UNIVERZITA OBRANY BRNO FAKULTA VOJENSKÉHO ZDRAVOTNICTVÍ HRADEC KRÁLOVÉ

UNIVERZITA OBRANY BRNO FAKULTA VOJENSKÉHO ZDRAVOTNICTVÍ HRADEC KRÁLOVÉ AUTOREFERÁT DISERTAČNÍ PRÁCE Diagnostika mykobakterií a rezistentních kmenů Mycobacterium tuberculosis molekulárně biologickými metodami Ing. Monika Coufalová Doktorský studijní program Lékařská mikrobiologie Hradec Králové 2016 1

1 Cíl práce Cílem této práce bylo prověření molekulárně biologických metod za účelem rozšíření spektra diagnostických metod u mykobakterií a urychlení stanovení lékové citlivosti u MDR-TB a XDR-TB v rutinní klinické laboratorní diagnostice. 1. Porovnání molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MTB/NTM Detection se zlatým standardem v diagnostice M. tuberculosis a atypických mykobakterií z přímého klinického materiálu od pacientů, tedy porovnání s kultivačními metodami na mykobakterie. Navíc s porovnáním mikroskopického vyšetření a kultivačních metod. 2. Testování molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MDR-TB Detection pro detekci M. tuberculosis a stanovení citlivosti na rifampicin a isoniazid z přímého klinického materiálu k detekci MDR-TB a porovnání výsledků citlivostí s vykultivovanými kmeny metodou minimálních inhibičních koncentrací (MIC). 3. Testování molekulárně biologické metody Anyplex TM II MTB/MDR/XDR Detection ke stanovení citlivosti M. tuberculosis k antituberkulotikům při detekci MDR a XDR TB u již vykultivovaných kmenů a porovnání výsledků citlivosti s vykultivovanými kmeny metodou minimálních inhibičních koncentrací (MIC). 2

2 Vědecké metody V rámci této studie byly porovnány tři molekulárně biologické metody a mikroskopie mykobakterií se zlatým standardem kultivačními metodami v rutinní klinické mykobakteriální diagnostice. První z molekulárně biologických metod Anyplex TM plus MTB/NTM Detection prokazovala Mycobacterium tuberculosis a atypické mykobakterie. Druhá metoda Anyplex TM plus MDR-TB Detection zjišťovala genovou citlivost na isoniazid a rifampicin u M. tuberculosis. Třetí metoda Anyplex TM II MTB/MDR/XDR Detection zjišťovala genetickou citlivost pro určení kmenů MDR a XDR. V této práci byly hodnoceny klinické matriály získané ze dvou pracovišť, z Oddělení klinické mikrobiologie Thomayerovy nemocnice v Praze a z Centra klinických laboratoří při Zdravotním ústavu v Ostravě. Klinické materiály byly získány od pacientů s podezřením na tuberkulózu, mykobakteriózu nebo k vyloučení těchto onemocnění. Klinické materiály byly získávány v období od ledna do prosince 2013. Po získání klinického materiálu od pacienta byl tento vzorek rozdělen na dvě části pro zpracování na mikroskopii a kultivaci mykobakterií a na testování molekulárně biologickou metodou Anyplex TM plus MTB/NTM Detection, které byly testovány ke stanovení Mycobacterium tuberculosis a atypických mykobakterií. Téměř všechny klinické vzorky byly současně testovány mikroskopickou, kultivační a molekulárně biologickou metodou, kromě vzorků močí a laryngeálních výtěrů, kde nebyla provedena mikroskopie. Před mikroskopickým a kultivačním vyšetřením byla provedena homogenizace, dekontaminace a koncentrace vzorku pomocí centrifugace. Pro mikroskopii se vytvořil nátěr kapky sedimentu na podložní sklíčko a následovalo barvení fluorescenční nebo podle Ziehl-Neelsena. Pro kultivaci mykobakterií následovala inokulace materiálu na různé kultivační půdy v závislosti na vstupním klinickém materiálu. V případě pozitivní kultivace byla prováděna identifikace mykobakterií. Stanovení citlivosti u atypických mykobakterií nebylo standardně prováděno. Pro diagnostiku molekulárně biologickými testy byla nejprve z klinického materiálu od pacienta izolována/extrahována nukleová kyselina. V dalším kroku následovala amplifikace a detekce cílených sekvencí nukleotidů. V případě molekulárně 3

