell division and cell elongation are manifested as the simplified example of patterning process. Using models of axially dividing tobacco cultured cells it was nicely shown that plant hormone auxin actually synchronizes pattern of cell division (Nick, 2006). Objectives and outlines of this thesis The main objective of the work presented in this thesis was to contribute to the understanding of hormonal regulation of plant cell division and growth. For this purpose, simplified models of tobacco cell lines VBI-0 and BY-2 were chosen. In these cytokininautotrophic cell lines, cell division intensity as well as its polarity could be manipulated by changing the exogenous supply of auxin. Effective actual concentrations of auxins and cytokinins inside cells result from many processes. These include changes of exogenous sources of phytohormones, biosynthesis, conjugation and degradation of endogenous phytohormones and their intracellular and intercellular transport. Changes of both exogenous and endogenous auxin and cytokinin levels were studied with respect to processes of cell division and growth. Major questions that have been raised in this thesis are connected with the mechanism of auxin transport, because as stated above it appeared to be critical for maintenance of balanced auxin levels and thus for keeping proper cell and organ polarity. However, at the beginning of the work, cytokinins as necessary partners of auxins were addressed, and their secretion into the cultivation medium in relation to cell development was studied. Chapter 1 of this thesis is actually the continuation of work started in our laboratory by my supervisor, Dr. Eva Zažímalová. During the studies of regulation of internal levels of hormones it was observed that decreasing auxin levels in the cultivation medium resulted in the substantial increase of levels of biologically active cytokinins during 8

SUMMARY exponential phase of growth of VBI-0 cells (Zažímalová et al., 1996). At the time, when the work started, there were not many evidences about possible release of endogenous cytokinins into the cultivation medium as well as about the proportion of endogenous and released cytokinins. In this chapter, we describe how cells of the cytokininautonomous tobacco cell line VBI-0 keep balanced levels of physiologically active cytokinins. Cytokinins were excreted from the cells during the whole subcultivation period, and their concentrations in the cultivation medium were found to be approximately in proportion to their momentary levels inside the cells. The excretion might thus represent one of the mechanisms controlling endogenous cytokinin concentrations. As it was shown in our following work (Motyka et al., 2003), inducible expression of isopentenyl-transferase gene (encoding the key enzyme of cytokinin biosynthesis) in tobacco suspension cells (Nicotiana tabacum, L., cv. Wisconsin 38) led to the increase of cytokinin excretion into the cultivation medium. Moreover, overproduction of cytokinins resulted in increased cell division activity resulting in higher number of smaller cells. These results strongly suggest the existence of regulatory mechanisms controlling transport of cytokinins across plasma membrane. Similar way as for cytokinins, the ratio of external to internal concentration of auxins is crucial for the regulation of plant cell division and growth. In Chapter 2, a description of relationship between auxin accumulation (reflecting actual auxin flow through the cell) and cell division in tobacco VBI-0 cell line is presented. It was shown earlier (Zažímalová et al., 1995) that decreased levels of auxin in the cultivation medium are compensated by increased production of endogenous auxin IAA. In this work we have described for the first time at cellular level the effect of 1-naphthylphthalamic acid (NPA; an inhibitor of polar auxin transport on the level of auxin afflux) on cell division polarity. The application of NPA to tobacco VBI-0 cells results in increased accumulation of [ 3 H]NAA (naphthalene-1-acetic acid) in cells and temporary and reversible inhibition of cell division activity. Partial loss of cell polarity and disturbed orientation of cell division were observed when cell division activity resumed. The data suggest that an NPAbinding regulatory protein is involved in directing of proper