Kapalinová chromatografie

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Kapalinová chromatografie"

Michaela Musilová
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Kapalinová chromatografie LC - mobilní fáze kapalina, která proudí kolonou naplněnou stacionární fází 1 - adsorpční chromatografie (LSC) tuhá látka jako sorbent (použití méně často proti LLC) 2 -rozdělovací chromatografie (LLC) kapalina na pevném nosiči (používána především) -na normální fázích (původní starší uspořádání) - stacionární fáze je polární a mobilní nepolární kapalina; - na obrácených (reverzních fázích) stacionární je nepolární kapalina, mobilní je polární kapalina Důležité především LLC a LSC prováděné jako tzv. vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography HPLC) na kapalinových chromatografech s vysokým tlakem kapaliny. Analyzovaný vzorek je dávkován jako kapalina (nemusí být těkavý) Při dělení se uplatňují interakcí (silové působení mezi molekulami) dělená složka-stacionární fáze a také interakce složka-mobilní fáze

obrácených (reverzních fázích) stacionární je nepolární kapalina, mobilní je polární kapalina Důležité především LLC a LSC prováděné jako tzv.

2 Vzájemná silová působení mezi částicemi kapalin jsou větší než mezi částicemi plynu. Volba mobilní fáze pak hraje větší roli než u plynové chromatografie. Použití při analýze organických látek; LC je proti GC použitelná pro analýzu méně těkavých a tepelně nestálých organických látek, a tedy i většího počtu látek než GC (GC potřebuje vzorek v plynném stavu, kapalné látky musíme zplynit vyšší teplotou) 3 - iontově výměnná (IEC) stacionární fáze ionex (iontoměnič) iontově výměnná chromatografie je vhodná pro analýzu anorganických sloučenin, respektive disociovaných iontů velmi vhodné pro stanovení aniontů (sírany, dusičnany, dusitany, chloridy, fluoridy) 4 - gelová chromatografie (GPC, tj. Gel Permeation Chromatography), neboli také vylučovací (SEC, tj. Size Exclusion Chromatography) stacionární fází je gel, na něm se složky dělí dle velikosti molekul. malé lokelui pronikají hluboko do pórů a jsou pomalejší než velké molekuly. Metoda se používá pro separaci látek s velkými molekulami - biopolymery např.) proteiny.

stavu, kapalné látky musíme zplynit vyšší teplotou) 3 - iontově výměnná (IEC) stacionární fáze ionex (iontoměnič) iontově výměnná chromatografie je vhodná pro analýzu anorganických sloučenin,

3 Kapalinová chromatografie adsorpční (LSC) rozdělovací (GLC) v uspořádaní jako HPLC - zásobníky mobilní fáze - zřízení pro tvorbu gradientu -směšování - vysokotlaké čerpadlo - dávkovací zařízení - kolona - detektor - registrační zařízení (zapisovač, integrátor, PC) Směšovací zařízení většinou se pracuje se směsí několika kapalin mění svoje složení v průběhu separace (gradientová eluce)

zařízení - kolona - detektor - registrační zařízení (zapisovač, integrátor, PC) Směšovací

4 - nízkotlaké směšování - vysokotlaké směšování Programátory tvorby gradientu. Vysokotlaké čerpadlo musí zajistit konstantní (nebo programovatelný) bezpulsní průtok (ca. 0,1-10 ml/min) při tlacích do ca. 60 mpa. - pneumatická čerpadla - pneumatická čerpadla s membránou - typ injekční stříkačka - pístová čerpadla - membránová čerpadla Tlumiče pulsů: kapacitní a odporové Dávkovací zařízení dávkuje se typicky ca. 1 až 100 µl, někdy více (při on-column prekoncentraci), v mikrokolonové chromatografii pod 1 µl. - septové dávkovače - stop flow dávkovače - smyčkové dávkovače Kolona chromatografu je rovnoměrně vyplněna jemnými zrníčky - velký odpor proudící kapalné fázi, takže je nutno protlačovat mobilní fázi s vysokými tlaky (viskozita kapalin je větší než plynů) materiál: kov (nerez), sklo, plasty (radiální komprese) rozměry: vnitřní průměr asi od 3 do 6 mm, délka asi od 5 do 30 cm (předkolony kratší, např. 3 cm). V mikrokolonové chromatografii se používají průměry pod 1 mm.