biologického testu byly zvlášť hodnoceny M. tuberculosis a atypické mykobakterie. V případě pozitivní detekce M. tuberculosis molekulárně biologickou metodou Anyplex TM plus MTB/NTM Detection byla použita další diagnostická souprava pro zjištění rezistence k rifampicinu a isoniazidu (Anyplex TM plus MDR-TB Detection). Tato metoda byla porovnána s kultivační metodou ke stanovení citlivosti základní řady antituberkulotik. Pro M. tuberculosis komplex byla použita metoda minimálních inhibičních koncentrací. Obrázek Znázornění průběhu testovaných klinických materiálů 4

Legenda: AccuProbe detekční souprava; HAIN CM, AS detekční soupravy GenoType ; L-J půda Löwenstein-Jensenova; MGIT půda Mycobacteria Growth Indicator Tube; MIC metoda minimální inhibiční koncentrace; NK nukleová kyselina Poslední třetí molekulárně biologická metoda Anyplex TM II MTB/MDR/XDR Detection byla použita ke stanovení kmenů MDR-TB a XDR-TB. Testované vzorky byly použity z archivovaných vykultivovaných kultur Mycobacterium tuberculosis získaných z pracovišť Oddělení klinické mikrobiologie Thomayerovy nemocnice v Praze a z Centra klinických laboratoří Zdravotního ústavu v Ostravě. Metoda Anyplex TM II MTB/MDR/XDR Detection byla porovnána s kultivační metodou ke stanovení citlivosti antituberkulotik. Pro stanovení citlivosti základní řady antituberkulotik u M. tuberculosis komplex byla použita metoda minimálních inhibičních koncentrací. Pro stanovení rozšířené citlivosti na antituberkulotika byly kmeny testovány v Národní referenční laboratoři pro mykobakterie ve Státním zdravotním ústavu v Praze. Celkové schéma práce znázorňuje Obrázek. 5

3 Výsledky 3.1 Klinický materiál 3.1.1 Vzorky testované na MTB a NTM, metoda Anyplex TM plus MTB/NTM Detection, mikroskopie a kultivace Celkem bylo vyšetřeno kultivací a molekulárně biologickou metodou 1521 vzorků. Vzhledem k tomu, že se neprovádělo mikroskopické vyšetření u vzorků močí a laryngálních výtěrů, bylo mikroskopií vyšetřeno pouze 1464 vzorků. Vlivem občasné kontaminace některých vzorků v některých metodách nebylo možné zahrnout tyto kontaminované vzorky do porovnání těchto metod. Největší zastoupení klinických vzorků tvořil materiál získaný z dýchacího systému, zejména sputum s celkovým zastoupením 50,8 % a materiál z dolních cest dýchacích 25,8 % (bronchoalveolární laváže, aspiráty, odsátí, sekret). Dále byly testovány tkáně (převážně plicní ložiska, uzliny), punktáty, moč, výtěry z laryngu, hrudní výpotky, stěry, sekrety, likvor, žaludeční laváž a jiné materiály (obsah abscesu, hnis, atd.). 3.1.2 Vzorky testované na MDR-TB, metoda Anyplex TM plus MDR-TB Detection a metoda MIC Při testování MDR-TB bylo otestováno celkem 64 rutinně získaných klinický vzorků z obou výše uvedených pracovišť a 5 vzorků bylo získaných z Národní referenční laboratoře pro mykobakterie, SZÚ Praha. Vzorky byly testované v období od ledna do prosince roku 2013. Vzorky byly současně otestovány kultivační metodou minimální inhibiční koncentrace pro stanovení citlivosti na antituberkulotika. Nejčastějším klinickým vzorkem bylo sputum (63,8 %), dále jiné materiály (obsah abscesu, obsah břišního drénu, ložisko, katetry, hnis, gynekologický materiál, atd.) byly zastoupeny (v 13,0 %), tkáně (7,3 %), materiály z dolních cest dýchacích (5,8 %), punktáty (2,9 %) a hrudní výpotek, stěr, sekret, likvor a žaludeční laváž v 1,5 %. 6