localisation of auxin efflux carrier to specific regions of the plasma membrane. The protocol for the measurement of auxin transport characteristics based on the method by Delbarre et al (1996) was adapted for VBI-0 cells and described in detail in Zažímalová and Petrášek (2000). Chapter 3 is the contribution to the research on the mechanism of action of phytotropins, inhibitors of auxin transport, and how they regulate cell division polarity. We have compared the effect of phytotropin (NPA) and vesicle trafficking inhibitor brefeldin A (BFA) on both auxin transport and cellular structures (cytoskeleton, endoplasmic reticulum) in tobacco BY-2 cells. Both these compounds strongly decreased auxin efflux, but BFA in contrast to NPA had substantial structural impact on structures of actin cytoskeleton and membranes of endoplasmic reticulum. This observation together with concentration relationships suggest that NPA, and perhaps other phytotropins as well, have very specific effect on putative auxin efflux carrier activity rather than they generally inhibit vesicle-mediated protein traffic to the plasma membrane (Geldner et al., 2001). Furthermore, the data emphasise the importance of actin filaments and possibly endomembranes in vesicle-mediated trafficking of proteins and in the cycling of the auxin efflux catalyst itself. Besides the above-mentioned role of phytotropins, the regulation of auxin efflux carrier activity could be, in principle, under regulatory control of auxin molecule itself. Modulation of subcellular protein translocation is actually one of the possible mechanisms, how signalling molecules can control cell behaviour. In animal and human cells this mode of regulation is often based on constitutive cycling, which consists of 9

SUMMARY repeated internalisation of proteins from and recycling them back to the plasma membrane. In spite of the fact that several plant proteins, including PINs, exhibit constitutive cycling, no such mechanism of hormone action has been shown in plants yet. In Chapter 4 a novel mode of plant hormone action is implied. The evidence came, among others, from our experiments with VBI-0 and BY-2 cells. Pre-treatment with 2,4- D, a weak substrate for auxin efflux carrier(s) in BY-2 cells, significantly increased the efflux of NAA (a good substrate for auxin efflux carriers there) and abolished the inhibitory effect of BFA suggesting that auxin stimulates its own efflux by a vesicletrafficking-dependent mechanism. By modulation of vesicle trafficking of PIN proteins, auxin regulates their incidence and activity at the cell surface, providing a mechanism for the feedback regulation of auxin transport from cells. Since plant tissues are hardly accessible for direct measurements of auxin accumulation in individual cells, until recently the evidence that PINs are real "auxin efflux catalysts" has been missing. In Chapter 5 the rate-limiting function of PIN proteins in cellular auxin efflux is described in detail in tobacco BY-2 cells. Moreover, we show here that PINs mediate auxin efflux from mammalian and yeast cells without needing additional plant-specific factors. Conditional gain-of-function alleles and quantitative measurements of auxin accumulation in Arabidopsis and tobacco cultured cells revealed that the action of PINs in auxin efflux is distinct from PGP, rate-limiting, specific to auxins, and sensitive to auxin transport inhibitors. This suggests a direct involvement of PINs in catalyzing cellular auxin efflux. Chapter 6 has been published in a book devoted to tobacco BY-2 cell line. It summarizes and discusses recent progression in the field of auxin transport that has been achieved using tobacco cultured cells. Their advantages in studies of processes such as cell division, elongation and establishment of cell polarity are highlighted. In addition to that, summary of our recent results is presented in Fig. 3 of this chapter. It describes phenotypic changes in reaction to the overproduction of PIN proteins, which were previously reported to be typical for the response to auxin depletion. These changes include the cessation of cell division, stimulation of cell elongation and amyloplasts formation. The fact that NPA as well as higher concentration of exogenous auxin were capable of preventing all observed "auxindepletion"-induced changes