Externí kontrola kvality sekvenačních analýz

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Externí kontrola kvality sekvenačních analýz"

Jan Kříž
před 6 lety
Počet zobrazení:

1 Externí kontrola kvality sekvenačních analýz Radka Bolehovská 1, Lenka Plíšková 2, Kateřina Hrochová 2 Úsek molekulární biologie, 1 Ústav klinické mikrobiologie 2 Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové

2 Kontrola kvality v molekul. biologii extrahumánní genom s rozvojem real-time PCR po r výrazný rozvoj EHK kontrol, možnost lepšího sledování VKK (řešení) implementace sekvenačních analýz do rutinní diagnostiky (po r ) oblast rezistencí (HIV NRL), HBV, HCV, CMV, HSV oblast typizací genotypizace HCV, HBV; typizace EV; subtypizace chřipky, oblast identifikace původců pomocí širokospektrých PCR identifikace bakteriální DNA, fungální DNA

3 Požadavky na PCR v dg.: citlivost přesnost správnost Kontrola kvality ANALYTICKY VALIDNÍ VÝSLEDKY JAK ZAJISTIT???

4 Jak zajistit - přesnost důkladná validace in-house metod komerční kity CE značka, ale přesto nutná verifikace kitu VKK nutnost udržení kvality PCR (součást každého vyšetření) povinná VKK pozitivní, negativní kontrola a tzv. inhibiční kontrola daného vzorku (naše labo dnes pouze u stand. a nested PCR) X snaha o standardizaci metody zavedení vlastních pravidel VKK pro real-time PCR

5 VKK v naší laboratoři vlastní pravidla (od r ) snaha o standardizaci metody pro real-time PCR (kvalit. i kvantit.) tam, kde máme číslo (Ct hodnota, log absolutní hodnoty) zajistí přesnost, ale NE správnost není referenční materiál, není deklarována nejistota kvantifikovaných standardů nutné vytvoření vlastních pozitivních kontrol pro sledování ve VKK ale jak HODNOTIT??? vlastní pravidla (nutnost objektivity, řešení: vnitřní domluva přesné definovaní, co je pro laboratoř akceptovatelné; dlouhodobé sledování v čase, zápis do labor. info. systému OpenLIMS)

6 Levey-Jenningsův graf v OpenLIMS Ct hodnoty: 1 řád odpovídá 3,32 cyklu ½ řádu (1 SD) odpovídá 2 0,83

7 Levey-Jenningsův graf v OpenLIMS absolut. hodnot: 1 řád odpovídá log 10=1 ½ řádu (1 SD) odpovídá 2 0,25

mezilaboratorní porovnání - není certifikovaný referenční materiál

9 Externí kontrola kvality (EHK) PROČ?? - objektivní nástroj pro zjištění správnosti PCR metod v EG - mezilaboratorní porovnání - není certifikovaný referenční materiál (CRM) - není návaznost na referenční metodu, na SI jednotky - není certifikovaná hodnota s danou nejistotou

Kontrola kvality dnes jedinou možností NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control) produkce více než 90 % WHO standardů (referenčních materiálů)

10 Kontrola kvality dnes jedinou možností NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control) produkce více než 90 % WHO standardů (referenčních materiálů) HBV, HCV, HIV, CMV, EBV, Parvo B19, INF - důležitá mezinárod. role v zajišťování kvality, normalizace produkce standardů a ref. materiálů, příprava EHK, aplikovaný výzkum

Kontrola kvality EHK (EQA) - různá úroveň kvality ČR Národní referenční laboratoře (NRL) EHK HBV, HCV, CMV, HSV, VZV, HPV (účast do 30 laboratoří) zahraničí účast až 200 laboratoří Quality Control

11 Kontrola kvality EHK (EQA) - různá úroveň kvality ČR Národní referenční laboratoře (NRL) EHK HBV, HCV, CMV, HSV, VZV, HPV (účast do 30 laboratoří) zahraničí účast až 200 laboratoří Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD) EU, drahé, ale nutné (neustálá tvorba nových kontrol, účast v cca 29 EHK, cena 1 je okolo Kč; náročnější, kontrola citlivosti PCR) - Instand e.v. Německo (není tolik náročná)

12 Co sekvenační analýzy?? EHK (EQA) jediný objektivní nástroj pro kontrolu procesu sekvenace vývoj zejména v posledních letech 2012 HBV rezistence 2013 HCV rezistence (reakce na DAA NS3 proteáza) - antivirová citlivost chřipky - vankomycin rezistentní enterokoky CMV rezistence 2016 HSV rezistence - průkaz a identifikace bakteriální DNA (16S rrna) 2017 typizace EV - identifikace původců sepse (bakteriální 16S rrna)

13 Co sekvenační analýzy?? Rezistence (CMV, HSV, HCV, HBV) + kontrola sekvenace (často dlouhé úseky nutné spojení úseků, oprava chyb na začátku a konci sekvenace) - kontrola přečtených bazí, porovnání s neznámou referenční sekvencí a identifikace mutací v daných kodonech (informace o kodonech) - označené mutace neodpovídají klinicky vyhodnoceným mutacím vedoucích k lékové rezistenci (fenotypovému projevu) postanalytická fáze a klinická interpretace stále není součástí hodnocení

14 598 není mutace G598G 603 mutace záměna TGC/T za TGG cystein za tryptofan CMV rezistence gen UL97

15 CMV rezistence gen UL54

16 účast 35 laboratoří ze 17 států

19 Co sekvenační analýzy (SA)?? typizace (genotypy HCV, HBV, typizace EV) vydán typ, který je v rámci EHK zhodnocen + kontrola celého procesu, testování citlivosti metod (klinická interpretace není nutná) identifikace bakterií (16S rrna) broad-range PCR, nesmí být extrémně citlivé (kontaminace) identifikace bakterií pomocí 16S rrna - identifikace původců krevních sepsí problém duální infekce!!! - limitace - použití

22 Výsledek PCR/SA Pozadí metod - VKK - EHK známá nejistota

23 Děkuji za pozornost.

Podobné dokumenty

VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII Plíšková L., Hrochová K., Kutová R. Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové PREANALYTICKÁ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII