Technologické laboratoře, 3. semestr Mgr. 2017/2018 Úloha č. 321/1 Analýza čokolády a fondánových cukrovinek Vedoucí práce: doc. Mgr. Andriy Synytsya, PhD. Úkol práce: Příprava vzorků čokolády a fondánových cukrovinek, jejích analýza pomocí FTIR, Ramanovy spektroskopie, DSC a polarizačního mikroskopu Vzorky Čokoláda nebo čokoládová poleva (dobrá a s výkvětem) Fondán nebo fondánové cukrovinky 1. Diferenční skenovací kalorimetrie čokolády a fondánových cukrovinek Termická analýza je obecné označení pro skupinu experimentálních metod, při nichž se měří teplotní závislost nějaké fyzikální veličiny zkoumané látky. Za základní termoanalytické metody jsou považovány termogravimetrie a diferenční termická analýza. Dosti rozšířené a známé jsou ještě metody dilatometrie, termomechanická analýza, diferenční scanovací kalorimetrie a metody založené na uvolňování a detekci plynů. Termogravimetrie (TG) neboli termogravimetrická analýza je metoda, při které se plynule zaznamenává hmotnost vzorku zkoumané látky jako funkce teploty nebo času během jeho ohřevu nebo ochlazování kontrolovanou rychlostí. Diferenční termická analýza (DTA) je metoda, při níž se zaznamenávají teplotní rozdíly mezi vzorkem zkoumané látky a srovnávací látky jako funkce teploty během jejich současného ohřevu nebo ochlazování kontrolovanou rychlostí. Diferenční scanovací kalorimetrie (DSC) je metoda, při níž se měří energie nutná k ustavení nulového teplotního rozdílu mezi vzorkem zkoumané látky a srovnávacím vzorkem v závislosti na teplotě, jsou-li oba zahřívány nebo ochlazovány kontrolovanou rychlostí. 1
Obr. 1: Ukázka DSC křivky naměřené na přístroji DSC 131 (Setaram) a vyhodnocené programem Setsoft 2000 Na DSC (DTA) křivce (obr. 1) mohou být maxima odpovídající exotermnímu ději a minima odpovídající endotermnímu ději; občas se vyskytuje skelný přechod reprezentovaný posunem základní linie. Podle toho, při jakých teplotách nastávají endotermní a exotermní děje případně skelný přechod, je možné látky identifikovat. Plochy, které píky ohraničují, jsou přímo úměrné množství uvolněného nebo pohlceného tepla. Při vyhodnocování píku se obvykle uvádí teplota maxima píku, onset point (průsečík nulové linie a přímky proložené vzestupnou (exo děj), resp. sestupnou (endo děj) větví píku) a plocha píku Pracovní postup Vzorky zanesete do Centrálních laboratoří, budova B, suterén, místnost č. S28 (prakticky naproti dveřím do posluchačské laboratoře). K dispozici bude záznam sacharosy, fondánu a želé. Navažte 10,0 mg vzorků čokolády a fondánu do hliníkové nádobky a zavíčkujte ji. Do přístroje vložte vzorek a referenci. Za pomoci vedoucí práce naprogramujte přístroj a spusťte měření. Po skončení vyjměte kelímek se vzorkem a vyčistěte jej. 2
Obr. 2: DSC křivka tání čisté sacharosy naměřená na přístroji DSC 131 (Setaram) Podmínky DSC pro vzorky: čokoláda: -20 C až 60 C, rychlost ohřevu 5 C/min fondán: 20 C až 200 C, rychlost ohřevu 10 C/min V programu Setsoft 2000 vyhodnoťte naměřenou křivku (plocha píku, teplota maxima píku a onset point) a vytiskněte DSC křivku, kterou přiložíte k protokolu. DSC křivka tání čisté sacharózy je uvedená na obr. 2. Spočtěte obsah vody a obsah krystalů sacharózy ve fondánu na základě výsledků DSC. Z hodnoty entalpie tání sacharózy vypočtěte obsah krystalické fáze (měrná entalpie tání čisté sacharózy je hm = 126,4 J g -1 ) ve vzorku. 2. Polarizační mikroskopie vzorků fondánu Z hlediska šíření všesměrně kmitajícího světelného paprsku pevným prostředím je možné rozdělit láky na opticky izotropní a opticky anizotropní. V opticky izotropních látkách se světlo šíří ve všech směrech stejnou rychlostí a chod paprsků se řídí pouze zákony lomu. Do skupiny opticky izotropních látek spadají jednak krystaly kubické s maximálním stupněm symetrie v 3