points out to the modification in auxin efflux after overexpression of PINs. Chapters (published papers) that form this thesis Chapter 1 Excretion of cytokinins into the cultivation medium by suspension-cultured tobacco cells Jan Petrášek, Alena Březinová, Josef Holík, Eva Zažímalová Plant Cell Reports 21, 97-104, 2002 The dynamics of individual cytokinins were determined in both the cells and the cultivation medium during the subculture interval of cell suspension cultures of Nicotiana tabacum L., line VBI-0. The amounts of cytokinins detected in the cultivation medium were less than 1 pmol ml 1 of suspension. In the late stationary phase, the levels of isopentenyladenosine, as well as that of dihydrozeatin and its riboside, increased significantly. However, when expressed per cell number, the levels of zeatin- and isopentenyladenine-type cytokinins in both the cells and medium were at a maximum at the beginning of the subculture interval and then gradually decreased. Cytokinins were excreted from the cells during the whole subcultivation period, and their concentrations in the cultivation medium were found to be 10

SUMMARY approximately in proportion to their momentary levels inside the cells. The excretion might thus represent one of the mechanisms controlling endogenous cytokinin concentrations. Chapter 2 Auxin efflux carrier activity and auxin accumulation regulate cell division and polarity in tobacco cells Jan Petrášek, Miroslav Elčkner, David A. Morris, Eva Zažímalová Planta 216, 302-308, 2002 Division and growth of most types of in vitro cultured plant cells require an external source of auxin. In such cultures, the ratio of external to internal auxin concentration is crucial for the regulation of the phases of the standard growth cycle. In this report the internal concentration of auxin in suspensioncultured cells of Nicotiana tabacum L., strain VBI-0, was manipulated either (i) by increasing 10-fold the normal concentration of 1-naphthaleneacetic acid (NAA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in the external medium; or (ii) by addition 1-N-naphthylphthalamic acid (NPA; an inhibitor of auxin efflux and of auxin efflux carrier traffic). Both treatments delayed the onset of cell division for 6-7 days without loss of cell viability. In both cases, cell division activity subsequently resumed coincident with a reduction in the ability of cells to accumulate [ 3 H]NAA from an external medium. Following renewed cell division, a significant proportion of the NPA-treated cells but not those grown at high auxin concentration, exhibited changes in the orientation of new cell divisions and loss of polarity. We conclude that cell division, but not cell elongation, is prevented when the internal auxin concentration rises above a critical threshold value and that the directed traffic of auxin efflux carriers to the plasma membrane may regulate the orientation of cell divisions. Chapter 3 Do Phytotropins Inhibit Auxin Efflux by Impairing Vesicle Traffic? Jan Petrášek, Adriana Černá, Kateřina Schwarzerová, Miroslav Elčkner, David A. Morris, Eva Zažímalová Plant Physiology 131, 254-263, 2003 Phytotropins such as 1-N-naphthylphthalamic acid (NPA) strongly inhibit auxin efflux, but the mechanism of this inhibition remains unknown. Auxin efflux is also strongly decreased by the vesicle trafficking inhibitor brefeldin A (BFA). Using suspension-cultured interphase cells of the BY-2 tobacco (Nicotiana tabacum L. cv Bright-Yellow 2) cell line, we compared the effects of NPA and BFA on auxin accumulation and on the arrangement of the cytoskeleton and endoplasmic reticulum (ER). The inhibition of auxin efflux (stimulation of net accumulation) by both NPA and BFA occurred rapidly with no measurable lag. NPA had no observable effect on the arrangement of microtubules, actin filaments, or ER. Thus, its inhibitory effect on auxin efflux was not mediated by perturbation of the cytoskeletal system and ER. BFA, however, caused substantial alterations to the arrangement of actin filaments and ER, including a characteristic accumulation of actin in the perinuclear cytoplasm. Even at saturating concentrations, NPA inhibited net auxin efflux far more effectively than did BFA. Therefore, a proportion of the NPA-sensitive auxin efflux carriers may be protected from the action of BFA. Maximum inhibition of auxin efflux occurred at concentrations of NPA substantially below those previously reported to be necessary to perturb vesicle trafficking. We found no evidence to support recent suggestions that the action of auxin transport inhibitors is mediated by a general inhibition of vesicle-mediated protein traffic to the plasma membrane. Chapter 4 Auxin inhibits endocytosis and promotes its own efflux from cells Tomasz Paciorek, Eva Zažímalová, Nadia Ruthardt, Jan Petrášek, York-Dieter Stierhof, Jürgen Kleine-Vehn, David A. Morris, Neil Emans, Gerd Jürgens, Niko Geldner, Jiří Friml Nature 435(7046): 1251-1256, 2005 11

