MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2016 KLÁRA MARKOVÁ

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Krystalizace a strukturní charakterizace stabilních variant halogenalkandehalogenasy DhaA Bakalářská práce Klára Marková VEDOUCÍ PRÁCE: Mgr. Radka Chaloupková, Ph.D. Brno 2016

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Klára Marková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Krystalizace a strukturní charakterizace stabilních variant halogenalkandehalogenasy DhaA Experimentální biologie Speciální biologie, směr Mikrobiologie a molekulární biotechnologie Mgr. Radka Chaloupková, Ph.D. Akademický rok: 2015/2016 Počet stran: 57 Klíčová slova: krystalizace proteinů, rentgenostrukturní analýza, enzymy, halogenalkandehalogenasy

Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree Programme: Field of Study: Supervisor: Klára Marková Faculty of Science, Masaryk University Deparment of Experimental Biology Crystallization and structural characterization of stable variants of haloalkane dehalogenase DhaA Experimental Biology Special Biology, specialization Microbiology and Microbiology and Molecular Biotechnology Mgr. Radka Chaloupková, Ph.D. Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: 57 Keywords: protein crystallization, X-ray structural analysis, enzymes, haloalkane dehalogenases

Abstrakt Krystalizace je proces, při kterém přechází látka z roztoku do pevné fáze. Krystalizovat lze nejen malé anorganické a organické molekuly, ale i velké makromolekuly - nukleové kyseliny a proteiny. Proteinová krystalizace spočívá v pozvolném seskupování proteinových makromolekul do symetrického uspořádání krystalu. Cílem krystalizačních experimentů je získání dostatečně velkého monokrystalu studovaného proteinu vhodného pro rentgenovou difrakční analýzu. Při analýze je krystal ozařován rentgenovým zářením, které se na krystalu rozptyluje a detekuje v podobě difrakčního obrazce. Ze získaných dat lze určit 3D strukturu proteinu s atomárním rozlišením. Znalost struktury proteinu je klíčová k pochopení jeho funkce a k následným racionálním modifikacím jeho vlastností. Tato práce je zaměřena na vysvětlení principů proteinové krystalizace, představení základních krystalizačních metod a metod používaných k následné optimalizací velikosti a kvality proteinových krystalů. V práci jsou dále představeny vlastnosti proteinových krystalů a faktory ovlivňující jejich vznik. Práce podává přehled o principu rentgenové difrakční analýzy a stanovení struktury proteinu. Modelovými enzymy představenými v této bakalářské práci jsou stabilní varianty bakteriální halogenalkandehalogenasy DhaA (DhaA115 a DhaA122). Součástí práce je návrh experimentálního designu pro produkci a krystalizaci těchto enzymových variant.

Abstract The crystallization is a process of transition of the substance from the solution into solid phase. Not only small inorganic and organic molecules, but also large macromolecules such as nucleic acids and proteins can be crystallized. Protein crystallization is slow association of the protein macromolecules to the symmetric crystal arrangement. The aim of crystallization experiments is to obtain sufficiently large single crystals suitable for X-ray diffraction analysis. During the analysis, crystal is irradiated by X-ray radiation which is scattered on crystal and detected as a diffraction pattern. From the obtained data, 3D protein structure can be determined with atomic resolution. Knowledge of protein structure is essential for understanding of protein function as well as for the further rational modifications of its properties. This thesis is focused on principles of protein crystallization, introduction of basic crystallization methods and the methods used for subsequent optimization of the size and quality of the protein crystals. The thesis describes basic properties of protein crystals and main factors affecting their formation and growth. The thesis provides information about the principle of X-ray diffraction analysis and the crystal structure determination. Model enzymes presented in this thesis are stable variants of bacterial haloalkane dehalogenase DhaA (DhaA115 and DhaA122). The thesis also includes an experimental design of production and crystallization of these enzyme variants.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala Mgr. Radce Chaloupkové, Ph. D. za odbornou pomoc při vytváření bakalářské práce, ochotu, trpělivost a cenné rady, kterými mě provázela. Chtěla bych také poděkovat prof. Mgr. Jiřímu Damborskému, Dr. za možnost stát se součástí vědeckého týmu Loschmidtových laboratoří a v neposlední řadě kolegům, kteří mě v přátelské atmosféře mnohému naučili. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 9. května 2016... Klára Marková

Obsah 1 Úvod... 11 2 Proteinová krystalizace... 12 2.1 Historický vývoj... 12 2.2 Princip krystalizace... 13 2.3 Proces krystalizace... 13 2.4 Faktory ovlivňující krystalizaci... 15 2.4.1 Teplota... 15 2.4.2 ph... 15 2.4.3 Typ a koncentrace srážecího činidla... 15 2.4.4 Aditiva... 16 2.5 Hledání krystalizačních podmínek... 17 2.6 Metody krystalizace... 18 2.6.1 Metoda sedící kapky (sitting drop vapor diffusion method)... 18 2.6.2 Metoda visící kapky (hanging drop vapor diffusion method)... 19 2.6.3 Metoda sendvičové kapky (sandwich drop vapor diffusion method)... 20 2.6.4 Metoda mikrokrystalizace pod olejem (microbatch under the oil)... 20 2.6.5 Metoda mikrodialýzy (microdialysis)... 21 2.6.6 Metoda volné difúze (free interface diffusion method)... 22 2.6.7 Metoda difúze přes překážku (counter-diffusion method)... 23 2.7 Optimalizace krystalizačních podmínek... 24 2.7.1 Očkovací techniky (seeding techniques)... 25 2.7.1.1 Mikroočkování (microseeding)... 25 2.7.1.2 Makroočkování (macroseeding)... 26 2.7.1.3 Vlasové očkování (streak seeding)... 26 2.7.1.4 Očkování příbuzným krystalem (cross-seeding)... 26 2.8 Heterogenní nukleace... 27 2.9 Vlastnosti proteinových krystalů... 27 2.9.1 Identifikace proteinových krystalů... 28 3 Proteinová krystalografie... 30 3.1 Úvod... 30 9

3.2 Příprava krystalů před difrakční analýzou... 31 3.2.1 Lovení krystalů... 31 3.2.2 Kryoprotekce krystalů... 31 3.2.3 Chlazení krystalů... 32 3.3 Difrakční analýza... 33 3.3.1 Struktura krystalů... 34 3.3.2 Braggova podmínka... 35 3.3.3 Zdroje rentgenového záření... 35 3.3.4 Detektory... 37 3.4 Řešení struktury proteinu... 38 3.4.1 Fázový problém... 38 3.4.1.1 Molekulární nahrazení (molecular replacement)... 38 3.4.1.2 Izomorfní nahrazení (isomorphous replacement)... 38 3.4.1.3 Metody anomálního rozptylu (anomalous dispersion methods)... 39 3.4.2 Mapa elektronové hustoty... 39 3.4.3 Budování modelu a zpřesňování struktury... 40 4 Halogenalkandehalogenasy... 41 4.1 Využití halogenalkandehalogenas... 41 4.2 Struktura halogenalkandehalogenas... 42 4.3 Reakční mechanismus... 44 4.4 Halogenalkandehalogenasa DhaA... 44 4.5 Stabilní varianty DhaA... 46 4.5.1 DhaA122... 46 4.5.2 DhaA115... 46 5 Návrh experimentálního designu exprese, purifikace a krystalizace DhaA122 a DhaA115... 47 5.1 Klonování a exprese... 47 5.2 Purifikace... 47 5.3 Krystalizace... 48 6 Závěr... 49 Seznam literatury... 50 10

1 Úvod Znalost struktury proteinů je zásadní pro pochopení jejich funkce a otevírá cestu k cíleným modifikacím pro účely biotechnologických, farmaceutických, medicínských či jiných aplikací. Rentgenová krystalografie je v současné době jednou z nejpoužívanějších technik k určování trojrozměrné struktury proteinů s atomárním rozlišením. Její princip je založen na difrakci monochromatického rentgenového záření na rotujícím monokrystalu, který se díky své periodické struktuře chová jako difrakční mřížka. Nezbytným předpokladem pro využití rentgenové difrakční analýzy je příprava dostatečně velkých a monokrystalů proteinu. Krystalizace proteinů je však z velké části proces empirický a zisk monokrystalů s požadovanou velikostí a kvalitou většinou představuje nejkritičtější bod v celém procesu zjišťování krystalové struktury biomolekul. Cílem této práce je literární rešerše zaměřená na metody krystalizace proteinů a jejich princip spolu s nastíněním podstaty difrakční analýzy a následné řešení struktury proteinů. Součástí bakalářské práce je i návrh experimentálního designu krystalizace dvou modelových enzymů, kterými jsou stabilní varianty bakteriální halogenalkandehalogenasy DhaA schopné degradovat toxické polutanty z prostředí. 11

2 Proteinová krystalizace 2.1 Historický vývoj Počátky krystalizace spadají do první poloviny 19. století. Friedrich Ludwig Hünefeld vydal v roce 1840 publikaci, ve které popisuje náhodný objev krystalů nalezených v krevním vzorku žížaly. Hünefeld také pozoroval malé deskové krystaly ve vysušené prasečí a lidské krvi. Jednalo se o krystalickou formu hemoglobinu, avšak bližší charakterizaci identifikovaných krystalů se nevěnoval (McPherson 1991). První záměrně provedenou a reprodukovatelnou krystalizaci hemoglobinu následně popsal německý fyziolog Otto Fünke v roce 1851. Klíčem k zisku hemoglobinových krystalů bylo postupné ředění červených krvinek rozpouštědly, např. vodou, alkoholem či éterem následované pomalým odpařováním rozpouštědla z proteinového roztoku (Giegé 2013). V roce 1855 objevil Theodor Hartig v mouce vyrobené z para ořechů další krystalické proteiny globuliny. V následujících letech byly popsány i další krystaly globulinů pocházející z rostlinných semen. V roce 1907 využil Thomas Burr Osborne svých znalostí získaných z důkladné biochemické charakterizace rostlinných globulinů a publikoval shrnující práci, ve které popsal zisk krystalů založený na extrakci proteinu z teplých roztoků solí následovaný pomalým ochlazením na pokojovou teplotu. Metodu založenou na vylučování proteinu z roztoku s vysokou koncentraci soli při pomalé regulaci ph pak uplatnil Franz Hofmeister v roce 1890 ke krystalizaci slepičího vaječného albuminu. Hofmeister byl také prvním člověkem, který systematicky studoval vliv solí na stabilitu a rozpustnost proteinů (Giegé 2013). V roce 1926 se podařilo americkému biochemikovi Jamesi B. Sumnerovi vykrystalizovat první enzym ureázu. Navíc dokázal, že čistá ureáza je protein, což byl první důkaz toho, že enzym je bílkovina (McPherson 1991). O 11 let později také úspěšně izoloval a krystalizoval katalázu. Podobnými technikami se na počátku 30. let 20. století získaly krystaly trávicích enzymů, pepsinu, trypsinu a chemotrypsinu. O to se zasloužil John Northrop, který za tento objev spolu se Sumnerem obdržel v roce 1946 Nobelovu cenu za chemii (Giegé 2013). Nejprve byla proteinová krystalizace využívána pouze jako nástroj k purifikaci proteinů. K převratu však došlo v roce 1934, když John D. Bernal spolu s Dorothy Crowfoot Hodgkinovou zveřejnili první difrakční obrazec proteinového krystalu. To znamenalo začátek strukturní biologie a rozvoj rentgenové difrakční analýzy (Giegé 2013). Od pozorování prvních proteinových krystalů uběhlo již 176 let, během kterých se krystalizace stala nedílnou součástí 12