3.1.3 Vzorky testované na MDR/XDR, metoda Anyplex TM II MTB/MDR/XDR Detection a metoda MIC Molekulárně biologickou metodou Anyplex TM II MTB/MDR/XDR Detection a současně fenotypovým stanovením metodou MIC bylo celkem otestováno 47 vykultivovaných archivovaných kultur Mycobacterium tuberculosis. Fenotypové stanovení citlivosti u části kmenů bylo stanoveno již před použitím molekulárně biologické metody. U některých kmenů citlivých na základní řadu antituberkulotik již nebylo provedeno rozšířené stanovení citlivosti na fluorochinolony a injekční léčiva. 3.2 Porovnání molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MTB/NTM Detection, mikroskopie a kultivačních metod při detekci M. tuberculosis a atypických mykobakterií z klinického materiálu Byly porovnány mikroskopie a molekulárně biologická metoda k detekci M. tuberculosis a atypických mykobakterií s kultivačními metodami. Jako kultivační metody byly použity tzv. metabolická kultivační metoda MGIT a klasické kultivační metody (na půdách Löwenstein-Jensenově, Ogawově nebo tekuté půdě Šulově). 3.2.1 Porovnání mikroskopie a metabolické kultivační metody MGIT Při porovnání mikroskopie s metabolickou kultivační metodou MGIT bylo otestováno celkem 1330 klinických vzorků. Došlo k vzájemné pozitivní shodě obou metod u 113 vzorků a k negativní shodě u 1100 vzorků. U 26 vzorků byla pozitivní mikroskopie a negativní MGIT. Naopak u 91 vzorků byla negativní mikroskopie a pozitivní metabolická kultivační metoda. Zjištěné hodnoty senzitivity vyjadřují, že mikroskopie zachytila pouze 55,4 % pozitivních výsledků detekovaných metodou MGIT. Hodnoty specificity vyjadřují, že mikroskopie zachytila v 97,7 % negativní výsledek shodně s kultivační metodou MGIT. 7

3.2.2 Porovnání mikroskopie s klasickými kultivačními metodami Při porovnání mikroskopie s klasickými kultivačními metodami bylo vyšetřeno 1363 vzorků. Došlo k vzájemné pozitivní shodě obou metod u 115 vzorků a k negativní shodě u 1139 vzorků. U 35 vzorků byla pozitivní mikroskopie a negativní kultivační metoda. U 74 vzorků byla negativní mikroskopie a pozitivní kultivační metoda. Zjištěné hodnoty senzitivity vyjadřují, že mikroskopie zachytila pouze 60,9 % případů pozitivních výsledků detekovaných klasickými kultivačními metodami. Hodnoty specificity vyjadřují, že mikroskopie zachytila v 97,0 % negativní výsledek shodně s klasickými kultivačními metodami. 3.2.3 Porovnání molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MTB/NTM Detection a metabolické kultivační metody MGIT Při porovnání molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MTB/NTM Detection a MGIT bylo vyšetřeno celkem 1384 klinických vzorků. Do porovnání nebyly zahrnuty vzorky, které byly kontaminovány v průběhu kultivace. Výsledky pro M. tuberculosis (MTB) a pro atypické mykobakterie (NTM) byly porovnány odděleně. Při porovnání výsledků detekce MTB molekulárně biologickou metodou a MGIT došlo k vzájemné pozitivní shodě obou metod u 94 vzorků a k negativní shodě u 1125 vzorků. U 20 vzorků byla pozitivní molekulárně biologická metoda a negativní metabolická kultivace. U 15 vzorků byla negativní molekulárně biologická metoda a pozitivní metabolická kultivace. Hodnoty senzitivity vyjadřují, že molekulárně biologické metoda Anyplex TM plus MTB/NTM Detection zachytila MTB v 86,2 % pozitivních výsledků detekovaných metodou MGIT. Hodnoty specificity vyjadřují, že molekulárně biologické metoda Anyplex TM plus MTB/NTM Detection zachytila v 98,3 % negativní výsledek na MTB shodně s kultivační metodou MGIT. Při porovnání detekce NTM molekulárně biologickou metodou a metabolickou kultivací došlo k vzájemné pozitivní shodě obou metod u 36 vzorků a k negativní shodě u 1125 vzorků. U 5 vzorků byla pozitivní molekulárně biologická metoda a negativní metabolická kultivace. U 59 vzorků byla negativní molekulárně biologická metoda a 8