SUMMARY One of the mechanisms by which signalling molecules regulate cellular behaviour is modulating subcellular protein translocation. This mode of regulation is often based on specialized vesicle trafficking, termed constitutive cycling, which consists of repeated internalization and recycling of proteins to and from the plasma membrane. No such mechanism of hormone action has been shown in plants although several proteins, including the PIN auxin efflux facilitators, exhibit constitutive cycling. Here we show that a major regulator of plant development, auxin, inhibits endocytosis. This effect is specific to biologically active auxins and requires activity of the Calossin-like protein BIG. By inhibiting the internalization step of PIN constitutive cycling, auxin increases levels of PINs at the plasma membrane. Concomitantly, auxin promotes its own efflux from cells by a vesicle-trafficking-dependent mechanism. Furthermore, asymmetric auxin translocation during gravitropism is correlated with decreased PIN internalization. Our data imply a previously undescribed mode of plant hormone action: by modulating PIN protein trafficking, auxin regulates PIN abundance and activity at the cell surface, providing a mechanism for the feedback regulation of auxin transport. Chapter 5 PIN proteins perform a rate-limiting function in cellular auxin efflux Jan Petrášek, Jozef Mravec, Rodolphe Bouchard, Joshua J. Blakeslee, Melinda Abas, Daniela Seifertová, Justyna Wiśniewska, Zerihun Tadele, Martin Kubeš, Milada Čovanová, Pankaj Dhonukshe, Petr Skůpa, Eva Benková, Lucie Perry, Pavel Křeček, Ok Ran Lee, Gerald R. Fink, Markus Geisler, Angus S. Murphy, Christian Luschnig, Eva Zažímalová, Jiří Friml Science 312: 914-918, 2006 Intercellular flow of the phytohormone auxin underpins multiple developmental processes in plants. Plantspecific pin-formed (PIN) proteins and several phosphoglycoprotein (PGP) transporters are crucial factors in auxin transport related development, yet the molecular function of PINs remains unknown. Here, we show that PINs mediate auxin efflux from mammalian and yeast cells without needing additional plantspecific factors. Conditional gain-of-function alleles and quantitative measurements of auxin accumulation in Arabidopsis and tobacco cultured cells revealed that the action of PINs in auxin efflux is distinct from PGP, rate-limiting, specific to auxins, and sensitive to auxin transport inhibitors. This suggests a direct involvement of PINs in catalyzing cellular auxin efflux. Chapter 6 The BY-2 Cell Line as a Tool to Study Auxin Transport Jan Petrášek, Eva Zažímalová Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 58 "Tobacco BY-2 Cells: From Cellular Dynamics to Omics", Nagata, T., Matsuoka, K., Inzé, D. (eds), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 107-115, 2006 Auxin transport plays a key role in the regulation of plant growth and development. Either it runs in apoplast by mass flow in the phloem together with other metabolites and/or there exists a parallel, cell-tocell, strictly directional, carrier-mediated active transport. The major contribution to our understanding of its physiology as well as molecular background comes from studies in planta. However, during the last ten years, tobacco cell lines such as BY-2 have provided a major impetus for precise analysis of the machinery performing auxin flow across cell membranes at the cellular level. In this chapter recent knowledge about the molecular mechanism of auxin transport is summarized, and the data are discussed in the context of recent findings concerning the role of directional cell-to-cell transport of auxin in plant development. The results obtained using BY-2 as well as other tobacco cell lines highlight the advantages of these models in studies of auxin-regulated processes such as cell division, elongation and establishment of cell polarity. 12