uspořádání struktury a látky amorfní bez pravidelného uspořádání struktury. Soubor diagnostických znaků je omezen na index lomu, barvu a štěpnost. U anizotropních látek je rychlost šíření světelného paprsku závislá na směru. Při vstupu paprsku do anizotropní látky se původně všesměrně kmitající paprsek štěpí na paprsky dva, které kmitají ve dvou na sebe kolmých rovinách. To znamená, že se jedná o paprsky polarizovaného světla. Skupinu anizotropních krystalů lze dále členit podle počtu směrů, v nichž dochází k dvojlomu, na krystaly opticky jednoosé a opticky dvouosé. U krystalů soustavy hexagonální, trigonální a tetragonální, které patří ke krystalům opticky jednoosým, je takový směr jeden a je totožný s hlavní osou symetrie. V případě krystalů soustavy rombické, monoklinické a triklinické jsou tyto směry dva, řadí se proto ke krystalům opticky dvojosým. Paprsky polarizovaného světla jednoosých krystalů nejsou shodné. Jeden z nich postupuje krystalem ve všech směrech stejnou rychlostí a při vstupu do krystalu se řídí zákonem lomu. Nazývá se paprsek řádný. Druhý je od směru paprsku řádného odchýlen a jeho rychlost závisí na směru šíření. Jde o paprsek mimořádný. Naproti tomu u opticky dvojosých krystalů se oba paprsky polarizovaného světla chovají jako paprsky mimořádné. Polarizační světelný mikroskop je zobrazeny na Obr. 3. Nosnou částí celého mikroskopu je masivní stativ. Na horní části stativu je umístěn tubus, nesoucí dole objektiv a nahoře okulár. Na spodní části je upevněn stolek mikroskopu, pod ním kondenzor a zrcátko. Za zdroj světla pro silněji zvětšující objektivy se používá bodová lampa, pro měření v monochromatickém světle sodíková výbojka. Světlo je do kondenzoru přenášeno pomocí zrcátka. Kondenzor polarizačního mikroskopu má na své spodní části umístěno polarizační zařízení, polarizátor. Polarizátor může být orientován do předozadní roviny kmitu. To znamená, že lineárně polarizované světlo, vycházející z kondenzoru, kmitá v této rovině. Polarizační filtry absorbují jeden z paprsků polarizovaného světla. Dříve bývaly zdrojem polarizovaného světla Nicolovy hranoly, u nichž byl jeden z paprsků polarizovaného světla eliminován odrazem. Nad polarizátorem je umístěna aperturní clona, jejíž správné přivření je významné pro získání optimální kvality obrazu. Kondenzor soustřeďuje paprsky do preparátu. Nad kondenzorem je upevněn otočný stolek s dělením na 360, na který se připevňuje preparát a kde mohou být měřeny úhly. Na horní části stativu je upevněn tubus, který ve své dolní části nese držák objektivů. Na každém objektivu jsou vyznačeny údaje o zvětšení, numerické apertuře objektivu, délce tubu a tloušťce krycího skla. Symbol P označuje objektiv pro polarizační mikroskop. Nad objektivem je v tubě výřez pro zasunutí kompenzátorů. Nad ním je druhé polarizační zařízení, výsuvný analyzátor. Je orientován tak, že propouští světlo kmitající v rovině pravolevé. Nad analyzátorem je výsuvná Bertrandova čočka, jejíž pomocí pozorujeme konoskopický obrázek. Tubus je ukončen objímkou, do níž se zasouvá okulár. Pro 4
polarizační mikroskop musí být okulár opatřen nitkovým křížem, jehož ramena souhlasí s rovinami kmitu polarizátoru a analyzátoru. Tato poloha je nezbytná pro správné určování zhášení. Měření optických vlastností a studium materiálů v polarizovaném světle se provádí při vysunutém analyzátoru a bez Bertrandovy čočky, se zařazeným polarizátorem. Z kondenzoru vstupuje do preparátu polarizované světlo, kmitající v předozadní rovině. Tímto způsobem se zjišťují základní údaje o mikrostruktuře a textuře vzorku, prostupnost světla krystalem, jeho barva a index lomu. K získání dalších informací o mikrostruktuře a textuře a k prověření několika dalších optických vlastností krystalů je nutné přejít na pozorování ve zkřížených nikolech, tedy při zasunutém analyzátoru. Polarizované světlo, které vychází z polarizátoru, dospěje pouze k analyzátoru. Analyzátor dále světlo nepropustí, neboť je orientován kolmo na rovinu kmitu polarizátoru. Proto je