Identifikační kód projektu programu COST: LD 14078 Výroční zpráva o realizaci projektu v prvním roce řešení 2015 Příjemce účelové podpory: Ústav experimentální botaniky AV ČR, v.v.i. Další účastník projektu: Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v. v. i. Řešitel projektu: Mgr., Petr Maršík, Ph.D. Další řešitel: Ing. Ludmila Havrdová Název projektu: Metabolické interakce jasanu ztepilého a nového invazního houbového patogenu Hymenoscyphus pseudoalbidus Stručný přehled dílčích cílů projektu plněných v uplynulém období Práce v tomto období probíhaly podle stanoveného plánu. Níže je uveden stručný rozbor plnění dílčích cílů uplynulé etapy řešení. V001 Metodika kultivace a množení jasanu ztepilého v in vitro podmínkách Optimalizace mikropropagačních postupů V roce 2015 jsme se zaměřili na tyto oblasti: stabilizaci in vitro kultur vybraných klonů jasanu, vytvoření souboru in vitro kultur, odvození rostlin a indukci kalusové kultury. In vitro genobanka Je všeobecně známo, že odvození multiplikující kultury z donorové rostliny v generativní fázi je obtížné vzhledem k rozdílnému fyziologickému stavu, v porovnání s dřevinou v juvenilní fázi. U dřevin starých několik desítek let je odvození výhonových kultur velmi obtížné. U jasanu ztepilého jsou publikovány mikropropagační protokoly, kde in vitro kultury byly odvozeny z dřevin do dvaceti let, nebo byl odběr proveden z roubovanců. V roce 2015 byly primární kultury založeny podle již optimalizovaného protokolu (Šedivá et al. in print). Odběr byl proveden z dospělých stromů (stáří přibližně 50 70 let) z lokality Valeč, Novosedlo a Juliovka. V in vitro genobance jsme soustředili od začátku projektu celkem deset klonů, které pocházejí ze čtyř lokalit: Luž, Vranovice, Valeč a Juliovka. Klony jsou stabilizovány a slouží jako zdroj materiálu (Obr. 1).
Odvození souboru in vitro materiálu Pro zdárný průběh projektu a splnění výstupů projektu bylo nutné vybrané klony namnožit v dostatečném množství. Část kultur byla použita pro experimenty založené za účelem optimalizace zakořeňovací fáze (Obr. 2). Bylo zjištěno, že zakořeňovací schopnost se liší podle genotypu (5 47 %). Dále byly vytvořeny dva soubory zakořenělých rostlin v in vitro podmínkách pro pokračující experimenty zaměřené na indukci metabolické reakce u jasanu (ÚEB AV). Indukce kalusové kultury V letním období byly založeny kultury in vitro z vypreparovaných zygotických embryí za účelem indukce kalusu. Pro experimenty byla použita nezralá semena ze třech lokalit (Hlínoviště, Líska a Průhonický park). Tvorba kalusu se lišila podle původu semen (0 23 %), nejvyšší indukce kalusu byla dosažena u explantátů původem z lokality Hlínoviště (Obr. 3). Výsledky mikropropagace byly prezentovány formou minipřednášky a posteru na mezinárodní konferenci pod záštitou ISHS v SanRemu, později ve formě recenzovaného článku (viz seznam). Obr. 1: Multiplikující kultura odvozené z dospělého stromu (lokalita Vranovice)
Obr. 2: Zakořenělé rostliny odvozené ze zygotického embrya (klon, lokalita Luž) Obr. 3: Kalusová kultura odvozená ze zygotického embrya V002 Morfologická charakterizace průběhu napadení patogenem u rostlin s různou mírou rezistence Bylo provedeno vyhodnocení teplotních a vlhkostních poměrů, které mohou mít vliv na impakt patogenu H. fraxineus na výzkumných plochách (viz obr. 4). Na výzkumných plochách byly identifikovány průkazné rozdíly v hodnotách obou charakteristik. Nejteplejší jsou lokality Vranovice a Novosedlo. Průměrné ranní teploty jsou s průměrnými denními teplotami vysoce korelovány. Vlhkostní poměry lokalit (zejména ranní vlhkost vzduchu) jsou variabilnější a lokality byly jasně rozděleny do dvou homogenních skupin skupiny s vyšší ranní vzdušnou vlhkostí (Juliovka, Novosedlo, Vranovice) a s nižší (Valeč a Luž). Rozdíly