při určování prostorové struktury proteinů. V současné době je uloženo v PDB databázi přes 110 000 proteinových struktur, z čehož přibližně 90 % z nich bylo vyřešeno metodou rentgenové krystalografie (ke dni 7. 5. 2016). 2.2 Princip krystalizace Krystalizace (růst kystalů) je druh fázového přechodu mezi kapalnou a pevnou fází sledované látky, v našem případě proteinu. Krystaly vznikají z vodného proteinového roztoku, který je přiveden do stavu přesycení (supersaturace). Supersaturace se dosáhne postupnou změnou určitých parametrů roztoku, např. změnou koncentrace proteinu, srážecího činidla (srážedla), ph, teploty a dalších (Chayen 2004). Obecně řečeno, krystalizace spočívá v hledání jednotlivých parametrů ovlivňujících vznik krystalů a v jejich následné optimalizaci, která povede k zisku kvalitních monokrystalů pro následnou difrakční analýzu (McPherson 2004). 2.3 Proces krystalizace Proces tvorby proteinových krystalů prochází třemi fázemi: Nukleací, samotným růstem a ukončením růstu (Kierzek a Zielenkiewic 2001). V první fázi je nezbytné utvoření malých nukleačních zárodků překonávajících kritickou velikost. Takové zárodky jsou stabilní a jsou schopny spontánně narůstat. U proteinových agregátů menších než je kritická velikost převažují síly působící na oddělení jednotek nad kohézními silami, a proto mají větší pravděpodobnost, že se rozpustí, než že nadále porostou. Proces nukleace má nejvyšší energetickou bariéru ze všech kroků nutných ke krystalizaci a její překonání je jednodušší při vyšší supersaturaci (García-Ruiz 2003b). Proces krystalizace proteinu popisuje tzv. fázový diagram (obr. 1), což je 2D graf znázorňující rozpustnost proteinu v závislosti na určitém parametru roztoku, většinou na koncentraci srážecího činidla. Oblast přesycení je oddělena od nenasycené oblasti pomocí křivky rozpustnosti. V nenasyceném stavu je veškerý protein rozpuštěn v roztoku, a proto nedochází ke krystalizaci. V závislosti na stupni přesycení může být oblast supersaturace rozdělena do dalších tří podoblastí: na velmi vysoké přesycení (tzv. precipitační oblast), kde molekuly vytváří amorfní agregáty, střední přesycení (tzv. labilní oblast), kde se uplatňuje jak nukleace, tak i růst krystalů a konečně na oblast nižšího přesycení (tzv. metastabilní oblast), kde je podporován pouze růst krystalů, ne však spontánní nukleace (Asherie 2004). Cílem snažení je iniciovat krystalizaci proteinu v labilní oblasti, kde se indukuje několik málo krystalizačních jader. Ty svým vyloučením způsobí snížení koncentrace proteinu v roztoku a 13

Koncentrace proteinu přesun systému do metastabilní oblasti, kde již k další nukleaci nedochází, ale pouze narůstají vzniklé zárodky (Krauss a kol. 2013). Pokud se systém po celou dobu nachází v labilní oblasti, dojde k vytvoření velkého množství malých krystalů, které se musí dále optimalizovat (Chirgardze 2001). Precipitační zóna Labilní zóna Metastabilní zóna Křivka rozpustnosti Koncentrace srážedla Oblast přesycení (supersaturace) Oblast nenasycení Obrázek 1. Fázový diagram popisující krystalizaci proteinu. Zobrazuje závislost koncentrace proteinu (rozpustnost proteinu) na koncentraci srážecího činidla. Pokud se systém dostane nad mez rozpustnosti, dochází k přesycení (supersaturaci) roztoku. Tato oblast se dále člení na metastabilní, labilní a precipitační zónu. Překresleno z McCoy 2005. Růst krystalů je oproti nukleaci poměrně dobře prozkoumaný proces (McPherson 2004). Jakmile dojde k překonání kritické velikosti zárodku, růst proteinových krystalů je již termodynamicky výhodný proces. Dochází při něm k difúznímu transportu molekul na povrch krystalu, kde se začlení do struktury a krystal narůstá do makroskopické velikosti (Durbin a Feher 1996). Na růst krystalů má vliv tzv. depoziční stupeň, který odpovídá rychlosti odčerpání pevné fáze z roztoku. Depoziční stupeň může být nízký, vedoucí k pomalému růstu krystalů, či vysoký, což způsobuje vznik mnoha drobných krystalických jader. Tato jádra rychle narůstají, avšak pouze do malé velikosti a mají různé strukturní defekty (Kutá Smatanová). Růst krystalu se přirozeně zastaví, jakmile proteinová koncentrace v roztoku klesne do bodu fázové rovnováhy mezi roztokem a krystaly (Chirgadze 2001). Terminace růstu může být způsobena také akumulací defektů či nečistot na povrchu krystalů (Kierzek a Zielenkiewic 2001). 14

2.4 Faktory ovlivňující krystalizaci Proces krystalizace proteinů ovlivňuje celá řada faktorů fyzikální, chemické či biochemické povahy. Pro různé proteiny může být vliv těchto faktorů různě důležitý. Základem úspěšné krystalizace je získat čistý proteinový vzorek, neboť jeho chemická a konformační čistota silně ovlivňuje růst krystalů. Optimální koncentrace proteinu na krystalizace se může různě lišit, a to od 2 mg ml -1 do 100 mg ml -1 (McPherson a Gavira 2014). 2.4.1 Teplota Teplota je významný fyzikální parametr ovlivňující vznik a růst proteinových krystalů. Teplota představuje relativně snadný a účinný nástroj k ovlivnění rozpustnosti a tím i supersaturace proteinů. V praxi se krystalizační experimenty s proteiny většinou provádějí ve dvou teplotách při 4 C a 20 C (Krauss a kol. 2013). Bylo zjištěno, že krystalizaci ovlivňuje nejen teplota, při které je krystalizační experiment inkubován, ale také teplota, při které se připravují krystalizační roztoky (Chen a kol. 2015). 2.4.2 ph Mezi další významné faktory ovlivňující krystalizace proteinů patří ph. Hodnota ph má vliv na protein-proteinové interakce, protože ovlivňuje vznik solných můstků či vodíkových vazeb, které jsou důležité pro vytvoření kontaktů v krystalu. Proteiny obsahují velké množství ionizovatelných skupin a proto i nepatrná změna ph může silně ovlivnit rozpustnost proteinu (Krauss a kol. 2013). Ačkoliv většina proteinů preferuje pro krystalizaci přibližně neutrální ph, proteinové krystaly byly získány z celé škály ph (McPherson a Gavira 2014). Z toho důvodu musí být při krystalizačních experimentech zkoumáno široké rozpětí ph (Krauss a kol. 2013). Postupná změna ph tak představuje jeden z efektivních způsobů optimalizace krystalizačních podmínek získaných na základě prvotního screeningu. 2.4.3 Typ a koncentrace srážecího činidla Srážecí činidla neboli srážedla jsou látky schopné snižovat rozpustnost proteinu a současně zvyšovat protein-proteinové interakce. Jsou děleny do několika základních skupin: soli, vysokomolekulární polymery a organická rozpouštědla. Efekt solí na krystalizaci proteinů je vysvětlován silnou kompeticí iontů soli (především aniontů) s molekulami proteinu o vodu, která je nezbytným předpokladem udržení rozpustnosti proteinu. Při dostatečně vysoké koncentraci solí dochází k rozrušení povrchové hydratační 15

vrstvy proteinových molekul, což má za následek jejich seskupování. V takovém prostředí mohou vznikat krystaly či amorfní sraženiny. Osvědčeným srážedlem je například síran amonný, síran litný nebo chlorid sodný (McPherson 2004). Polyethylenglykoly (PEGy) byly poprvé systematicky zkoumány jako možná srážecí činidla v roce 1976 (McPherson 1976). Jedná se o polymery s různou molekulovou hmotností (Mr 200 až 20 000). Pro krystalizace proteinů jsou nejčastěji využívány PEGy s relativní molekulovou hmotností 2000 8000. PEGy působí dehydratačně podobně jako soli a k tomu navíc snižují dielektrickou konstantu roztoku. Krystalizaci proteinu většinou indukuje relativně úzké rozmezí koncentrací PEGu, od 4 18 %, což snižuje náročnost pro prvotní screening krystalizačních podmínek (McPherson a Gavira 2014). Ačkoliv jsou při krystalizaci PEGy nejpoužívanějšími vysokomolekulárními polymery, existují také jiné vhodné polymerní srážedla s pozitivním vlivem na krystalizace proteinů, např. polyethylenglykol monomethyl či dimethyl ether nebo polyakrylát sodný (Skálová a kol. 2010, Patel a kol. 1995). Organická rozpouštědla působí obdobně jako PEGy. Snižují dielektrickou konstantu roztoku. Jak se koncentrace organického rozpouštědla zvyšuje, roste přitažlivost mezi molekulami proteinu. Z těkavých organických rozpouštědel se pro krystalizace proteinů využívá například propanol, etanol, aceton či terc-butanol, z netěkavých je to především 2- methyl-2,4 -pentadiol (MPD) (McPherson 2004). 2.4.4 Aditiva Vedle srážecího činidla, pufru a vlastního proteinového roztoku mohou krystalizační experiment ovlivnit i další látky označované jako aditiva. Jedná se většinou o nízkomolekulární sloučeniny, které interagují s makromolekulami proteinu a stabilizují jejich konformaci (Krauss a kol. 2013). Přirozenými aditivy jsou kofaktory, inhibitory, substrátové analogy, ionty kovů či prostetické skupiny. Tyto molekuly se váží do aktivního místa enzymů nebo na jiná specifická místa v proteinu. Jejich vazba podněcuje vznik stabilnější konformace či vyvolává konformační změny proteinů (McPherson a kol. 2011). Častými aditivy jsou například ionty kovů, které se u některých proteinů podílí na biologické aktivitě, a napomáhají udržovat správnou strukturu proteinu. Příkladem jsou dvojmocné kationty (Ca 2+, Mn 2+ či Mg 2+ a další), často nezbytné k tomu, aby se protein sbalil do správné konformace. (McPherson a Cudney 2014). Další skupinou aditiv jsou molekuly, které ovlivňují rozpustnost proteinu, avšak nemění fyzikálně-chemické vlastnosti. Patří sem detergenty, které jsou důležitou složkou při krystalizaci membránových proteinů. Membránové proteiny jsou díky svému hydrofobnímu 16

povrchu nerozpustné ve vodných roztocích, a proto je velmi těžké je krystalizovat. Po navázání amfipatických molekul detergentu k proteinu se však komplex stává hydrofilním a může být solubilizován. V takové formě je protein krystalizovatelný (McPherson 2004). Používanými detergenty jsou především neiontové látky, např. n-dodecyl-β-d-maltopyranosid a n-decyl-β- D-glucopyranosid. Konformaci proteinů lze stabilizovat také přídavkem tzv. cross-linkerů. Tyto malé molekuly jsou schopné reverzibilně interagovat s nabitými aminokyselinami lokalizovanými na povrchu proteinů či vytvářet intermolekulární vodíkové vazby. Mezi cross-linkery patří diamino či dikarboxykyseliny obsahující alifatické zbytky různých délek (McPherson a kol. 2011). Existuje mnoho dalších aditiv, které mohou usnadnit krystalizaci proteinů, je však těžko předpověditelné, které z nich budou klíčové právě pro daný studovaný protein, pokud aditivum neplní jasnou funkci jako např. ligandy. V současné době existují také komerční kity sestávající ze sady potencionálních aditiv. Aditiva se využívají zejména pro optimalizaci krystalizačních podmínek nebo v prvotním screeningu, pokud se krystalizace opakovaně nedaří. (McPherson and Cudney 2014). 2.5 Hledání krystalizačních podmínek Hledání vhodných podmínek vedoucích ke vzniku kvalitních proteinových krystalů probíhá v několika etapách. První zahrnuje screening velkého množství podmínek. Získané krystaly jsou následně podrobeny difrakční analýze k ověření jejich difrakční kvality (Hoffman 2012). Zpravidla se při screeningu identifikují takové podmínky, při kterých došlo ke krystalizaci, avšak vzniklé krystaly neposkytují kvalitní difrakční data (např. proteinové mikrokrystaly, srostlé jehlice, 2D krystaly atd.). Proto musí být v následujícím kroku, optimalizaci, parametry těchto podmínek systematicky modifikovány s cílem získat krystal o dostatečné velikosti a kvalitě pro difrakční analýzu (McPherson a Gavira 2014). Pro prvotní screening jsou používány především komerčně dostupné sady krystalizačních roztoků, tzv. kity. Kity sestávají z několika desítek krystalizačních roztoků, které obsahují různé kombinace pufrů, srážecích činidel, ph a jiných aditiv. Jejich použití zjednodušuje a významně urychluje screening krystalizačních podmínek. Krystalizační kity jsou obvykle sestaveny z podmínek, které v minulosti vedly k úspěšné krystalizaci jiných proteinů (Jancarik a Kim 1991). 17

2.6 Metody krystalizace Existují různé krystalizační techniky, kterými lze systém přivést do stavu přesycení a indukovat tak vznik proteinových krystalů. Mezi nejpoužívanější se řadí metody založené na difúzi par nebo metoda mikrodávek (microbatch). Právě tyto metody mohou být také dobře automatizovány, což podstatně zkracuje jinak zdlouhavý proces hledání optimálních krystalizačních podmínek a díky malým objemům šetří náklady. Automatizovat lze hned několik procesů, např. mísení a pipetování roztoků, utěsnění destiček, ale také inkubaci a monitorování růstu krystalů (Bard a kol. 2004). 2.6.1 Metoda sedící kapky (sitting drop vapor diffusion method) Metoda sedící kapky je oblíbenou technikou užívanou ke krystalizaci biomolekul. Její výhoda tkví především v rychlosti a jednoduchosti jednotlivých kroků. Princip je založen na difúzi par rozpouštědla (nejčastěji vody) z kapky obsahující roztok proteinu do matečného roztoku (rezervoáru) obsahujícího vyšší koncentraci srážecího činidla (obr. 2). Kapka, sedící ve vyvýšené jamce, vzniká smícháním proteinového roztoku s matečným roztokem (většinou v poměru 1:1), čímž se docílí nižší koncentrace srážecího činidla v kapce oproti rezervoáru. Z důvodu zachování termodynamické rovnováhy přechází vodní páry z kapky do rezervoáru. V důsledku zmenšování objemu kapky se protein stává koncentrovanějším a může dosáhnout nukleační oblasti supersaturace (Gavira 2016). Proces ustává, jakmile jsou koncentrace reagentů v kapce i v rezervoáru přibližně vyrovnány. Krycí sklo (či těsnicí páska) Kapka (protein + matečný roztok) Krystal Jamka Matečný roztok se srážedlem Obrázek 2. Schéma krystalizace proteinů metodou sedící kapky. Vodní pára z méně koncentrované kapky přechází do rezervoáru. Komponenty v kapce se tak stávají koncentrovanější a nutí systém přejít do stavu přesycení. Překresleno z Hampton Research 2001. 18

Metodu sedící kapky lze provádět manuálně v 24jamkových krystalizačních destičkách nebo automaticky v 96jamkových destičkách s použitím krystalizačního robota, který pracuje s menšími objemy (Chayen a Saridakis 2008). Objemy kapek se pohybují řádově okolo 1-2 µl pro manuální experimenty a 100 200 nl u experimentů prováděných za pomoci automatizovaných robotů (Hoffman 2012). Při zachování stejného objemu proteinového vzorku je tedy možné prověřit větší množství krystalizačních podmínek. Systém musí být nepropustně uzavřen, aby se z něj nemohly odpařovat žádné látky, proto jsou jamky krystalizačních destiček utěsněny pomocí parotěsné pásky či krycího skla (Hampton Research 2001). 2.6.2 Metoda visící kapky (hanging drop vapor diffusion method) Metoda visící kapky využívá stejného principu difúze par jako metoda sedící kapky, ovšem provedení krystalizačního experimentu je odlišné. Rozdíl spočívá v tom, že kapka nesedí v jamce, ale visí nad rezervoárem (obr. 3) (Drenth 2007). Ke krystalizačním experimentům se opět využívají 24 nebo 96jamkové destičky (Chayen a Saridakis 2008). Nad každou jamkou naplněnou matečným roztokem je zavěšena kapka na vnitřní straně krycího silikonizovaného sklíčka. Krycí sklíčko je k destičce pevně přilepeno a utěsněno pomocí silikonového oleje (Drenth 2007). Hlavní výhoda krystalizace metodou visící kapky spočívá v jednodušším přístupu krystalů při jejich lovení z kapky. Při uspořádání sedící kapky totiž může docházet k přilnutí krystalu k plastovému dnu jamky a je těžší jej oddělit. Nevýhodou je naopak větší časová náročnost při přípravě a umístění silikonizovaných krycích sklíček (Gavira 2016). Krycí sklo Kapka (protein + matečný roztok) Krystal Jamka Matečný roztok se srážedlem Obrázek 3. Schéma krystalizace proteinů metodou visící kapky. Překresleno z Hampton Research 2001. 19

2.6.3 Metoda sendvičové kapky (sandwich drop vapor diffusion method) Další krystalizační metodou založenou na difúzi par je tzv. metoda sendvičové kapky. Jak již název napovídá, kapka obsahující roztok proteinu se srážedlem je umístěna mezi dvěma silikonizovanými krycími skly. Svrchní sklíčko je větší a tvoří kryt rezervoáru. Výhodou této metody je snadné mikroskopické pozorování vniklých krystalů, naopak nevýhodou jej její větší pracnost (Hampton Research 2001). Krycí skla Kapka (protein + matečný roztok) Krystal Jamka Matečný roztok se srážedlem Obrázek 4. Schéma krystalizace proteinů metodou sendvičové kapky. Překresleno z Hampton Research 2001. 2.6.4 Metoda mikrokrystalizace pod olejem (microbatch under the oil) Batch metoda je založena na přímém smíchání proteinu s roztokem srážecího činidla. Snahou je dosáhnout labilní oblasti supersaturace přímo po smíchání proteinu a srážedla a tím indukovat vznik krystalů. Původní batch experimenty však vyžadovaly velké objemy proteinu i srážedla, a proto byly nahrazeny metodou v menším měřítku tzv. microbatch metodou (Chayen 1998). Při metodě mikrokrystalizace pod olejem se kapka roztoku proteinu a srážecího činidla pipetuje pod vrstvu parafínového oleje. Používá se parafínový olej o nízké hustotě, a proto kapka s vyšší hustotou klesá ke dnu, kde je chráněna před vypařováním a kontaminací ze vzduchu (obr. 5a). Zatímco difúzní metody jsou založeny na měnících se podmínkách v průběhu krystalizačního procesu, při mikrokrystalizaci pod olejem jsou komponenty ve finální koncentraci od začátku experimentu (Chayen a Saridakis 2008). Jelikož během inkubace neprobíhá vypařování, nedochází ani ke změně objemu kapky (Chayen 1998). Existuje také modifikace této metody využívající namísto čistě parafínového oleje směs silikonového a parafínového oleje, nebo pouze silikonový olej. Tyto oleje umožňují vodní páře přecházet z kapky přes olej a tím napomáhají zakoncentrování proteinu i srážecího činidla, což vede k přesycení roztoku a tvorbě krystalů (obr. 5b) (D Arcy a kol. 1996). Jde vlastně o typ 20

difúzní metody. Při použití této metody je možné měnit poměry parafínového a silikonového oleje a tím měnit rychlost odpařování vody z kapky (Chayen 1999). Kapku je možné pipetovat manuálně či automaticky. Mikrokrystalizace pod olejem je za použití krystalizačního robota velmi rychlou a účinnou metodou pro screening velkého množství podmínek (Bard a kol. 2004). A) Parafínový olej B) Vypařování Silikonový olej Kapka proteinu a srážecího činidla Krystal Jamka Obrázek 5. Schéma krystalizace proteinů metodou mikrokrystalizace pod olejem. (A) Při použití parafínového oleje nedochází k evaporaci vody z kapky, (B) zatímco pipetováním kapky proteinu a srážecího činidla pod vrstvu silikonového je evaporace umožněna. Překresleno z Hampton Research 2001. 2.6.5 Metoda mikrodialýzy (microdialysis) Krystalizace dialýzou využívá difúze molekul srážedla skrze semipermeabilní membránu. Membrána odděluje vzorek proteinu od matečného roztoku se srážecím činidlem a umožňuje průnik malých molekul (soli, ionty, alkoholy aj.), ne však molekulám proteinu. Koncentrace proteinu tak zůstává stabilní. K dosažení supersaturace dochází zvýšením koncentrace srážedla v okolí proteinu (Chayen a Saridakis 2008). V praxi se mikrodialýza provádí za pomoci tzv. dialyzačního knoflíku, ve kterém se nachází komůrka určená pro vzorek proteinu. Komůrka je převrstvena polopropustnou membránou upevněnou pryžovým kroužkem. V okolním rezervoáru se nachází roztok srážecího činidla (obr. 6). Výhodou mikrodialýzy je možnost rychlé změny srážecího činidla (Drenth 2007). 21