pozitivní metabolická kultivace. Tyto hodnoty senzitivity vyjadřují, že molekulárně biologické metoda Anyplex TM plus MTB/NTM Detection zachytila NTM v 37,9 % pozitivních případech výsledků detekovaných metodou MGIT. Hodnoty specificity vyjadřují, že molekulárně biologické metoda Anyplex TM plus MTB/NTM Detection zachytila v 99,6 % negativní výsledek na NTM shodně s metodou MGIT. 3.2.4 Porovnání molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MTB/NTM Detection a klasické kultivace mykobakterií Při porovnání molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MTB/NTM Detection s klasickou kultivací mykobakterií na pevných půdách Löwenstein- Jensenově, Ogawově a v tekuté Šulově půdě bylo vyšetřeno celkem 1419 klinických vzorků. Do porovnání nebylo zahrnuto 110 vzorků, které byly kontaminovány v průběhu kultivace. Výsledky pro M. tuberculosis (MTB) a pro atypické mykobakterie (NTM) byly porovnány odděleně. Při porovnání obou metod na detekci MTB došlo k vzájemné pozitivní shodě u 97 vzorků a k negativní shodě u 1170 vzorků. U 25 vzorků byla pozitivní molekulárně biologická metoda a negativní kultivace. U 17 vzorků byla negativní molekulárně biologická metoda a pozitivní kultivace. Tyto hodnoty senzitivity vyjadřují, že molekulárně biologické metoda Anyplex TM plus MTB/NTM Detection zachytila MTB v 85,1 % pozitivních případech výsledků detekovaných kultivační metodou. Hodnoty specificity vyjadřují, že molekulárně biologické metoda Anyplex TM plus MTB/NTM Detection zachytila v 97,9 % negativní výsledek na MTB shodně s kultivační metodou. Při hodnocení diagnostiky NTM molekulárně biologickou metodou a kultivací došlo k vzájemné pozitivní shodě obou metod u 34 vzorků a k negativní shodě u 1170 vzorků. U 6 vzorků byla pozitivní molekulárně biologická metoda a negativní kultivace. U 44 vzorků byla negativní molekulárně biologická metoda a pozitivní kultivace. Tyto hodnoty senzitivity vyjadřují, že molekulárně biologické metoda Anyplex TM plus MTB/NTM Detection zachytila NTM v 43,6 % pozitivních případech výsledků detekovaných kultivační metodou. Hodnoty specificity vyjadřují, že 9

molekulárně biologické metoda Anyplex TM v 99,5 % negativní výsledek na NTM shodně s kultivační metodou. plus MTB/NTM Detection zachytila 3.3 Porovnání molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MDR-TB Detection pro detekci rezistence M. tuberculosis na rifampicin a isoniazid s kultivačním stanovením rezistence (MIC) z přímého klinického materiálu Při tomto porovnání byly použity pouze pozitivní amplifikační produkty na Mycobacterium tuberculosis získané z Anyplex TM 10 plus MTB/NTM Detection molekulárně biologické metody. Tato metoda určovala u Mycobacterium tuberculosis genetickou rezistenci na isoniazid a rifampicin. Získané výsledky molekulárně biologické metody byly porovnány s fenotypovým stanovením rezistence v kultivačních médiích s antituberkulotiky metodou minimálních inhibičních koncentrací (MIC). Z celkového počtu 69 testovaných vzorků se nepodařilo 3 vzorky vykultivovat pravděpodobně z důvodu špatné nebo žádné životaschopnosti mykobakterií. U zbylých 66 testovaných vzorů došlo ke stoprocentní shodě výsledků molekulárně biologické metody s fenotypovým stanovením rezistence u mykobakterií v kultivačním médiu s danými antituberkulotiky INH a RIF. U 59 testovaných kmenů se jednalo o kmeny citlivé na rifampicin a isoniazid. U 7 testovaných vzorků byla zaznamenána rezistence na alespoň jedno antituberkulotikum. Ve 4 případech se jednalo o monorezistentní kmeny, a to u 1 vzorku na rifampicin a ve 3 vzorcích na isoniazid. U 3 vzorků byla detekována rezistence na rifampicin a isoniazid. V 6 případech (9,1 %) došlo k inhibici vnitřní kontroly molekulárně biologické metody a bylo nutné test zopakovat. Počáteční množství DNA bylo nutné naředit v poměru 1:20 v destilované vodě bez RNA-áz a následně byl znovu proveden test pomocí Anyplex TM plus MTB/NTM Detection a následně i test Anyplex TM plus MDR- TB Detection. Získané výsledky po zopakování molekulárně biologické metody byly ve shodě s fenotypovým stanovením citlivosti na antituberkulotika. V jednom případě nebyl výsledek molekulárně biologické metody zcela jednoznačný, kdy vykazoval rezistenci k isoniazidu. Pro tento vzorek byla kultivační metodou stanovena senzitivita k isoniazidu s hodnotou MIC 0,125 mg/ml. Tento vzorek byl molekulárně biologickým testem zopakován s výsledkem senzitivní k isoniazidu.