v ranních hodnotách vlhkosti korespondují s průměrnými denními hodnotami málo výrazně vlhká je pouze lokalita Juliovka. Vzdušné vlhkosti pak odpovídá průměrné poškození porostů na lokalitách. V rámci ploch jsou ale rovněž identifikovány významné rozdíly v napadení mezi jednotlivými genotypy. 19,0 locality; Nevážené průměry Současný efekt: F(4, 605)=13,495, p=,00000 Dekompozice efektivní hypotézy Vertikální sloupce označují 0,95 intervaly spolehlivosti 98 locality; Nevážené průměry Současný efekt: F(4, 605)=9,5559, p=,00000 Dekompozice efektivní hypotézy Vertikální sloupce označují 0,95 intervaly spolehlivosti 18,5 18,0 96 17,5 94 17,0 92 Td ( o C) 16,5 16,0 Hm (%) 90 15,5 88 15,0 14,5 14,0 86 84 13,5 Valec Juliovka Luz Novosedlo Vranovice 82 Valec Juliovka Luz Novosedlo Vranovice locality locality Obr. 4: Grafické vyjádření rozdílů v teplotní charakteristice (vlevo) a v průměrné ranní vzdušné vlhkosti (vpravo) na výzkumných plochách. V dalších výzkumech byla prokázána značná závislost dopadu choroby na vlastnostech prostředí. Pozitivně ovlivňuje dopad choroby např. podíl jasanu na ploše, zástin koruny, naopak negativní vliv má výška stromu a sklon terénu (p< 0,05). Jako velmi důležitý se rovněž ukázal vliv typu porostu, dalších patogenů a především vzdušné vlhkosti (p<0,05). Obr. 5: Porovnání letorostů dvou genotypů jasanu s různou citlivostí vůči H. fraxineus (lokalita Valeč).
Rovněž bylo zjištěno, že se v úrovni rezistence významně liší jednotlivé provenience jasanu (p <0,05). Zdá se ovšem, že hlavní zdroj rezistence k patogenu je přesto na úrovni genotypu než provenience, což potvrzuje i naše terénní sledování. V rámci morfologických šetření se ukazuje, že fenotypově citlivé a rezistentní genotypy se liší v morfologii výhonů či habitu korun (obr. 5 a 6). Obr. 6: Porovnání habitu dvou genotypů jasanu s různou citlivostí vůči H. fraxineus (lokalita Vranovce; vlevo rezistentní, vpravo senzitivní). V003 Stanovení metabolické odezvy jasanu na aplikaci elicitorů houbového původu Počátkem roku byly provedeny experimenty na semenáčcích jasanů rostoucích in vitro s aplikací autoklávovaných vodných extraktů mycelií Chalara a Alternaria. Posledně jmenovaná byla použita jako srovnávací houbový patogen s potenciálně rozdílnou strategií napadení a tedy i metabolickou odezvou hostitele. Bylo prováděno celkem 6 odběrů v různém časovém odstupu po aplikaci (40 min až 5 dnů), aby byla postihnuta reakce napadené rostliny v průběhu času. Na LC/MS/MS (trojitý kvadrupól) byla vyvinuta kvantifikační metoda pro přesnou analýzu celkem 20 různých sekundárních metabolitů spojených s obranou proti patogenům popsaných u jasanu (kumariny, lignany, sekoiridoidy). Dále pak byla provedena stanovení necílenou analýzou pomocí LC/MS/MS s vysokým rozlišením (Orbitrap), která ukázala výrazníé rozdíly v metabolických profilech (již po 24 hod) v extraktech listů rostlin
ošetřených Ch. fraxinea oproti neošetřeným kontrolám. Dále byly provedeny experimenty s inokulací mycélií Ch. fraxinea a dvou referenčních houbových patogenů (Fusarium, Alternaria) nanášených na spodní stranu listu jasanů in vitro pocházejících ze zdrojů rezistentních i senzitivních stromů (semena). Byly odebírány jednotlivé rostlinné orgány (listy, stonek, kořeny)extrahovány methanolem a purifikoványpomocí metody SPE vyvinuté pro tyto účely. Výsledky necílené analýzy (LC/MS/MS HRES) jsou vyhodnocovány. Seznam konkrétních výsledků a výstupů získaných v rámci realizace projektu (viz příloha 4.2.1): Příspěvek na konferenci: Šedivá J., Maršík P., Havrdová, L. Identification and micropropagation of common ash clones resistant to fungus Hymenoscypus fraxineus. In: Book of abstracts, Production and establishment of micropropagated plants. 6th International ISHS symposium, 19 24 April 2015, Sanremo, Italy. Článek v recenzovaném časopise: Šedivá J., Havrdová L., Maršík P. (2015). Micropropagation of common ash clones resistant to fungus Hymenoscyphus fraxineus. Acta Horticulturae, in print.