Krycí sklo (či těsnicí páska) Obrázek 6. Schéma krystalizace proteinů metodou mikrodialýzy. Překresleno z Hampton Research 2001. 2.6.6 Metoda volné difúze (free interface diffusion method) Metoda volné difúze je krystalizační technika, ve které je vzorek proteinu umístěn do skleněné kapiláry, kde se dostane do kontaktu se srážecím činidlem. V kapiláře se nejprve se mezi roztokem proteinu a srážedla vytvoří jasné rozhraní. Postupně však do sebe roztoky difundují a protein v bezprostřední blízkosti rozhraní je vystaven přechodně vysoké supersaturaci, která indukuje tvorbu nukleační zárodků. Jakmile je dosaženo rovnovážného stavu, koncentrace srážecího činidla v celkovém objemu nedosahuje dostatečné hodnoty k nukleaci dalších jader (Salemme 1972). Ke vzniku a růstu krystalů tak většinou dochází v místě původního rozhraní (obr. 7). Metoda volné difúze se provádí uvnitř malých skleněných kapilár, které jsou na obou koncích utěsněny. Tato metoda se příliš často nevyužívá. Jedním z důvodů je obtížnost, se kterou se vytváří ideálního rozhraní. Uplatňuje se však při krystalizačních experimentech v mikrogravitaci prováděných ve vesmíru (Koszelak a kol. 1995, Berisio a kol. 2000). Matečný roztok se srážedlem Dialyzační membrána Proteinový roztok Krystal Jamka Dialyzační knoflík Pryžový kroužek Roztok srážedla Roztok proteinu Krystal Obrázek 7. Schéma krystalizace proteinů metodou volné difúze. V oboustranně utěsněné kapiláře je proteinový roztok převrstven roztokem srážecího činidla. Při difúzi vzniká největší přesycení v oblasti rozhraní, kde se vytváří krystalizační jádra schopná narůstat do makroskopických rozměrů. Překresleno z Hampton Research 2001. 22

2.6.7 Metoda difúze přes překážku (counter-diffusion method) Metoda difúze přes překážku je pokročilejší metodou krystalizace proteinů, která vychází z metody volné difúze (Gavira 2016). Princip metody je založen především na přítomnosti gelové vrstvy v kapiláře nejčastěji agarózové. Gel zabraňuje proudění a sedimentaci krystalů, což poskytuje vhodné prostředí pro jejich růst (Biertümpfel a kol. 2002). Experimenty se provádějí v úzké kapiláře s různým uspořádáním jednotlivých krystalizačních složek. Proteinový roztok může být v kapiláře (o vnitřním průměru 0.1 2 mm) oddělen od roztoku srážecího činidla pomocí gelové vrstvy (Obr. 8a). Úlohou této vrstvy je zpomalit difúzní proces a vyvarovat se osmotickému šoku (Otálora a kol. 2009). Další možností je smísení gelového a proteinového roztoku. Vzniklé gelové médium je poté nasáto do kapiláry a převrstveno koncentrovaným roztokem srážecího činidla (Obr. 8b) (López-Jaramillo a kol. 2001). Přes gelovou vrstvu či gelové médium zvolna difundují molekuly srážedla, čímž se po délce kapiláry utváří gradient supersaturace (Otálora a kol. 2009). Na rozhraní nejprve vzniká amorfní precipitát nebo mikrokrystaly, poté se v délce kapiláry hodnota supersaturace snižuje a jsou získány krystaly větší velikosti a kvality (Obr. 8). Utvořený gradient zajišťuje, že v různých místech kapiláry krystaly rostou v různých hodnotách přesycení. Jediný experiment tak prověří velkou oblast fázového diagramu, což by za použití klasických krystalizačních metod odpovídalo velkému množství provedených experimentů (Krauss a kol. 2013). Metodu difuze přes přepážku lze rovněž provádět v krystalizačním boxu, jehož dno pokrývá gelová vrstva. Roztoky vzorku proteinu a srážecího činidla jsou v kapiláře umístěny tak, aby docházelo k jejich protisměrnému pronikání. Roztok proteinu je umístěný v úzké části kapiláry, jejíž spodní otvor je otevřený a vsunutý svisle do gelu. Druhý rozšířený konec kapiláry je utěsněn. Nad gelovou vrstvou se nachází srážecí roztok. Srážedlo difunduje přes gelovou vrstvu a vytváří vysokou míru přesycení ve spodní části kapiláry. Jak postupuje směrem vzhůru, hladina přesycení klesá a vytváří se menší množství kvalitnějších a větších krystalů. Celý box obsahující jednu či více kapilár je uzavřen z důvodu zabránění odpařování srážecího činidla (Obr. 8c). Toto uspořádání se nazývá Gel acupuncture method, zkráceně GAME (García-Ruiz a kol. 1993, García-Ruiz 2003a). 23

A) B) C) Krystal Těsnění Roztok Těsnění Gelová vrstva Roztok srážedla Roztok proteinu Protein + gel Roztok proteinu Těsnění Gelová vrstva Krystal Obrázek 8. Schematické znázornění krystalizace proteinů metodou difúze přes překážku prováděné v kapiláře ve třech různých uspořádáních. (A) Trojvrstevné uspořádání sestávající z vrstev srážecího roztoku, gelu a proteinového roztoku v kapiláře. (B) U dvouvrstevného uspořádání se v kapiláře nachází směs proteinu a gelu převrstvená koncentrovaným srážecím roztokem. (C) Uspořádání metody difuze přes přepážku v krystalizačním boxu s gelovým dnem Game acupuncture method sestává z několika kapilár naplněných proteinovým roztokem, které jsou zanořeny do gelové vrstvy uvnitř uzavřeného boxu. Srážedlo difunduje přes gel a na vzniklém rozhraní gel-protein vyvolává supersaturaci. Překresleno z Otálora a kol. 2009 a López-Jaramillo a kol. 2001. 2.7 Optimalizace krystalizačních podmínek Krystalizační experimenty se inkubují 1-3 měsíce, přičemž se průběh krystalizačního procesu v pravidelných intervalech mikroskopicky monitoruje. Sledování je častější prvních pár dní po ustanovení experimentu, později postačuje kontrola přibližně každých 5-7 dní. Většina krystalů však vznikne během prvních 30 dnů inkubace nebo vůbec (Hoffman 2012). Z prvotního screeningu krystalizačních podmínek většinou nevzejde proteinový krystal přímo použitelný pro difrakční analýzu (Luft a kol. 2014). Obvykle jsou identifikovány krystalizační podmínky, které umožnily vznik krystalickému materiálu, ten však z určitého důvodu nesplňuje požadavky pro rentgenostrukturní analýzu. Problémem bývá např. nedostatečná velikost krystalu, jeho morfologie či kvalita. Nalezené potenciálně vhodné krystalizační podmínky je proto nutné optimalizovat s cílem získat větší a kvalitnější monokrystaly studovaných proteinů (McPherson a Cudney 2014). Počáteční krystalizační experimenty mohou v zásadě poskytnout několik různých výsledků. Může vzniknout amorfní precipitát, mikrokrystaly až monokrystaly nebo také nemusí 24

dojít k žádné změně a krystalizační roztok zůstane čirý. Vznik amorfního precipitátu naznačuje velkou míru přesycení, naopak z čiré kapky lze vydedukovat, že se systém nachází ve stavu nenasycení či metastabilní oblasti fázového diagramu. Po identifikaci nejslibnějších krystalizačních podmínek pro daný protein se následně systematicky modifikují jejich fyzikálně-chemické vlastnosti. Mezi klíčové vlastnosti patří typ a koncentrace srážecího činidla, ph, koncentrace proteinu a teplota (Benvenuti a Mangani 2007). Optimalizovat krystalizaci lze také změnou poměru proteinového roztoku a matečného roztoku v kapce (Hoffman 2012). Pokud je na základě screeningu identifikováno větší množství krystalizačních podmínek vhodných pro optimalizaci, je přínosné porovnat jejich složení a najít společné rysy. Z porovnání lze vydedukovat, který parametr je pro krystalizaci studovaných proteinů důležitý. Jedná se o situaci, kdy např. většina podmínek obsahuje jeden určitý typ srážecího činidla nebo k nukleaci dochází ve velmi úzkém rozmezí ph. Vyhodnocením těchto společných rysů se může zúžit okruh optimalizačních podmínek a tím snižovat nároky na množství enzymu i chemikálií (McPherson a Cudney 2014). 2.7.1 Očkovací techniky (seeding techniques) Očkování je metoda používaná k optimalizaci proteinových krystalů, během které je proces růstu jader krystalů oddělen od spontánní nukleace. Podstatou očkování je přenos již vzniklých krystalů do vyvážené podmínky nacházející se v metastabilní oblasti fázového diagramu obsahující čerstvý protein. Tyto krystaly působí jako nukleační zárodky, které jsou schopny dále narůstat. Vložením zárodků je vyřešen problém s energetickou bariérou spontánní nukleace. Vyvážené krystalizační podmínky vychází z podmínek původních poskytujících zárodky krystalů. Vyvážené krystalizační podmínky zajišťují nižší stupeň supersaturace, čímž je dosaženo růstu proteinových krystalu, ne však jejich nukleace. Toho se nejčastěji dosáhne úpravou koncentrace proteinu či srážecího činidla (Bergfors 2003, Benvenuti a Mangani 2007). Podle velikosti vložených zárodků jsou očkovací techniky rozdělovány na tzv. microseeding a macroseeding. 2.7.1.1 Mikroočkování (microseeding) Metoda microseedingu je přenos mikroskopických krystalů, které jsou tak malé, že není možné rozlišit jejich počet, do vyváženého krystalizačního roztoku (Bergfors 2003). Aby se zabránilo přesunu velkého množství nukleačních zárodků, které by vedly ke vzniku mnoha krystalů, vytváří se ředící řada očkovacího roztoku, tzv. seeding stocku (McPherson a Gavira, 25

