Optická (světelná) Mikroskopie pro TM I

Transkript

1 Optická (světelná) Mikroskopie pro TM I Jan.Machacek@vscht.cz Ústav skla a keramiky VŠCHT Praha

2 Osnova přednášky Typy klasických biologických a polarizačních mikroskopů Přehled součástí polarizačního mikroskopu Osvětlení, filtry Clony, kondenzor Objektivy, okuláry Kompenzátory Údržba mikroskopu

3 Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy polarizační mikroskop stereomikroskop /Nikon/

4 Technické vybavení - polarizační mikroskopy na ÚSK NIKON Eclipse E400POL Jenapol Amplival - další mikroskopy: Meopta 565, aj.

5 Technické vybavení - popis polarizačního mikroskopu - stativ - zdroj světla - kolektorová čočka - filtry - světelná clona - zrcátko - polarizátor - aperturní clona - kondenzor + otočný stolek - křížový vodič + tubus - držák objektivů - kompenzátory - analyzátor - Bertrandova čočka - okulár /microscopy primer/

6 Technické vybavení - popis polarizačního mikroskopu - stativ - zdroj světla - kolektorová čočka - filtry - světelná clona - zrcátko - polarizátor - aperturní clona - kondenzor + otočný stolek - křížový vodič + tubus - držák objektivů - kompenzátory - analyzátor - Bertrandova čočka - okuláry /microscopy primer/

7 Technické vybavení - osvětlení Dolní osvětlení - (diaskopické) - procházející světlo - průhledné preparáty, výbrusy /microscopy primer/

8 Technické vybavení - osvětlení Horní osvětlení - (episkopické) - odražené světlo - neprůhledné preparáty, nábrusy, reliéf - polopropustné zrcadlo - objektiv je zároveň kondenzorem /microscopy primer/

9 Technické vybavení - osvětlení Boční osvětlení - episkopické - odražené světlo - zvýraznění morfologie povrchu - lampa - (pro stereomikroskopy) - vláknová optika - přenos světla svazkem vláken ale i kapalinou flexibilní osvětlení, vysoká intenzita - LED kroužky na objektivy pokrytí 360 /Olympus/ /Edmund Optics/ /Olympus/

10 Technické vybavení - zdroje světla Žárovky - s wolframovým vláknem - halogenové - přibližuje se bodovému zdroji světla - nízké stejnosměrné napětí (~ 20 V), velký proud, výkon kolem 100 W - jednoduchá regulace intenzity potenciometrem - spojité barevné spektrum - barva světla se mění s teplotou vlákna - limitovaná životnost vlákna (1000 h) /microscopy primer/ /microscopy primer/

11 Technické vybavení - zdroje světla LED diody - - bodový zdroj intenzivního bílého světla - nízké stejnosměrné napětí /Edmund Optics/ - zanedbatelné teplo - regulace intenzity - vysoká životnost (10000 h) - sestavení plošných zdrojů - více principů vzniku - 1) RGB míchání 2) fosforescence /wiki/

12 Technické vybavení - zdroje světla Výbojky - rtuťová, xenonová - pro luminiscenční mikroskopy - UV oblast, ale i blízké IČ - monochromatické světlo (s filtry) - nízká životnost (200 h) /microscopy primer/

13 Technické vybavení - osvětlení Kolektorová čočka - spojka, z bodového zdroje vytváří rovnoběžné paprsky světla Polní (světelná) clona - zužuje svazek světla, eliminace odlesků - neslouží k regulaci intenzity světla - obraz se ostře promítá do roviny předmětu - okraj clony by se měl krýt s okrajem zorného pole Filtry - matový filtr - rozptyluje světlo - lepší homogenita - neutrální filtr - snižuje intenzitu světla, spektrum nemění - absorpční filtry - korekce barevného spektra např. modrý filtr pro žluté světlo žárovky bílé světlo

14 Technické vybavení - osvětlení - interferenční filtry - tenká vrstva, propustí úzký interval spektra Polarizátor - polarizační filtr - extrémně pleochroické látky, orientované polymerní molekuly - poměrně nízká propustnost, cca 38% - výklopný, otočný - většinou předozadní rovina kmitu Aperturní clona - reguluje vstupní průměr kondenzoru (vrcholový úhel kužele paprsků vystupujících z kondenzoru) - otevřená - vysoká rozlišovací schopnost, malý kontrast, malá hloubka o. - zavřená - ohybové jevy na rozhraních, vysoký kontrast - neslouží k regulaci osvětlení

15 Technické vybavení - osvětlení Kondenzor - soustřeďuje světelné paprsky do preparátu - numerická apertura (NA = n sin θ ) větší či stejná jako u objektivu - vlákno osvětlení se má ostře zobrazovat v rovině aperturní clony - kondenzory pro fázový kontrast a temné pole /microscopy primer/