LITERATURA/REFERENCES LITERATURA / REFERENCES Badescu, G.O., Napier, R.M. Receptors for auxin: will it all end in TIRs? Trends Plant Sci 11: 217-223, 2006. Bishopp, A., Mähönen, AP., Helariutta, Y. Signs of change: hormone receptors that regulate plant development. Development 133: 1857-1869, 2006. Bennett, M.J, Marchant, A., Green, H.G., May, S.T., Ward, S.P., Millner, P.A., Walker, A.R., Schulz, B., Feldmann, K.A. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science 273: 948-950, 1996. Blakeslee, J.J., Peer, W.A., Murphy, A.S. Auxin transport. Curr Opin Plant Biol 8: 494-500, 2005. Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. Comparison of the mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells. Planta 198: 532-541, 1996. Fleming, A.J. Plant signalling: the inexorable rise of auxin Trends Cell Biol 16: 397-402, 2006. Friml, J., Wisniewska, J. Auxin as an intercellular Signal. In: Fleming A, editor. Annual Plant Reviews 16, Intercellular Communication in Plants, Blackwell Publishing, Oxford, 1-26, 2005. Geisler, M., Murphy, A.S. The ABC of auxin transport: The role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Letters 580: 1094-1102, 2006. Geldner, N., Friml, J., Stierhof, Y-D., Jürgens, G., Palme, K. Auxin transport inhibitors block PIN1 cycling and vesicle trafficking. Nature 413: 425-428, 2001. Gillissen, B., Burkle, L., Andre, B., Kuhn, C., Rentsch, D., Brandl, B., Frommer, W.B. A new family of high-affinity transporters for adenine, cytosine, and purine derivatives in Arabidopsis. Plant Cell 12: 291-300, 2000. Horgan, R. Cytokinins. In: Wilkins MB (ed): Advanced Plant Physiology, pp. 53-75, Pitman Publishing Limited, London, 1984. Leyser, O. Dynamic Integration of Auxin Transport and Signalling. Curr Biol 16: 424-433, 2006. Motyka, V., Vaňková, R., Čapková, V., Petrášek, J., Kamínek, M., Schműlling, T. Cytokinin-induced upregulation of cytokinin oxidase activity in tobacco includes changes in enzyme glycosylation and secretion. Physiol Plant 117: 11-21, 2003. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezava, S. Tobacco BY-2 cell line as the "Hela" cell in the cell biology of higher plants. Int Rev Cytol 132: 1-30, 1992. Nick, P. Noise Yields Order - Auxin, Actin, and polar patterning. Plant Biol 8: 360-370, 2006. Opatrný, Z., Opatrná, J. The specificity of the effect of 2,4-D and NAA on the growth, micromorphology, and the occurrence of starch in long-term Nicotiana tabacum cell strains. Biol Plant 18: 381-400, 1976. Paponov, I.A., Teale, W.D., Trebar, M., Blilou, I., Palme, K. The PIN auxin efflux facilitators: evolutionary and functional perspectives. Trends Plant Sci. 10: 170-177, 2005. Sakai, A., Miyazawa, Y., Kuroiwa, T. Studies on dynamic changes of organelles using tobacco BY-2 as the model plant cell line. In: Nagata T, Hasezawa S, Inzé D (eds) Biotechnology in agriculture and forestry Vol. 53 Tobacco BY-2 cells, Springer, Berlin Heidelberg, pp 192-216, 2004. 13

LITERATURA/REFERENCES Sakakibara, H. Cytokinins: Activity, biosynthesis, and translocation. Ann Rev Plant Biol 57: 431-449, 2006. Skoog, F., Miller, C. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental Biology, No. XI, The Biological Action of Growth Substances: 118-140, 1957. Woodward, A.W., Bartel, B. Auxin: Regulation, action, and interaction. Ann Bot 95: 707-735, 2005. Zažímalová, E., Petrášek, J. Estimation of activity of auxin uptake and efflux carriers in the cells of VBI-0 tobacco strain. Biol. listy 65: 253-257, 2000. Zažímalová, E., Opatrný, Z., Březinová, A., Eder, J. The effect of auxin starvation on the growth of auxin-dependent tobacco cell culture: dynamics of auxin reception and endogenous free IAA content. J. Exp. Bot. 46: 1205-1213, 1995. Zažímalová, E., Březinová, A., Holík, J., Opatrný, Z. Partial auxin deprivation affects endogenous cytokinins in an auxin-dependent, cytokinin-independent tobacco cell strain. Plant Cell Rep. 16: 76-79, 1996. Zažímalová, E., Křeček, P., Skůpa, P., Hoyerová, K., Petrášek, J. Polar transport of plant hormone auxin - the role of PIN-FORMED (PIN) proteins. Cell. Mol. Life Sci. (Invited paper, accepted after revision), 2007. 14