2014). Očkovací roztok vzniká rozdrcením odebraných mikrokrystalů v homogenizátoru na krystalické částice, které jsou smíseny se stabilizujícím matečným roztokem. Očkovací roztok je následně ředěn a pipetován do nově připravených vyvážených krystalizačních podmínek podporujících růst proteinových krystalů. Různá koncentrace očkovací roztoku v kapce vede ke vzniku různého množství krystalů. Správně zvolené ředění očkovacího roztoku poskytne jeden či několik málo větších krystalů (Bergfors 2003). 2.7.1.2 Makroočkování (macroseeding) Při macroseedingu se přenáší jednotlivé krystaly proteinu o velikosti 5 50 µm (Bergfors 2003) do vhodného předem připraveného rovnovážného krystalizačního roztoku obsahujícím čerstvý protein. Před vložením do nového roztoku je nutné krystaly důkladně opláchnout roztokem, který částečně rozpustí povrchu malých krystalů. Na novém povrchu zbaveném nečistot pak dochází ke krystalizaci čerstvého proteinu (Benvenuti a Mangani 2007). Pokud jsou zvoleny správné podmínky pro krystalizaci, po určitém čase lze pozorovat nárůst vloženého krystalu. 2.7.1.3 Vlasové očkování (streak seeding) Vlasové očkování je velmi jednoduchá metoda založená na přenosu krystalických fragmentů pomocí zvířecích chlupů nebo fousů (Kraus a kol. 2013). Nejčastěji jsou využívány kočičí fousy a koňské žíně. Fousem se přejede po povrchu krystalu ve snaze uvolnit část krystalizačních jader, které ulpí na povrchu fousku. Fous je následně protažen nově připraveným rovnovážným roztokem čerstvého proteinu a srážecího činidla, kde se uvolňují krystalová jádra. Při správném provedení se podél linie protažení utváří proteinové krystaly (Bergfors 2003). 2.7.1.4 Očkování příbuzným krystalem (cross seeding) Zatímco výše zmíněné očkovací metody využívají k očkování krystaly téhož proteinu, který je současně obsažen v nově připravené rovnovážné krystalizační podmínce, technika cross-seedingu používá krystaly příbuzných proteinů např. proteinové varianty nebo téhož proteinu izolovaného z jiného organismu (Benvenuti a Mangani 2007). Tento přístup může zabránit zdlouhavému hledání krystalizačních podmínek pro nově zkonstruované varianty proteinu, který byl již dříve úspěšně vykrystalizován. 26

2.8 Heterogenní nukleace Existují dva typy tvorby krystalizačních zárodků homogenní a heterogenní nukleace. Při homogenní nukleaci je zapotřebí vysoká supersaturace. Teprve poté je možné překonat velkou energetickou bariéru a spontánně vznikne stabilní krystalizační zárodek. Naproti tomu, heterogenní nukleace využívá materiály, které interagují s makromolekulami a snižují energetickou bariéru nukleace. Umožňují tak vznik krystalizačního zárodku při nižším stupni supersaturace (Durbin a Feher 1996). Nukleační materiály usnadňují proces krystalizace tak, že molekuly proteinu elektrochemicky, hydrofobně či jinak přitahují ke svému povrchu. Mezi materiály usnadňující nukleaci se řadí různé minerály, lidské chlupy či koňské žíně. Koňské žíně jsou díky své schopnosti zachytit krystalický materiál na svém povrchu využívány při vlasovém očkování, nicméně i samy o sobě mohou indukovat nukleaci v krystalizačním experimentu. Dále byly studovány vlastnosti materiálů s nabitým povrchem, které elektrostaticky přitahují aminokyselinová rezidua proteinových molekul s opačným nábojem. Mezi takové materiály patří např. sklo obohacené o poly-l-lysin na svém povrchu. Kladně nabitý poly-l-lysin přitahuje negativně nabité makromolekuly (Saridakis a Chayen 2009). Prokázanými nukleačními materiály jsou také různé polymerní filmy s adsorbovaným poly-l-lysinem či poly-l-aspartátem (Fermani a kol. 2001). Porézní látky jsou dalšími vhodnými nukleačními materiály. Obsahují dutiny o podobné velikosti jako proteiny, které se dovnitř zachycují, čímž se podporuje tvorba zárodků a krystalů. Příkladem může být speciální porézní křemík (Chayen a kol. 2001) nebo tzv. biosklo (bio-glass) (Khurshid a kol. 2014). Mezi další nukleační materiály patří molekulárně vtisknuté polymery (molecularly imprinted polymers). Vznikají polymerizací v přítomnosti templátové molekuly, tedy proteinu, která je následně odstraněna. Výsledkem je materiál s vysoce selektivními dutinami komplementárními k dané molekule proteinu. Usnadňuje vazbu proteinu a následný vznik krystalů (Saridakis a kol. 2011). 2.9 Vlastnosti proteinových krystalů Proteinové krystaly jsou 3D struktury s pravidelnou stavbou. Základní jednotku je tzv. elementární buňka. Spojením elementárních buněk vzniká krystalová mřížka. Mezi makromolekulami proteinu se utváří slabé nevazebné interakce. Ty mají za následek nízkou mechanickou odolnost a také vysokou citlivost vůči změnám prostředí. Proteinové krystaly ve své struktuře obsahují velké množství rozpouštědla (vody), v průměru okolo 50 % (McPherson 27

2004). Přítomnost dostatečně velkých kanálů rozpouštědla umožňuje difúzi ligandů do již vytvořených krystalů (Weichenberger a kol. 2015). 2.9.1 Identifikace proteinových krystalů Když při krystalizačních experimentech v roztoku objeví krystal, ne vždy to musí znamenat, že se podařilo vykrystalizovat protein. Může se jednat o krystaly soli. S určitostí lze povahu krystalu rozpoznat až konečnou rentgenovou difrakční analýzou, nicméně existuje i několik dalších technik pro ověření proteinových krystalů. Test drcením (crush test) je destruktivní metoda, kterou je možné využít pouze v případě, že je k dispozici více krystalů (Kutá Smatanová). Hlavní rozdíl mezi krystalem proteinu a krystalem soli spočívá v jeho křehkosti. Zatímco proteinový krystal je velmi křehký a už při slabém nárazu skleněnou kapilárou se snadno rozpadá na malé fragmenty, krystaly solí jsou odolné a k jejich rozbití je zapotřebí podstatně více síly. Tento jev je zapříčiněn především slabými interakcemi mezi makromolekulami v krystalové mřížce a také vyšším obsahem rozpouštědla v proteinových krystalech (Chirgadze 2001). Dehydratační test je další jednoduchou technikou k určování povahy krystalů. Krystal se vyjme z roztoku a je ponechán na vzduchu. Pokud postupně degraduje, jedná se o proteinový krystal, ze kterého se odpařuje rozpouštědlo. Krystal soli má ve své struktuře nízký obsah rozpouštědla, a proto zůstává neporušený (Hampton Research 2006). K identifikaci proteinových krystalů lze dále použít barvící test (dye binding test). Nejčastěji používaným barvivem je roztok methylenová modř, komerčně dodávaná pod názvem Izit. Barvivo je přidáno přímo do krystalizačního roztoku. Skrze kanály rozpouštědla jsou malé molekuly barviva přeneseny do proteinového krystalu a ten se obarví namodro. Krystaly solí takové kanály postrádají, a proto se barvivem nezbarví (Hampton Research, 2006). Proteinový původ krystalu lze určit také pomocí gelové elektroforézy. Sesbíráním, opláchnutím a rozpuštěním krystalů je získán vzorek pro elektroforézu v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS-PAGE). Pro porovnání se provede elektroforéza spolu se vzorkem vypurifikovaného proteinu použitého pro krystalizaci. Pokud se na gelu vytvoří úzký proužek totožný s kontrolou, jedná se o krystaly proteinu (Chirgadze 2001). Další metody využívané pro rozlišování proteinových a solných krystalů jsou založeny na fluorescenci. Nejjednodušší způsob je využití přirozené fluorescence aromatických aminokyselin proteinu, především tryptofanu, po excitaci ultrafialovým světlem. Koncentrované oblasti proteinu, tedy i proteinové krystaly, po ozáření UV světlem jasně září 28

(Desbois a kol. 2013). Druhou možností je využití nespecifické fluorescenční barvy, 1- anilínonaftalen-8-sulfonové kyseliny (1,8-ANS), která se přidává k roztoku proteinu ještě před krystalizací (Groves a kol. 2007). Jiná metoda využívá kovalentně vázanou fluorescenční sondu připojenou k proteinu. Všemi fluorescenčními metodami lze po vhodné excitaci odlišit jasně zářící proteinové krystaly od krystalů neproteinových (Meyer a kol. 2015). 29

3 Proteinová krystalografie 3.1 Úvod Rentgenová krystalografie je nejpoužívanější technika umožňující určit prostorovou strukturu krystalických látek do atomárního rozlišení. Její princip je založen na schopnosti krystalů chovat se jako trojrozměrné difrakční mřížky, které rozptylují dopadající rentgenové záření pouze určitými směry. Rozptýlené paprsky jsou zaznamenány na detektoru v podobě difrakčních skvrn. Poloha a intenzita difraktovaných paprsků závisí na vnitřním uspořádání krystalu. Analýzou sady několika difrakční obrazců, vytvořených změnou orientace krystalu při difrakci, lze matematicky odvodit struktury molekul (Suguna 2005). Základy rentgenové krystalografie položil Wilhelm Conrad Röntgen, když v roce 1895 objevil rentgenové záření. V roce 1912 vyslovil Max von Laue myšlenku, že by se krystal mohl chovat jako trojrozměrná difrakční mřížka pro rentgenové záření. Otestováním této hypotézy pověřil Waltera Friedricha a Paula Knippinga (Hauptman 1990). Ti provedli difrakční experiment, při kterém skutečně pozorovali ohyb rentgenového záření na krystalu skalice modré. Za tento objev byl v roce 1914 Max von Laue oceněn Nobelovou cenou za fyziku. Na Laueho experiment navázal William Lawrence Bragg ve spolupráci se svým otcem Williamem Henry Braggem. Dokázali, že rentgenovou difrakci lze použít ke stanovení atomární struktury molekul. Za použití monochromatického rentgenového záření určili krystalové struktury několika prvků, jednoduchých anorganických sloučenin a minerálů a také první organické látky naftalenu (Kratochvíl a kol. 2008). William Lawrence Bragg také popsal podmínky difrakce pomocí jednoduché rovnice, dnes známé jako Braggova rovnice. V roce 1915 za tento přínos získali William Lawrence Bragg a William Henry Bragg Nobelovu cenu za fyziku (Perutz 1990). Vůbec první difrakční obrazec proteinu byl uveřejněn dvojicí John D. Bernal a Dorothy Crowfoot Hodgkinová v roce 1934. Dorothy Hodgkinová také později objasnila strukturu několika důležitých biologických molekul, např. penicilinu, vitamínu B12 či insulinu. Za výzkum v oblasti stanovení struktury důležitých biomolekul rentgenovou krystalografií získala Dorothy Hodgkinová v roce 1964 Nobelovu cenu za chemii (Howard 2003). Max Perutz a John Kendrew na konci padesátých let vyřešili za pomoci rentgenové krystalografie první struktury proteinů myoglobinu a hemoglobinu, za něž získali v roce 1962 Nobelovu cenu za chemii (Suguna 2005). 30