3.4 Porovnání molekulárně biologické metody pro detekci MDR a XDR kmenů M. tuberculosis Anyplex TM II MTB/MDR/XDR Detection s fenotypovým stanovením rezistence (MIC) u již vykultivovaných kmenů Při porovnání detekce MDR a XDR kmenů Mycobacterium tuberculosis molekulárně biologickou metodou Anyplex TM MTB/MDR/XDR Detection s fenotypovým stanovením metodou MIC bylo celkem otestováno 47 vykultivovaných kultur. Znázornění rezistentních výsledků získaných molekulárně biologickou metodou a kultivační metodou pro stanovení citlivosti na antituberkulotika. Podle molekulárně biologické metody bylo 25 testovaných kmenů citlivých k antituberkulotikům základní řady, isoniazidu, rifampicinu, ethambutholu a streptomycinu. To odpovídá 53,2 % všech testovaných kmenů. Při srovnání s fenotypovou metodou (MIC) došlo u 21 kmenů ke shodě ve stanovení citlivosti na testovaná léčiva. U dvou kmenů byla detekována fenotypová monorezistence na isoniazid, která však nebyla molekulárně biologickou metodou zaznamenána. U dvou kmenů nebylo fenotypové stanovení rezistence provedeno. U 22 testovaných kmenů byla zaznamenána genotypová rezistence na antituberkulotika, což odpovídá 46,8 % z celkového počtu testovaných vzorků. Molekulárně biologickou metodou bylo zjištěno 6 monorezistentních kmenů. Ve dvou případech se jednalo o rezistenci na rifampicin a ve čtyřech případech o rezistenci na isoniazid. V porovnání s fenotypovým stanovením došlo v případě těchto 6 monorezistetních kmenů pětkrát ke shodě a jednou k neshodě, kdy fenotypovým stanovením byla detekována rezistence na rifampicin i na isoniazid, kdežto molekulárně biologická metoda detekovala pouze rezistenci na rifampicin. Genotypovou metodou byly detekovány dva multirezistentní kmeny MDR-TB na rifampicin i isoniazid, což odpovídalo 4,3 % z celkového počtu všech testovaných kmenů genotypovou metodou. V porovnání s fenotypovým stanovením došlo v jednom případě ke shodě, ale ve druhém případě k neshodě, kdy kmen vykazoval pouze rezistenci na rifampicin molekulárně biologickou metodou. Největší četnost (počet 11, 52,4 % z celkového počtu) detekovaných rezistentních kmenů stanovených genetickou metodou vykazovaly kmeny současně 11

rezistentní k isoniazidu, rifampicinu a fluorochinolonům. Ve dvou případech došlo k plné shodě s fenotypovým stanovením. Ve dvou případech došlo ke shodě v genotypovém i fenotypovém stanovení rezistence na rifampicin a isoniazid a k neshodě v citlivosti na fluorochinolony, kde molekulárně biologická metoda falešně pozitivně určila rezistenci. V 6 případech byla shoda stanovení rezistence na rifampicin a isoniazid, avšak fenotypová citlivost na fluorochinolony nebyla provedena. V jednom případě byla stanovena shoda genotypové i fenotypové metody rezistence na isoniazid a rifampicin a neshoda pří stanovení rezistence na injekční léčiva, které byly negativní v případě molekulárně biologické metody a pozitivní v případě fenotypové metody. V 1 případě byla současně stanovena genotypovou i fenotypovou metodou rezistence na rifampicin, isoniazid a injekčně podávaná antituberkulotika s rezistencí genu rrs k streptomycinu. Molekulárně biologickou metodou byly detekovány dva kmeny multirezistentní XDR-TB. V obou případech došlo ke shodě genetické a fenotypové metody. Z celkového počtu 20 genově stanovených rezistentních kmenů na isoniazid bylo pozorována v 19 případech rezistence v oblasti katg, ve dvou případech rezistence v oblasti katg i inha a pouze u 1 kmenu byla zaznamenána rezistence pouze v oblasti inha. Ve třech případech všech testovaných vzorků byla molekulárně biologickou metodou stanovena rezistence na injekční léčiva v oblasti rrs. Při genetickém testování všech 47 kmenů metodou Anyplex TM plus MDR-TB Detection nebylo nutné žádný test opakovat z důvodu inhibice vnitřní kontroly. 12

4 Závěr Přínosem této práce je prověření využití nové komerční soupravy Anyplex TM plus MTB/NTM Detection k detekci M. tuberculosis a atypických mykobakterií v rutinní laboratorní diagnostice mykobakterií přímo z klinického materiálu jako doplňkové metody ke kultivačnímu stanovení. Výsledky práce ukázaly vysoké hodnoty senzitivity a specificity při detekci MTB zkoumanou molekulárně biologickou metodou. Pro detekci NTM molekulárně biologickou metodou byly výsledky senzitivity nízké. Z tohoto důvodu je stále zapotřebí kultivačních metod, které dokáží atypické mykobakterie zachytit. U všech testovaných vzorků došlo ke stoprocentní shodě výsledků molekulárně biologické metody Anyplex TM plus MDR-TB Detection s fenotypovým stanovením rezistence u mykobakterií kultivovaných v kultivačním médiu s danými antituberkulotiky isoniazidem a rifampicinem. Z tohoto důvodu je metoda výborným a velice rychlým detekčním systémem vhodným pro vyhledávací skreening MDR kmenů M. tuberculosis z přímého klinického materiálu pro klinickou laboratorní diagnostiku, který umožní rychlé zahájení adekvátní léčby tuberkulózy. Molekulárně biologická metoda Anyplex TM II MTB/MDR/XDR Detection vykazovala vysokou úspěšnost při genetickém stanovení rezistence u kmenů MDR-TB a XDR-TB M. tuberculosis. Metoda může být použita pro rutinní laboratorní mykobakteriologickou diagnostiku, která urychlí nasazení adekvátní terapie tuberkulózy. V případech výskytu méně časté oblasti rezistence na dané antituberkulotikum, na které nejsou navrženy genetické sondy testu, nebo při výskytu nových genů na rezistenci na dané antituberkulotikum nebo u falešně pozitivního výsledku, který může mít velký negativní dopad po stránce léčebné, sociální, ale i po stránce finančních nákladů s léčbou spojených, je stanovení citlivost na antituberkulotika fenotypovou metodou stále nepostradatelné. 13

Přínosem této práce je: Rozšíření diagnostického spektra pomocí rychlé molekulárně biologické metody i o méně častou oblast laboratorní diagnostiky, a to o atypické mykobakterie, což je významné zejména z pohledu možnosti zahájení včasné adekvátní léčby a přístupu k pacientovi. Možnost rychlé detekce multirezistentních kmenů M. tuberculosis, která pomáhá klinickým lékařům při rozhodnutí o zahájení adekvátní léčby pacienta, jeho hospitalizaci a způsobu ošetřování. Práce přináší informace o výskytu M. tuberculosis v České republice. V průběhu práce byly identifikovány rezistentní kmeny M. tuberculosis na antituberkulotika, které testované metody nedokázaly správně detekovat. Tyto kmeny mohou být využity při dalším rozšiřování schopností testovaných metod. 14

5 Souhrn Tuberkulóza je celosvětově se vyskytující onemocnění s vysokou morbiditou. Jedním ze základních opatření proti tuberkulóze je včasná a účinná terapie. K tomu je nutná co možná nejrychlejší a nejpřesnější diagnostika. V současné době se stále více v laboratorní diagnostice tuberkulózy používají molekulárně biologické metody. Kmeny Mycobacterium tuberculosis komplex jsou často spojeny s tuberkulózou v rozvojových zemích, zatímco mykobakteriózy se nalézají především v rozvinutých zemích. Vzhledem k tomu, že mnoho druhů atypických mykobakterií má sníženou citlivost vůči klasicky používaným antibiotikům, je léčba mykobakterióz zdlouhavá a často dochází k jejich recidivám. Z tohoto důvodu je rychlejší a přesnější diferenciální diagnostika mykobakteriálních infekcí velmi důležitá. Současnou globální hrozbu představují lékově rezistentní kmeny Mycobacterium tuberculosis (MTB). Rozlišujeme multirezistentní kmeny MTB (MDR-TB), které jsou definovány jako rezistentní nejméně ke dvěma antituberkulotikům, rifampicinu a isoniazidu, a extenzivně rezistentní kmeny MTB (XDR-TB), které jsou kromě rifampicinu a isoniazidu také rezistentní na fluorochinolony a nejméně na jedno ze tří injekčních léčiv, jako je kanamycin, capreomycin a amikacin. Terapeutické možnosti pro pacienty, kteří jsou infikováni kmeny MDR-TB a XDR-TB, jsou omezené a léčba se čtyřmi nebo více antituberkulotiky je velice zdlouhavá. Tato práce byla zaměřena na laboratorní diagnostiku M. tuberculosis a atypických mykobakterií a testování citlivosti na antituberkulotika pomocí molekulárně biologických metod. Cílem této práce bylo ověření molekulárně biologických metod ve snaze o zrychlení laboratorní diagnostiky používané v rutinní praxi. 15

6 Summary Tuberculosis is a globally-occurring disease with high morbidity. One of the fundamental measures against tuberculosis is an early and effective therapy. To accomplish it, an accurate and fast diagnostics is required. Nowadays more and more molecular biological methods are used in the laboratory diagnostics of tuberculosis. The strains of Mycobacterium tuberculosis complex are often associated with tuberculosis in developing countries, while mycobacteriosis are found primarily in developed countries. Given that many types of atypical mycobacteria have reduced sensitivity to classically used antibiotics, the treatment of mycobacteriosis is lengthy and often causes relapses. For this reason, faster and more accurate differential diagnostics of mycobacterial infections is very important. The current global threat represent the drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis (MTB). We distinguish multiresistant strains of MTB (MDR-TB) that are defined as resistant to at least two antituberculotics, rifampicin and isoniazid, and extensively resistant strains of MTB (XDR-TB) that are in addition to rifampicin and isoniazid also resistant to fluoroquinolones and at least one of three injectable drugs, such as kanamycin, amikacin and capreomycin. Therapeutic options for patients who are infected by strains of MDR-TB and XDR-TB are limited and treatment with four or more antitubercular drugs are very lengthy. This work is focused on laboratory diagnostics of M. tuberculosis and atypical mycobacteria and susceptibility testing on antitubercular drugs with usage of molecular biological methods. The aim of this study was to validate molecular biological techniques in an attempt to speed up laboratory diagnostics used in routine practice. 16

7 Seznam vlastní odborné a publikační činnosti vztahující se k tématu disertační práce 2013 Konference, Biovendor a.s., Využití rychlé detekce Mycobacterium tuberculosis v praxi, Čermák P., Coufalová, M., Jechová E., (přednáška) 2014 Coufalová M., Polcová V., Vašáková M., Smetana J., Čermák P., Němečková V.: Ojedinělý případ izolovaného výskytu Mycobacterium tuberculosis v perikardiálním výpotku, Epidemiologie Mikrobiologie Imunologie 63, 2014, č. 4, s. 303-306 2016 Seminář Společnosti pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP, Coufalová M.: Detekce multirezistentních kmenů TBC molekulárně biologickými metodami, (přednáška) 17