zorné pole polarizačního mikroskopu bez vloženého preparátu zcela tmavé. Obr. 3: Polarizační světelný mikroskop (http://www.mikroscopyu.com) Měření ve zkřížených nikolech umožňuje rozlišit látky izotropní od anizotropních. Jestliže je ve zkřížených nikolech na stolek položena izotropní látka, zůstane při otáčením stolkem stále tmavá. Anizotropní krystaly se při otáčení stolkem o 360 čtyřikrát rozsvětlí a čtyřikrát zase zhasnou, pravidelně vždy po 90. Projevem anizotropie je tedy takzvané zhášení. Obecně dojde k zhasnutí anizotropního krystalu tehdy, když jeden z hlavních optických směrů souhlasí s rovinou kmitu polarizátoru. Pak polarizované světlo projde krystalem beze změny a je 5
zachyceno analyzátorem. V poloze, kdy hlavní optické směry nesouhlasí s rovinou kmitu polarizátoru, je anizotropní krystal světlý, zpravidla barevný. Kvantitativní stanovení fázového složení může být provedeno srovnáním se standardními obrázky různých objemových zastoupení, měřením ploch, liniovou analýzou nebo bodovou analýzou. Pro doložení zjištěných poznatků a z nich vyvozených závěrů se dříve pořizovaly mikrofotografie. Dnes se obrázky zaznamenávají digitální kamerou a uchovávají v elektronické podobě. Postup Vzorek fondánu rozetřete na mikroskopickém sklíčku s glycerolem a na polarizačním mikroskopu vyhodnoťte Váš vzorek. 3. FTIR spektroskopie Infračervená spektroskopie je založena na schopnosti látek absorbovat elektromagnetické záření v infračervené oblasti (4000 400 cm -1 ). Pohlcení kvanta infračerveného (IČ) světla vede k vibraci jednotlivých vazeb a skupin v molekule. IČ spektrum látky obsahuje pásy odpovídající jednotlivým vibračním přechodům, přičemž každá vazba nebo skupina má obvykle několik absorpčních pásů. Rozlišují se valenční (ν) a deformační (δ, γ) vibrace: valenční, ν mění se délka vazby deformační rovinná, δ, (kyvadlová ρ, nůžková δ) mění se úhel mezi vazbami deformační mimorovinná, γ (vějířové ω, kroutivé τ) některý atom kmitá mimo rovinu Disperzní IČ spektroskopie používá pro měření spekter monochromatické světlo získané tak, že je světelný paprsek rozložen na hranolu nebo na mřížce do svých jednotlivých barevných složek, resp. vlnových délek. Zařízení, ve kterém se vytváří monochromatický paprsek, se nazývá monochromátor. Při vlastním měření pak pomocí natáčení zrcadla prochází monochromatický paprsek proměnné vlnové délky vzorkem, se kterým reaguje a odezva je zaznamenána jako IČ spektrum, dané jako závislost absorbance (transmitance) na vlnočtu. Disperzní IČ spektrometr může být jedno- nebo dvoupaprskový. Nevýhodou disperzních spektrometrů je velký počet pohyblivých částí, malá rychlost záznamu spektra, malá optická propustnost spektrometru, rušivý vliv rozptýleného světla, absence vnitřní kalibrace přístroje a zahřívání vzorku. V současnosti se od klasického způsobu měření upouští, jelikož je tato metoda příliš pomalá. Častěji využívanou metodou je nyní IČ spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR, Fourier transformed infrared). Místo monochromatického světla se zde 6
využívá paprsek polychromatického světla. Přístroj pracuje na principu skenujícího Michelsonova interferometru (obr. 4). Vlastní interferometr se sestává ze dvou vzájemně kolmých rovinných zrcadel, upevněného a pohyblivého, a tzv. děliče svazků. Svazek paprsků dopadá na dělič, kde se dělí na dvě rovnocenné části, které postupují odděleně k oběma zrcadlům; na nich se odrážejí a na děliči se opět rekombinují. Na výstupu z děliče svazků je tak polychromatický paprsek interferovaného světla, který dopadá na vzorek. Výsledkem interakce paprsku se vzorkem je interferogram, který je sumou kosinových funkcí všech vlnových délek, které interferometrem prošly. Interferogram není použitelný pro interpretaci a tak je nutné ho převést na IČ spektrum pomocí Fourierovy transformace (FT). Vzhledem k tomu, že FT je matematická metoda, je nutné mít pro