3.2 Příprava krystalů před difrakční analýzou Krystaly biomolekul jsou náchylné k radiačnímu poškození během působení rentgenového záření. Některé z fotonů dopadajících na vzorek krystalu jsou absorbovány a interagují s atomy. Vytváří se tak volné radikály (zejména H* a OH* vzniklých rozpadem vody), které svým šířením v krystalu mohou způsobovat sekundární radiační poškození projevující se změnami polohy atomů v proteinu, rozpouštědla či ligandů nacházejících se v krystalu (Pflugraph 2015). Příkladem sekundárního radiačního poškození může být štěpení disulfidických můstků či dekarboxylace aminokyselinových zbytků (Carugo a Djinović-Carugo 2005). Toto poškození lze eliminovat, jestliže se difrakční experiment provádí při velmi nízkých teplotách (okolo 100 K) (Pflugraph 2015). Za nízkých teplot má většina volných radikálů mnohem nižší rychlost difúze, tudíž ve struktuře krystalu nezpůsobují takové poškození. Prodloužená životnost krystalů má obvykle za následek lepší kvalitu naměřených dat (Garman 2003). 3.2.1 Lovení krystalů Jakmile se podaří vykrystalizovat protein o dostatečné velikosti a kvalitě, je nutné jej vyjmout z krystalizačního roztoku. Ačkoliv se v minulosti k tomuto účelu používaly skleněné kapilárky, dnes se nejčastěji využívají smyčky z tenkého nylonového vlákna o různých velikostech. Smyčky se volí dle rozměrů krystalu, většinou se stejným průměrem, nebo o něco málo větší. Povrchové napětí drží krystal v tenké vrstvě kapaliny rozprostírající se ve smyčce. Jakmile je krystal vyňat z roztoku, máčí se na několik sekund v roztoku kryoprotektantu a poté je zchlazen v tekutém dusíku. Jelikož jsou proteinové krystaly velmi citlivé na změnu okolního prostředí, je důležité provádět jednotlivé kroky lovení, kryoprotekce a zchlazení rychle. (Drenth 2007). 3.2.2 Kryoprotekce krystalů Proteinové krystaly na rozdíl od anorganických krystalů obsahují v krystalové mřížce a na povrchu krystalů velký obsah vody. Při jejich zchlazení se musí předejít tvorbě krystalů ledu, které by znehodnotily difrakční data (Vera a Stura 2014). Cílem při chlazení krystalů je dosáhnout tzv. vitrifikace, tedy stavu, kdy vzniká amorfní sklovitá fáze rozpouštědla a nedochází k tvorbě krystalů ledu. Vitrifikace lze dosáhnout kombinací velmi rychlého zchlazení a kryoprotekce krystalů (Řezáčová). Kryoprotektanty jsou látky, které zpomalují nukleaci ledových krystalů. Existují dva základní typy kryoprotektantů. Kryoprotektanty, které 31

nahrazují vodná rozpouštědla uvnitř krystalu a kryoprotektanty, které do krystalu nevnikají, ale poskytují ochrannou bariéru mezi povrchem a okolním vzduchem, např. oleje (Garman a Owen 2007). Nejpoužívanějšími kryoprotektanty pronikajícími do krystalu jsou glycerol, ethylenglykol, 2-methyl-2,4-pentadiol (MPD), PEG 400 nebo nízkomolekulární cukry. V ideálním případě jsou tyto látky již přítomny v krystalizačním roztoku jako aditiva napomáhající krystalizaci proteinů. Mohou také plnit funkci srážecího činidla (např. MPD, PEG 400, malonát atd.) a současně působit jako kryoprotektanty. Při kryoprotekci proteinových krystalů se pak použije stejný typ kryoprotektantu jako při krystalizaci jen s úpravou jeho koncentrace (Pflugraph 2015). Tohoto přístupu využívá např. komerčně dostupný krystalizační kit Morpheus (Molecular Dimensions, UK), jehož krystalizační roztoky jsou zvoleny tak, aby působily současně jako kryoprotektanty (Gorrec 2009). Pokud není kryoprotektant obsažen v krystalizačním roztoku, je nutné jej do roztoku přidat. Volba vhodného kryoprotektantu probíhá na základě složení krystalizační podmínky. Jestliže je např. hlavní součástí krystalizačního roztoku sůl, vhodnou strategií kryoprotekce je přidání MPD, glycerolu, ethylenglykolu nebo navýšení koncentrace přítomné soli. Mezi nejuniverzálnější a nejčastěji používaný kryoprotektant patří glycerol (Garman a Owen 2007). Minimální požadovaná koncentrace kryoprotektantu by měla být stanovena před vlastním difrakčním experimentem. Test spočívá ve zchlazení kapky krystalizačního roztoku s kryoprotektantem. Pokud kapka zůstává čirá, je kryoprotekce dostačující. Obvykle to platí pro roztoky, které obsahují 15-30 % kryoprotektantu v mateřském roztoku (Parkin a Hope 1998). Krystal biomolekuly může být do roztoku s finální koncentrací kryoprotektantu přenesen buď přímo, anebo jeho postupným namáčením v krystalizačních směsích se zvyšující se koncentrací kryoprotektantu (Garman a Owen 2007). 3.2.3 Chlazení krystalů Chlazení krystalů se provádí nejčastěji v tekutém dusíku nebo v proudu par tekutého dusíku na goniostatu (Garman 2003). Výhodou využití chladných par tekutého dusíku proudících z kryostatu je umístění krystalu do výchozí pozice pro difrakční analýzu. Naproti tomu zchlazení krystalů v tekutém dusíku lze provést dopředu v laboratoři. Zchlazené krystaly jsou následně převezeny v tekutém dusíku ke zdroji rentgenového záření, čehož se využívá zejména při přípravě krystalů pro měření difrakčních dat na zdrojích synchrotronového záření (Rodgers 1994). Smyčka s uchyceným krystalem se ponoří do tekutého dusíku, kde se vloží se do plastikové zkumavky, uzpůsobené ke skladování proteinových krystalů za nízkých teplot, nebo 32

do speciálního nosiče, tzv. puku, který může nést až 16 smyček (Molecular Dimensions, UK). K převozu krystalů jsou uzpůsobeny specializované Dewarovy nádoby, do kterých se ukládají nosiče - puky nebo držáky na kryozkumavky (Pflugrath 2004). Smyčka nesoucí krystal je upevněna k magnetické bázi, která je kompatibilní s magnetickou plochou v hlavičce goniostatu. Po přemístění krystalů na místo konání difrakční analýzy je smyčka s krystalem umístěna ve svislé poloze na goniostat. Chlazení krystalu tekutým dusíkem je na goniostatu nahrazeno proudem chladných par dusíku z kryostatu. Přesun krystalu na goniostat umožňují speciální kovové klíšťky s otvorem pro smyčku. Musí být předem nachlazené, aby po dobu přesunu udržoval zchlazený kov nízkou teplotu krystalu (Řezáčová). Vedle metody rychlého zchlazení (tzv. flash cooling) dosaženého prudkým ochlazením krystalu v tekutém dusíku existuje také metoda opakovaného zchlazení (crystal annealing). Při ní se krystal po zchlazení přesune do roztoku kryoprotektantu, kde se nechá po dobu asi tří minut ohřát na laboratorní teplotu či teplotu, při které protein krystalizoval. Poté se opět vyjme z roztoku a zchladí. Tento postup lze použít ke snížení mozaicity krystalu a ke zlepšení rozlišení naměřených dat (Hanson a kol. 2003). 3.3 Difrakční analýza K difrakční analýze se používá svazek monochromatického rentgenového záření, který ozařuje proteinový krystal. Aby bylo možné popsat trojrozměrnou strukturu proteinu, je nutné nasbírat set difrakčních obrazců krystalu ve všech možných orientacích. V průběhu experimentu to zajišťuje rotující hlava goniostatu, která krystalem otáčí všemi směry. Při rozptylu dopadá vlna primárního rentgenového záření na atomy v krystalu. Zatímco jádra atomů zůstávají díky své velké hmotnosti v klidu, elektrony se rozkmitávají a stávají se zdrojem sekundárního záření s vlnovou délkou shodnou s primárním zářením (Waseda a kol. 2011). Interference sekundárního rentgenového záření způsobí, že v některých směrech dojde k zesílení intenzity a v jiných k jejímu zeslabení. Tak vzniká difrakční obrazec, který je zaznamenán na detektoru v podobě difrakčních skvrn (obr. 9). 33

kryostat detektor krystal zdroj záření goniostat Obrázek 9. Schematické znázornění difrakční analýzy. Monochromatické rentgenové záření se pružně rozptyluje na elektronech krystalu a zaznamenává se na detektoru. 3.3.1 Struktura krystalů Proteinový krystal je pevná látka, ve které jsou makromolekuly pravidelně uspořádány. Krystalová mřížka je tvořena periodickým opakováním základního stavebního prvku tzv. elementární (základní) buňky (obr. 10). Každá elementární buňka je určena třemi translačními vektory (a, b, c), které svírají tři úhly α, β a γ (Ilari a Savino 2008). Elementární buňku lze operacemi symetrie zredukovat na 2 a více asymetrických jednotek. Asymetrická jednotka je nejmenší substruktura, ze které lze krystal zrekonstruovat. Může se jednat o jednu proteinovou molekulu či oligomer. Při rentgenové difrakci se krystal používá jako jistý druh zesilovače signálu. Rozptyl rentgenového záření na jedné molekule je příliš slabý na to, aby byl detekovaný, ztratil by se v šumu. Proto se používají krystaly obsahující velké množství molekul v identické orientaci, které poskytují měřitelný difrakční signál (Lattman a Loll 2008). Obrázek 10. Schematické znázornění krystalové mřížky, která je tvořena periodickým opakováním elementárních buněk (na obrázku znázorněných modře). Překresleno z URL 1. 34