- pneumatická čerpadla - pneumatická čerpadla s membránou - typ injekční stříkačka - pístová čerpadla - membránová čerpadla Tlumiče pulsů: kapacitní a odporové Dávkovací zařízení dávkuje se typicky

5 Fáze při kapalinové rozdělovací chromatografii (LLC) Stacionární fáze - kapalina zakotvená na pevném nosiči. Nebezpečí vymývání zakotvené fáze. Proto se zakotvují molekuly kapaliny na nosiči vytvořením chemické vazby. Např. na hydroxylové skupiny silikagelu se vážou molekuly zakotv. fáze (R) tzv. silanizací - zachycení vazbami Si O - Si (např. reakcí s příslušným trialkylchlorsilanem) Při použití reverzních fází (tj. obrácené fáze) zachyceny nepolární molekuly - uhlovodíky s více či méně uhlíky 18 C (oktadecyl - zkratka ODS) - nejčastěji 8 C (oktyl) či -C2H5, -CH3, fenyl Mobilní fáze je polárn, pracuje se směsí dvou či tří kapalin, (např. voda, acetonitril). Její polarita může být během eluce snižována (tak, že se jejíž složení se během chromatografie řízeně dle programu mění). eluční síla mobilní fáze roste v řadě voda, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran, aceton

silanizací - zachycení vazbami Si O - Si (např. reakcí s příslušným trialkylchlorsilanem) Při použití reverzních fází (tj.

6 (nejnižší schopnost eluovat nepolární složky má voda, teoreticky nejvyšší by měly nasycené uhlovodíky) Na stacionární fázi jsou více zadržovány složky nepolární a rychleji opouštějí kolonu polární složky. Obr. LLC chromatografie s nepolární stacionární fází a s polární pohyblivou fází (tzv. chromatografie na reverzních fázích - RPC). Většími silami jsou na stacionární fázi poutány složky nepolární Fáze při kapalinové adsorpční chromatografii (LSC) Jako stacionární fáze (náplň kolony) se používají zrnité adosrbenty s velkým povrchem - silně polární Silikagel (SiO2 x H2O) polární adsorbent kyselé povahy (ph = 3 až 5)a Alumina (Al2O3) polární adsorbent zásaditý (ph = 8 až 11) Mobilní fáze eluční činidlo

Většími silami jsou na stacionární fázi poutány složky nepolární Fáze při kapalinové adsorpční chromatografii (LSC) Jako stacionární fáze (náplň kolony) se používají zrnité

7 nepolární nebo slabě polární kapaliny např. používá vhodná směs kapalin, jejíž složení je v průběhu dělení měněno tak, že eluční schopnosti činidla rostou (např. hexan jako rozpouštědlo s nulovou eluční silou a ve směsi s diethyletheru nebo dichlormethanu) - detektor Obecné požadavky: - citlivost - linearita odezvy - nízký šum (vysoký poměr mezi signálem a šumem), meze detekce na úrovni g/ml - stabilita signálu (malý drift) - malá citlivost na změnu průtoku a tlaku

hexan jako rozpouštědlo s nulovou eluční silou a ve směsi s diethyletheru nebo dichlormethanu) - detektor Obecné