zpracování interferogramu počítač s příslušným programovým vybavením. Výhoda FT-IR spektrometru spočívá v tom, že měření netrvá dlouho, jako je tomu u klasické spektroskopie; díky softwaru se získává přímo spektrum; pokud se zvýší počet skenů, dosáhne se větší přesnosti. FTIR spektra vzorků v různém stavu lze měřit různými technikami. Každá technika vyžaduje speciální podmínky. Kyvety používané pro měření FTIR spekter plynných a kapalných vzorků musí být z materiálu, který je propustný pro IČ záření; takovým materiálem jsou halogenidy některých kovů, především alkalických. Při měření roztoků je nutné dbát na to, aby bylo použité rozpouštědlo propustné pro IČ záření v žádané oblasti. Voda se tímto jeví jako nevhodné medium, poněvadž absorbuje IČ záření v několika oblastech. Pevné vzorky, které nelze rozpustit ve vhodném rozpouštědle nebo je není možné upravit do tenké vrstvy vhodným zpracováním (roztavením, lisováním nebo připravením samonosných filmů), se obvykle upravují do nujolové suspenze nebo KBr tablet. Při nujolové technice se vzorek mísí s parafinovým olejem (nujolem) a rozetře se v achátové misce na hustou suspenzi, která se pak měří v kapilární vrstvě mezi dvěma solnými okénky. Tablety vzorku v bromidu draselném se připraví ze směsi vzorku a sušeného KBr (poměr 1 5 : 100). Tato směs se upraví tak, aby bylo dosaženo co nejjemnější konzistence, a poté se lisuje pod velkým tlakem na průhlednou tabletu. Existují techniky měření FTIR spekter, které umožňují analýzu složitých vzorků, např. prášků, vodných roztoků nebo směsí. Technikou difúzní reflektance (DRIFT, diffuse reflectance infrared Fourier transform) se měří především práškové vzorky, které nemohou být vystaveny vysokému tlaku, mezi analytem a matricí dochází k iontové výměně atd. Měření je jednoduché: na homogenní vzorek dopadá zaostřené záření ze zdroje. Toto záření se na částicích vzorku zčásti odráží a zčásti proniká, absorbované záření je buď zcela pohlceno, nebo pouze zeslabeno. Záření odražené od povrchu vzorku i záření vystupující ze vzorku je z prostoru nad vzorkem odvedeno pomocí zrcadla na detektor. Zde je záření rozděleno na několik složek a matematicky převedeno na 7
závislost hodnot log (1/R), kde R je reflektance (%), a koncentrací stanovované látky. Spojením FTIR spektroskopie se zeslabenou úplnou reflektancí (ATR, attenuated total reflectance) se dosáhlo větší dokonalosti a odstranění problémů vznikajících u difúzní reflektance (velká absorpce vody, špatná propustnost ve střední IČ oblasti). ATR je založeno na transmisi IČ záření krystalem, který je v kontaktu se vzorkem. Při každém odrazu vlna pronikne prostorem za krystal do hloubky řádově několika mikrometrů. Vzorek, jenž je v kontaktu s touto styčnou plochou, může interagovat se svazkem IČ paprsků a poskytnout absorpční spektrum. Pracovní postup Příprava vzorku a měření FTIR spekter KBr tablety Navažte asi 5 mg vzorku a smíchejte se 100 mg KBr v achátové misce. Nasypte směs do nástavce pro lisování KBr tablet a vložte do ručního lisu. Zatlačte páku a vyndejte nástavec s tabletou. Položte nástavec s čistým KBr do vzorkové komory přístroje. Naměřte pozadí. Vyměňte nástavce a naměřte spektrum tablety se vzorkem. Uložte spektrum a proveďte nutné úpravy (hlazení, korekce vlivu CO2 a vodné páry, korekce základní linie). Vytiskněte spektrum a označte polohy pásu a jejich přiřazení na základě tabulky přiřazení vlnočtů. Příprava vzorku a měření FTIR spekter HATR Naměřte pozadí (bez vzorku) a připravte přístroj ke měření vzorku. Položte vzorek na plochu nástavce (na krystal) a přitlačte, až se na obrazovce objeví výrazné spektrum. Naměřte spektrum vzorku, uložte ho a proveďte nutné úpravy (hlazení, ATR korekce a korekce základní linie). Vytiskněte spektrum a označte polohy pásu a jejích přiřazení na základě tabulky přiřazení vlnočtů. Příprava vzorku a měření FTIR spekter difúzní reflektance Navažte asi 5 mg vzorku a smíchejte se 100 mg KBr v achátové misce. Nasypte směs do nástavce pro měření. Položte nástavec s čistým KBr do vzorkové komory přístroje. Naměřte pozadí. Vyměňte nástavce a naměřte spektrum vzorku. Vytiskněte spektrum a označte polohy pásu a jejich přiřazení na základě tabulky přiřazení vlnočtů. Tabulka k interpretaci spekter bude dostupná v laboratoři. 4. Ramanova spektroskopie Ramanova spektroskopie je spektroskopická metoda analytické chemie patřící mezi metody elektromagnetické spektroskopie. Tato metoda využívá rozptyl laserového paprsku. 8