3.3.2 Braggova podmínka William Lawrence Bragg popsal podmínky vzniku difrakce. Krystalovou strukturu lze proložit několika pomyslnými rovinami a difraktované záření lze chápat jako odrazy (reflexe) dopadajícího záření na těchto rovinách. Rentgenové záření je elektromagnetické vlnění a mezi vlnami dochází ke vzájemnému ovlivňování tzv. interferenci. Vlny se stejnou fází se skládají konstruktivně a záření zesílí. Jestliže však mají vlny fázi opačnou, amplitudy se odečtou a vlny vyruší (Lattman a Loll 2008). Braggova podmínka říká, že ke konstruktivnímu složení difraktovaných paprsků dojde tehdy, je-li je dráhový rozdíl mezi vlnami roven celočíselnému násobku vlnové délky záření (obr. 11). Tento vztah popisuje Braggova rovnice: 2d sinθ = nλ, kde d je vzdálenost meziatomových rovin, θ úhel, pod kterým dopadá paprsek, n je řád interference (celé číslo vyjadřující, o kolik násobků vlnové délky je jeden paprsek vůči druhému zpožděn) a λ je vlnová délka rentgenového záření (Thomas 2012). θ θ θ θ d 2d sinθ Obrázek 11. Schematické znázornění difrakce na Braggových rovinách. Konstruktivní interference nastává, když se dráhový rozdíl mezi dopadajícími paprsky (modrá) rovná celočíselnému násobku vlnové délky rentgenového záření (zde dvojnásobek vlnové délky). Překresleno z URL 2. 3.3.3 Zdroje rentgenového záření Ke stanovení prostorové struktury proteinu s atomárním rozlišením je nutné použít záření s vlnovou délkou odpovídající vzdálenostem mezi atomy, tedy přibližně 0.1nm (1Å). Takové elektromagnetické záření spadá do spektra rentgenového záření (Žídek 2015). Zdroje rentgenového záření prošly v historii velkou změnou. Od objevu rentgenových paprsků se používaly rentgenové lampy, tedy skleněné vakuové trubice se dvěma elektrodami 35

(katodou a anodou). V rentgenových lampách, tzv. rentgenkách, jsou z rozžhavené katody emitovány elektrony, které jsou pomocí vysokého napětí mezi elektrodami urychlovány směrem k anodě. Elektrony velkou rychlostí prostupují do anody, kde jsou zpomaleny a emitují rentgenové záření. Pro rentgenovou difrakci na proteinových krystalech se používá měděná anoda, kterou je nutné ochlazovat, neboť dopad elektronů způsobuje její zahřívání. Měděnou anoda produkuju rentgenové záření s vlnovou délkou přibližně 1,54 Å. Ohřev anody způsobený elektronovým paprskem omezuje výkon rentgenové lampy. Jestliže dopadá příliš mnoho energie, anoda se zničí. Pokud se však použije anoda v podobě rotujícího válce namísto fixního kusu kovu (pevné anody), lze tento efekt zmírnit. U rotační anody je teplo rozprostřeno na větší plochu anody, což umožňuje produkovat záření o vyšší intenzitě. V současné době jsou využívanými laboratorními zdroji rentgenového záření právě generátory s rotační anodou (Drenth 2007). Největší změna ve zdrojích rentgenového záření nastala v polovině 70. let, kdy se začalo využívat synchrotronové záření (Wlodawer a kol. 2013). Princip je založen na faktu, že každá nabitá částice pohybující se se zrychlením emituje záření. Synchrotron je typ urychlovače částic, ve kterém se urychlují tepelně emitované elektrony nejprve v lineárním urychlovači a poté v tzv. boosteru až na rychlost podobnou rychlosti světla. Elektrony jsou přivedeny do akumulačního prstence, jehož obvod lemují ohybové magnety. Dráha elektronu se zakřivuje a elektron vyzařuje energii ve formě rentgenového záření, které je nasměrováno do cílových experimentálních stanic, kde se provádí difrakční experimenty (obr. 12) (Drenth 2007). Rentgenové záření pocházející ze synchrotronu disponuje velkou intenzitou. Jeho paprsky jsou asi tisíckrát intenzivnější než ty pocházející z generátoru s rotační anodou. To umožňuje naměřit difrakční data i na velmi malých krystalech a snížit dobu měření. Synchrotronové záření je kontinuální záření s vlnovou délkou od 0.05 do 0.3 nm (Ilari a Savino 2008). Pro strukturní analýzu biomolekul je však zapotřebí rentgenové záření o jedné vlnové délce, proto je součástí každého synchrotronu monochromátor, který příslušnou vlnovou délku vymezí. K difrakci na proteinech se využívá rentgenové záření o vlnové délce 1Å a menší (Drenth 2007). 36

5 4 3 2 1 Obrázek 12. Schéma synchrotronu. Elektrony vzniklé v elektronovém dělu (1) jsou nejprve částečně urychleny v lineárním urychlovači (2) a poté v tzv. booster ringu (3) na rychlost blízkou rychlosti světla. Dráha urychlených elektronů je v akumulačním prstenci (4) zakřivena pomocí ohybových magnetů. Vyzářené rentgenové záření je odkloněno do experimentálních laboratoří (5). Převzato z URL 3. 3.3.4 Detektory Po průchodu rentgenového záření krystalem jsou směry a intenzity difraktovaných paprsků zaznamenány na plošný detektor. Historicky prvním typem detektoru byl fotografický film. Funguje na podobném principu jako černobílá fotografie. Po dopadu záření dojde k rozpadu bromidu stříbrného. Zachycené záření se projeví zčernáním filmu. Výsledkem difrakční analýzy jsou různě umístěné černé skvrny (Taraba a Richtera 2002). Později byly fotografické filmy nahrazeny detektory typu obrazová deska (image plate), které jsou minimálně 10x citlivější než fotografický film (Drenth 2007). Tvoří je tenká vrstva anorganického luminoforu (např. BaFBr nesoucí dvojmocné europium Eu 2+ ), jehož elektrony jsou po ozáření rentgenovým zářením excitovány do vyšších energetických hladin. Uchovaná energie je poté vyzářena ve formě světla. V praxi se využívá červený laser ke skenování detektoru, což způsobuje emisi modrého světla (Gruner 1994). Množství emitovaného záření je úměrné počtu fotonů, které na detektor v daném místě dopadly (Drenth 2007). V současnosti se jako detektory rentgenového záření využívají CCD detektory (charge-coupled device), které výrazně zlepšily kvalitu a rychlost sběru difrakčních dat. Jednoduchý systém je složený z plošné vrstvy materiálu, který transformuje dopadající rentgenové záření na světlo. Světlo je následně centrováno pomocí sbíhavého kužele optických vláken na malou plochu CCD čipu, který konvertuje světlo na elektrický náboj (Gruner a kol. 2002). 37

3.4 Řešení struktury proteinu 3.4.1 Fázový problém Výsledkem difrakce na krystalu jsou skvrny tvořící difrakční obrazec. V místě difrakční skvrny došlo k absorpci vlny s určitou amplitudou a fází. Ze znalosti těchto hodnot můžeme určit parametr známý jako strukturní faktor. Strukturní faktor představuje součet rozptylů ze všech atomů v elementární buňce krystalu. Fourierovou transformací z něho lze vypočítat rozložení elektronové hustoty. Amplitudu strukturního faktoru lze stanovit z naměřených intenzit záření, zatímco difrakčním experimentem nezískáváme žádnou přímou informaci o fázi. Neznalost původní fáze se v krystalografii označuje jako fázový problém (Wlodawer a kol. 2013). Existuje několik metod, pomocí kterých lze fázový problém překonat např. molekulárním nahrazením, metodou izomorfního nahrazení či anomálním rozptylem. 3.4.1.1 Molekulární nahrazení (molecular replacement) Molekulární nahrazení je nejčastěji využívanou metodou ke stanovení fáze. Tato metoda využívá znalosti struktury blízce příbuzného proteinu, s nímž analyzovaný protein sdílí vysokou sekvenční homologii (Smyth a Martin 2000). V případě, že má výchozí model alespoň 40% sekvenční identitu s proteinem, jehož strukturu chceme stanovit, mělo by být molekulární nahrazení s vysokou pravděpodobností úspěšné (Illari a Savino 2008). V metodě molekulárního nahrazení se umísťuje modelový protein ve správné pozici a orientaci do elementární buňky krystalu neznámé struktury. Ze známé modelové struktury lze vyvodit počáteční fázovou informaci. Nejčastěji používané programy pro molekulární nahrazení jsou MOLREP a Phaser (Scapin 2013). 3.4.1.2 Izomorfní nahrazení (isomorphous replacement) Metoda izomorfního nahrazení porovnává difrakční obrazce nativního proteinového krystalu s jeho derivátem, v jehož struktuře došlo k navázání jednoho či několika atomů s velkým počtem elektronů. V praxi se metoda izomorfního nahrazení provádí ponořením nativního krystalu do roztoku obsahující sůl těžkého atomu (Hg, Pb, Au, Pt ). Těžké atomy difundují skrze kanály v krystalu a vážou se ke specifickým místům na povrchu všech proteinových makromolekul obsažených v krystalu (např. na postranní řetězce cysteinu, histidinu, kyseliny asparagové a glutamové). V ideálním případě nemá přídavek těžkého atomu žádný efekt na uspořádání makromolekul v krystalové mřížce ani na konformaci proteinů (Lattman a Loll 2008). Těžké atomy, mající větší počet elektronů v porovnání s ostatními atomy 38

