Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - Detektory - I Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
HPLC - Detektory A.Braithwaite and F.J.Smith; Chromatographic Methods, Fifth edition, Blackie Academic & Professional 1996 Colin F. Poole and Salwa K. Poole; Chromatography Today, Elsevier Amsterdam 1995 www.esainc.com Melissa J. Wilcox, Raaidah Saari-Nordhaus Application Note, A sensitive, flexible, dual-mode evaporative light scattering detector
1.2.4. Detektory pro HPLC Ideální detektor by měl mít následující vlastnosti: Vysokou citlivost Vysokou selektivitu nebo univerzálnost Dobrou stabilitu a reprodukovatelnost Lineární odezvu několik řádů Malý vnitřní objem Rychlou odezvu Nezávislou odezvu na změně teploty a tlaku Nedestruktivní detekci Spolehlivost
Neexistuje tak univerzální a citlivý detektor jako je FID v plynové chromatografii Často detektor nezaznamenává všechny látky Je nutno provést kalibraci detektoru-obvykle pro každou složku zvlášť V HPLC se především používají následující typy detektorů: Optické Elektrochemické Hmotnostní
1.2.4.1. Optické detektory Nejužívanější detektor Zdroje záření: Nízkotlaká rtuťová lampa s maximem 254 nm, pro měření na 254 nm, případně na 280 nm + filtry Deuteriová lampa, pro měření v oblasti od 190 nm 400 nm Wolframová lampa, pro měření v oblasti od 400 nm do 700 nm Xenonová lampa, pro měření v oblasti od 190 nm 800 nm Odezva detektoru závisí na složce a na použité vlnové délce, Beer-Lambert => A=ε * d * c ε je molární absorpční koeficient [l mol -1 cm -1 ], d je síla kyvety [cm], c je látková koncentrace [mol l -1 ] U aromatických složek se molární absorpční koeficienty mění až o 3 řády podle struktury molekuly a počtu jader
Fotometrický detektor - měření na jedné vlnové délce
Detekce aromátů a látek majících dvojné vazby Objem analytické cely - ~5 µl-10 µl Optická dráha ~ 1 cm Lze užít pro gradientové separace Dobrý dynamický rozsah 10 4-10 5 Malá citlivost na nestabilitu průtoku a teploty Šířka pásu ~ 8-10 nm, vliv na citlivost a na L-B zákon Podle konstrukce detektoru malá nebo relativně velká citlivost k indexu lomu solventu Konstrukce měrné cely je velmi podstatná
Komerčně jsou vyráběny detektory umožňující programování měřící vlnové délky v čase => zvýšení citlivosti a selektivity detekce Detektor s proměnnou vlnovou délkou
Některé detektory umožňují současné měření při dvou vlnových délkách => možnost ověření čistoty píku
PDA detektor (Photodiode-Array) Umožňuje kontinuální skenování celého spektra eluátu po dobu analýzy bez zastavování toku Reverzní optika viz schéma Detektor nemá žádné pohyblivé díly vysoká spolehlivost a přesnost Celé spektrum záření z cely je rozkládáno holgrafickou mřížkou na záření o jednotlivých vlnových délkách Záření o vymezených vlnových délkách dopadá na lineární pole až 1024 fotodiod na křemíkovém čipu, každá fotodioda má spektrální rozlišení ~ 1.2 nm Absorpční spektra jsou produkována velkou rychlostí - 0.01 sec na 1 spektrum Spektra jsou vynesena např. jako funkce vlnové délky a času, 3D mapa je nastavitelná podle všech os, umožní prohlížení v různých úhlech, ale existuje ještě mnoho různých 2D způsobů prohlížení dat Spektra jsou používána k identifikaci složek - knihovny spekter Spektra jsou také důležitá při kontrole čistoty píku algoritmy
PDA detektor
Fluorimetrický detektor Konstrukčně podobný fotometrickým detektorům Měří se fluorescenčí záření - látka je excitována zářením o určité vlnové délce a emituje záření s vyšší vlnovou délkou Detektor je vybaven filtry v excitační a emisní části, monochromátory nebo kombinací filtru a monochromátoru Obvykle pravoúhlé uspořádání s parabolických zrcadlem pro zlepšení citlivosti Zdrojem záření je xenonová nebo deuteriová výbojka Možnost snímání excitačního a emisního spektra Látky vykazující fluorescenci mají obvykle konjugovanou cyklickou strukturu, např. PAH Mnoho nefluoreskujících látek je možno vhodně derivatizovat
Výhody: Vysoká citlivost 10 1000 x lepší než fotometrický detektor Vysoká selektivita Linearita ~ 10 3 Malá citlivost na změny teploty a průtoku Nevýhody: Pokud je při použité vlnové délce absorbance eluentu větší než 0.05 může dojít ke koncentračnímu zhášení, proto se používají rozpouštědla neabsorbující v UV oblasti, alifatické uhlovodíky, alifatické alkoholy, některé ethery apod.
2,3-diaminophenazine (DAP) - CARBAMATE