16 Technické vybavení - osvětlení Köhlerův princip osvětlení - nejčastější způsob osvětlení - roviny, kde dochází k ostrému zobrazení předmětu a vlákna - roviny zobrazení vlákna lze pozorovat po vyjmutí okuláru nebo zasunutím Bertrandovy čočky /microscopy primer/

17 Technické vybavení - stolek, stativ Otočný stolek - dělení na 360, nonium 0,1, - aretace šroubem, někdy centrovatelný - křížový vodič se stupnicí - přítlačné pružiny - motorizovaný z-posuv, automatické ostření Zaostřování - šroub na hrubé a jemné ostření, mikrometrická stupnice - zaostřuje se zásadně zdola - tubus se postupně zvedá Držák objektivů - sáňkový, revolverový - 5 objektivů - centrovatelný, centrace se provádí iterativně

18 Technické vybavení - stolek, stativ Zaostřování - test zručnosti - měření tloušťky vzorku, indexu lomu

19 Technické vybavení - objektivy Objektivy - nejdůležitější součást mikroskopu - určuje kvalitu obrazu - rozdělení suché imerzní (I) - konstrukce charakteristiky: - výrobce - Nikon, Olympus, aj. - korekce objektivu - Plan, Apo, aj. - zvětšení Z 0 (4x 100x) tj. ohnisk. vzdálenost (1,5 > 20 mm) - numerická apertura - NA = n sin α, α je polovina /microscopy primer/ vstupního úhlu - délka tubusu v mm, pro nekonečnou optiku - tloušťka krycího skla, 0 pro preparáty bez skla - polarizační objektiv - (Pol, P) - menší počet čoček, nesmí být napětí - ovlivňuje dvojlom

20 Technické vybavení - objektivy - rozlišení objektivu: d = λ, λ je vlnová délka světla NA Korigované optické vady: - Aplanát korigovaná sférická vada a koma - Anastigmát korigován astigmatismus - Ortoskopický objektiv korigováno zkreslení - Achromát sférická vada a longitudinální chromatická vada pro 2λ (žlutá a zelená oblast) - Planachromát navíc zklenutí zorného pole (vhodný pro mikrofotografii) - Apochromát longitudinální chromatická vada pro 3λ - Planapochromát má navíc odstraněno zklenutí

21 Technické vybavení - objektivy Imerzní objektivy: - zvýšení numerické apertury (>1) - eliminace totálního odrazu, vyšší rozlišení - více detailů - imerze - vysoký index lomu - bromnaftalen (1,658), methylenjodid (1,740) /microscopy primer/

22 Technické vybavení - okulár Okulár - zvětšuje obraz vytvořený objektivem včetně vad - zvětšení 10x - 20x - nejčastěji Huygensův okulár (dvě spojky, obr. rovina mezi) - kompenzační okuláry - vyrovnávají vady objektivů - nitkový kříž, příp. stupnice - kamerový adaptér C-mount /microscopy primer/

23 Technické vybavení - kompenzátory - slídová destička - původně planparalelní lupínek muskovitu, kolmý k ostré středné, nyní křemen, fázové zpoždění je 1/4λ (~150 nm) - sádrovcová destička - nyní křemen, fázové zpoždění je 1λ, červenofialová barva I. řádu (~560 nm) - křemenný klín - klín vybroušený z křišťálu rovnoběžně s optickou osou plynulá změna fázového zpoždění, I. - III. řád - Berekův kompenzátor - destička kalcitu, řez kolmo k ose c, nulový dvojlom, otáčením dojde ke změně fázového zpoždění, 4 řády - Sénarmontův kompenzátor - polarizátor s 1/4λ destičkou otočenou o 45 - Bertrandova čočka - spojná čočka - umožňuje pozorování: konoskopické obrázky, vlákno osvětlení, zadní ohnisková rovina objektivu, aperturní clona - Analyzátor - otočný polarizátor se stupnicí

24 Údržba mikroskopu Prevence - chránit před kontaminací prachem, otisky prstů, zbytky vzorků - chránit před mechanickým (hrubé zacházení), chemickým (leptání) a tepelným poškozením (degradace filtrů) Údržba - servis, mazání a čištění mechanických dílů - čištění optických dílů Literatura: M. Zölffel, The clean microscope, Zeiss.

25 Údržba mikroskopu čistý mikroskop (vlevo), špína v místě polní clony (vpravo nahoře), prach na čipu kamery (vpravo dole)

26 Údržba mikroskopu 1. roztok detergentu, 2. líh, ether, n-hexan, aj. (pozor na leptání tmelů!) 2. špejle 3. balónek 4. vata, mikrovlákna

27 Údržba mikroskopu příprava vatových tamponů

28 Údržba mikroskopu správné čištění čoček