v proteinu, výrazně přispívají k difrakci, čímž ovlivňují intenzity rozptýlených paprsků. Z porovnání difrakčních dat nativního proteinu a jeho derivátu je možné odvodit pozice těžkých atomů a následně odhadnout i hodnotu počáteční fáze (Taylor 2003). 3.4.1.3 Metody anomálního rozptylu (anomalous dispersion methods) Anomální rozptyl nastává v případě, kdy se frekvence rentgenového záření blíží rezonanční frekvenci přechodu mezi stavy elektronů. Pohlcený foton při této frekvenci způsobí přechod elektronu do jiného stavu a vyzářený foton vykazuje jinou amplitudu a fázi (Lattman a Loll 2008). Vzniklý rozdíl je označován jako anomální rozptyl. U běžně se vyskytujících atomů v proteinu nedosahuje rezonanční frekvence vlnových délek použitého rentgenového záření, proto se stejně jako při metodě izomorfního nahrazení využívají krystaly proteinových derivátů s navázanými těžkými atomy (Žídek 2015). Ačkoliv existuje metoda anomálního rozptylu při jedné vlnové délce (single-wavelength anomalous dispersion, SAD), mnohem častěji se využívá metoda anomálního rozptylu při různých vlnových délkách (multiwavelength anomalous dispersion, MAD). Při MAD se difrakční data na jednom krystalu měří při různých vlnových délkách rentgenového záření blízkých absorpční hraně. Protože tato metoda vyžaduje laditelný zdroj rentgenového záření, může být prováděna pouze na synchrotronu. MAD se často používá pro rekombinantní proteiny, ve kterých došlo k záměrnému nahrazení methioninů za selenomethioniny. Síru nahrazující selen v methioninu má anomální rozptyl při vlnových délkách dosažitelných na synchrotronu. Pomocí anomálního rozptylu lze určit rozmístění těžších atomů v elementární buňce a následně vypočítat fázi strukturních faktorů (Hickman a Davies 2001). 3.4.2 Mapa elektronové hustoty V okamžiku, kdy známe amplitudu i fázi strukturních faktorů, můžeme provést Fourierovu transformaci, jejíž výsledkem je zisk mapy elektronové hustoty. Kvalita difrakčních dat (tedy i kvalita krystalu) má vliv na rozlišení získané mapy elektronové hustoty. Čím lepší rozlišení, tím snadnější je následná stavba modelu. Rozlišení se udává k jednotkách angström Å. Atomární rozlišení (1 Å) umožňuje pozorovat elektronové obaly jednotlivých atomů. Jak se rozlišení snižuje, kontury se zkreslují a není možné přesně určit pozice jednotlivých atomů. Rozlišení okolo 3 Å je však dostatečné, aby bylo možné detekovat postranní řetězce aminokyselin v mapě elektronové hustoty (Smyth a Martin 2000). 39

3.4.3 Budování modelu a zpřesňování struktury Jakmile získáme dostatečně kvalitní mapu elektronové hustoty, snažíme se do jejich kontur vložit model proteinové struktury. Model se buduje na základě znalosti aminokyselinové sekvence a principů stereochemie. Prvotní model obsahuje mnoho chyb, které jsou korigovány v procesu zpřesňování modelu (tzv. refinementu). Snahou automatických i manuálních úprav je docílit co možná nejlepší shody mezi pozorovanými difrakčními daty a těmi vypočítanými pro model (Lattman a Loll 2008). Opakovaně se provádí minimalizace počátečního modelu struktury, vypočítají se nové strukturní faktory a z nich nová mapa elektronové hustoty, na jejíž základě se upraví původní model a postup se znovu opakuje. K tomu se využívají počítačové grafické programy, např. Coot (Emsley a Cowtan 2004). Měřítkem kvality získaného modelu je tzv. R faktor. Čím nižší R faktor je, tím přesnější strukturu získáme (Žídek 2015). Kromě R faktoru se často využívá také Rfree faktor. Princip spočívá ve vynechání určitého procenta (nejčastěji 5-10%) reflexí z procesu zpřesňování struktury a jejich použití pro výpočet Rfree faktoru, který následně poskytuje nezávislou kontrolu správnosti struktury (Hickman a Davies, 2001). Na konci procesu zpřesňování by měly být oba R-faktory sníženy na 10-20% (Ilari a Savino 2008). Dalším kritériem správnosti struktury je Ramachandranův diagram, pomocí kterého lze ověřit správnou konformaci polypeptidového řetězce (Drenth 2007). 40

4 Halogenalkandehalogenasy 4.1 Využití halogenalkandehalogenas Halogenalkandehalogenasy (EC 3.8.1.5, HLDs) jsou bakteriální enzymy schopné hydrolyticky štěpit vazbu uhlík-halogen v širokém spektru halogenovaných alifatických uhlovodíků. Při reakci vzniká příslušný primární alkohol, halogenidový aniont a proton (obr. 13) (Nagata a kol. 2015). Většina těchto enzymů byla izolována z půdních bakterií obývajících kontaminované prostředí (Nagata a kol. 1997, Janssen a kol. 1988, Keuning a kol. 1985), ze symbiotických bakterií (Sato a kol. 2005), mořských bakterií (Novak a kol. 2014, Li a Shao 2014, Hesseler a kol. 2011) nebo dokonce z patogenních bakterií (Jesenská a kol. 2000, 2002 a 2005). Halogenalkandehalogenasy mají širokou substrátovou specifitu. Degradují více než sto chlorovaných, bromovaných či jodovaných alifatických substrátů zahrnujících halogenované alkany, cykloalkany, alkeny, ethery, estery, acetamidy, nitrily, alkoholy či halogenhydriny. (Damborský a kol. 2001). Tyto halogenované látky jsou většinou toxické s prokázanými či předpokládanými mutagenními, karcinogenními nebo teratogenními účinky. Fluorované, aromatické, halogenované substráty s uhlíkem v hybridizaci sp 2 a substráty s více halogenovými substituenty na jednom uhlíku HLDs nevyužívají. (Koudeláková a kol. 2013). HLDs jsou jednou z nejlépe prostudovaných enzymových rodin a využívají se pro různé biotechnologické aplikace. Nejslibnějším odvětvím, ve kterém se mohou HLDs využít, je bioremediace toxických polutantů, které se používaly v průmyslu jako organická rozpouštědla či pesticidy a touto cestou se dostaly do prostředí, kde perzistují. Mezi významné polutanty patří např. 1,2-dichlorethan, 1-chlorhexan či hexachlorcyklohexan (Koudeláková a kol. 2013). Svůj potenciál mají HLDs i ve vojenském průmyslu. Halogenalkandehalogenasy DhaA, DmbA a LinB jsou schopné degradovat bojovou látku bis(2-chlorethyl)sulfid (yperit) a jeho dusíkaté analogy přes netoxický intermediát, na rozdíl od spontánní hydrolýzy (Prokop a kol. 2006). Další možností využití HLDs je recyklace vedlejších produktů chemických reakcí. Při chemické syntéze epichlorhydrinu, propylenoxidu a butylenoxidu vznikají vedlejší halogenované produkty 1,2,3-trichlorpropan, 1,2-dichlorpropan a 1,2-dichlorbutan, jejichž recyklací na halogenhydriny by se snížily výrobní náklady procesu (Koudeláková a kol. 2013). Díky vysoké enantioselektivitě je možné některé HLDs využít k produkci opticky čistých látek (Prokop a kol. 2010). Mezi tyto látky patří např. (S)-β-bromalkany, (S)-β-alkoholy, (S)-α-bromestery a další. Opticky čisté látky jsou důležité ve farmaceutickém průmyslu, kde využívají k výrobě léčiv (Koudeláková a kol. 2013). Další uplatnění HLDs nacházejí v detekci 41

toxických polutantů v prostředí pomocí biosenzorů (Campbell a kol. 2006, Bidmanová a kol. 2010). Obrázek 13. Obecné schéma reakčního mechanismu halogenalkandehalogenas, převzato z Damborský a kol. 2010. Reakce se skládá ze dvou následných kroků: bimolekulární nukleofilní substituce vedoucí ke vzniku alkyl-enzym esterového intermediátu a jeho následné hydrolýzy aktivovanou molekulou vody za vzniku protonu, alkoholu a halogenidu. 4.2 Struktura halogenalkandehalogenas Halogenalkandehalogenasy strukturně náleží do rodiny α/β hydroláz. Jejich struktura je složena ze dvou domén, domény hlavní a domény víčkové, na jejichž rozhraní je v hydrofobní dutině lokalizováno aktivní místo (obr. 14). Hlavní doménu tvoří sedm paralelních a jeden antiparalelní řetězec β-skládaného listu, který je obklopen šesti alfa šroubovicemi. Zatímco hlavní doména je u α/β hydroláz velmi konzervovaná, víčková doména je variabilní. Právě struktura menší a flexibilnější víčkové domény, která je tvořena výlučně alfa šroubovicemi propojenými smyčkami, definuje substrátovou specifitu HLD enzymů (Damborský a kol. 2010). Hydrofobní dutina aktivního místa je s okolním prostředím spojena několika přístupovými cestami, tzv. tunely. Tunely svým tvarem, velikostí, dynamikou a fyzikálněchemickými vlastnostmi ovlivňují navázání substrátu a odchod výsledných produktů chemické reakce a tím předurčují enzymovou aktivitu a substrátovou specifitu. V aktivním místě se nachází pětice aminokyselin účastnících se katalytické reakce - tzv. katalytická pentáda. Pentáda je tvořena nukleofilem, katalytickou bází a katalytickou kyselinou, dohromady tvořící katalytickou triádu a dvou halogenid stabilizujících aminokyselin (Damborský a kol. 2010). Na základě fylogenetické analýzy jsou halogenalkandehalogenasy rozděleny do tří podrodin označovaných jako HLD-I, HLD-II a HLD-III. (obr. 15) Podrodiny se od sebe navzájem liší složením katalytické pentády a strukturním uspořádáním víčkové domény. HLD-I a HLD-III jsou sesterské podrodiny, jejichž katalytickou triádu tvoří dvě kyseliny asparagové (nukleofil a kyselina) a histidin (báze). Dvojici halogenid stabilizujících aminokyselin tvoří dva tryptofany (HLD-I) nebo asparagin a tryptofan (HLD-II a HLD-III). Složení katalytické triády kyselina 42

asparagová, histidin a kyselina glutamová charakterizuje zástupce podrodiny HLD-II (Chovancová a kol. 2007). Nukleofil Báze Katalytická kyselina Halogenid stabilizující aminokyselina Obrázek 14. Terciární struktura halogenalkandehalogenas složená z hlavní (bílá) a víčkové (černá) domény. Plné symboly znázorňují konzervované aminokyseliny katalytické pentády nukleofil, bázi a první halogenid stabilizující aminokyselinu. Prázdné symboly označují katalytickou kyselinu a druhou halogenid stabilizující aminokyselinu, které jsou variabilní mezi jednotlivými zástupci HLDs. Převzato z Damborský a kol. 2010. Obrázek 15. Fylogenetická analýza klasifikující HLDs do tří podrodin: HLD-I, HLD-II a HLD-III. Většina charakterizovaných enzymů spadá do podrodiny HLD-II. Převzato z Nagata a kol. 2015. 43