Ramanův jev nebo též Ramanův rozptyl je jev vznikající při interakci mezi fotony dopadajícího světla s vibračními stavy molekul, kdy rozptýlené záření má jinou vlnovou délku (resp. energii fotonů) než dopadající záření. Obr. 1: Laserový paprsek může s elektrony interagovat v zásadě třemi způsoby: Nejčastěji laserový paprsek excituje elektron v základním stavu do virtuálního stavu, a při návratu z virtuálního stavu zpět se vyzáří foton se stejnou vlnovou délkou, jakou měl původní foton - tzv. Rayleighův rozptyl, který nenese žádnou analytickou informaci. Pokud se elektron po excitaci do virtuálního stavu vrátí do vyšší kvantové hladiny, než z které byl předchozí elektron vyražen, vyzáří se foton s větší vlnovou délkou - tzv. Stokesovy fotony. Naopak, pokud se elektron původně nenacházel v základním stavu, ale na vyšší hladině a vrací se na základní hladinu, vyzáří se foton s menší vlnovou délkou tzv. Anti-Stokesovy fotony. Posuny frekvencí u Stokesových a Anti-Stokesových fotonů od frekvence použitého laserového zdroje nesou analytickou informaci o rozdílech jednotlivých vibračních hladin. Ramanova spektroskopie je do značné míry doplňkovou metodou k infračervené spektroskopii. Je skoro pravidlem, že pásy intenzivní v Ramanových spektrech jsou v infračervených spektrech slabé a naopak, protože: Vibrace, u kterých se vibrací mění polarizovatelnost, mají intenzivní pásy v Ramanových spektrech. Jedná se hlavně o vibrace nepolárních vazeb a skupin (C-C, C=C). Vibrace, které mění dipól molekuly, mají intenzivní pásy v infračervených spektrech. Jedná se hlavně o vibrace polárních vazeb a skupin (C-O, C=O). Z tohoto důvodu je Ramanova spektroskopie více citlivá na uhlovodíkový skelet organických molekul, přičemž infračervená spektroskopie dodává více informací o polárních látkách a funkčních skupinách. Fourierova transformace (FT) je matematická integrální transformace převádějící signál mezi časově a frekvenčně závislým vyjádřením. Slouží pro převod signálů z časové oblasti do oblasti frekvenční. Signál může být buď ve spojitém či diskrétním čase. Vzhledem k tomu, že FT je matematická metoda, je nutné mít pro zpracování výsledků počítač s příslušným programovým vybavením. Pro Ramanovu spektroskopii se používají disperzní spektrometry a spektrometry s Fourierovou transformací (FT). Hlavními součástmi spektrometru jsou: zdroj excitujícího záření (laser) vzorkovací prostor (komora) sběrná optika disperzní prvek (disperzní spektrometry) / interferometr (FT spektrometry) detektor Michelsonův interferometr (Obr. 2) se skládá z děliče paprsku a 2 zrcadel (pohyblivého a nepohyblivého). 9
Paprsek laseru dopadá pod úhlem 45 na dělič paprsku, kde se štěpí na dva paprsky. Jeden z těchto dvou paprsků se odrazí a dopadá kolmo na nepohyblivé zrcadlo, zde se odrazí zpátky a po průchodu přes dělič paprsku dopadá na vzorek. Druhý paprsek projde děličem paprsku, dopadne kolmo na pohyblivé zrcadlo, zde se odrazí zpátky a odrazí se směrem na vzorek. Oba paprsky se tedy sejdou a spolu interferují. Pokud jsou vzdálenosti zrcadel od bodu štěpení paprsku stejné (L), budou stejné i dráhy paprsků a na detektoru se oba paprsky zesílí. V případě, že pohyblivé zrcadlo se posune, dráhový rozdíl paprsků bude nenulový. V závislosti na velikosti dráhového rozdílu vznikají interferenční maxima a minima. 10