8 - možnost gradientové eluce - malý mimokolonový příspěvek k mrtvému objemu (objem v µl) Veličiny využívané k detekci v LC: absorpce záření fotometrické detektory (UV, VIS, IR), DAD index lomu refraktometrický detektor fluorescence fluorimetrický det. elektrolytický proud polarografický det. elektrická vodivost vodivostní det. permitivita kapacitní, permitivitní det. elektrodový potenciál potenciometrický det. (Pt, Cu, ISE) ionizační proud transportní plamenoionizační det. radioaktivita radiometrický det. rozptyl světla ELS (evaporative light scattering) det. Kombinované (hyphenated) techniky: HPLC-MS - stanovení a detekce organických látek ve složitých směsích a při velmi nízkých koncentracích HPLC-AAS, HPLC-ICP AES

permitivita kapacitní, permitivitní det. elektrodový potenciál potenciometrický det. (Pt, Cu, ISE) ionizační proud transportní plamenoionizační det. radioaktivita radiometrický det.

9 Příklady aplikací HPLC Separované látky Chromatografický systém aromatické uhlovodíky, chlorované a C18 acetonitril + voda oxidační produkty ve vodě polycyklické uhlovodíky C18 methanol ve vodě, gradient polycyklické aromatické uhlovodíky C18 methanol (acetonitril) ve vodě, různé typy gradientů chlorfenoly C18 acetonitril ve vodě, gradient chlorované fenoly C18 gradient methanolu ve fosfátovém pufru, ph 4 kys. malonová, mléčná, octová,... katex roztoky kyselin (mechanismus iontové výluky) aromatické kyseliny (benzoová, salicylová, acetylsalicylová, hydroxybenzoová) C8 fosfátový pufr+tetraalkylamonná sůl ve směsi voda/acetonitril aromatické kyseliny (benzoová, hydroxybenzoová, aminobenzoová, nitrobenzoová, halogenbenzoové) C18 síran sodný ve směsi voda/methanol lipidy v potravinách silikagel hexan a octan ethylnatý v toluenu, gradient katecholaminy v tělních tekutinách C18 0,2M kys. octová aromatické aminosloučeniny (difenylamin) silikagel pentan+methanol volné aminokyseliny Lichrosorb NH 2 fosfátový pufr (ph 4,3) ve směsi acetonitril/voda, gradient organofosfátové pesticidy C18 methanol (acetonitril) ve vodě, gradient fenoxykarboxylové kyseliny C18 fosfátový pufr ve směsi methanol/voda, gradient

fosfátovém pufru, ph 4 kys. malonová, mléčná, octová,.

10 Příklad aplikačního listu výrobce chromatografu Analýza pesticidů na bázi karbamáty metodou LLC - MS Stac. fáze C18 a předepsané rozměry kolony Mobilní fáze - eluenty 0,1 % mravenčí kyselina v DI vodě 0,1 % mravenčí kyselina v acetonitrilu Míchány s předepsaným programem gradientu Předepsána rychlost průtoku a teplota Carbamate pesticides on Kinetex C18, 5u with LC/MS/MS detection

fáze C18 a předepsané rozměry kolony Mobilní fáze - eluenty 0,1 % mravenčí kyselina v DI vodě

11 Application detalapplication Detail (App ID: 22064) Analytical detail Column: Kinetex 5µm C Å, LC Column 150 x 2.1 mm, Ea Part No:00F-4601-AN Dimensions:150 x 2.1 mm ID Order Recommended Products for this Application Elution Type:Gradient Elution A:0.1% formic acid in DI H2O Elution B:0.1% formic acid in Acetonitrile Gradient Profile: Step No. Time (min) Pct A Pct B Flow Rate:200 µl/min Col. Temp: 42 C Detection: Mass Spectrometer amu (0 C) Detector Info: AB Sciex API 4000 Názvy pesticidů 1 Oxamyl 2 Methomyl 3 3-OH-Carbufuran 4 Aldicarb 5 Propoxur 6 Carbofuran 7 Carbaryl 8 Methiocarbs

Podobné dokumenty

mobilní fáze pohyblivá - obsahuje dělené látky, které mají různou afinitu ke stacionární fázi.

separační metody Chromatografické metody Distribuce látky mezi dvě fáze: stacionární fáze nepohyblivá - ukotvený materiál mobilní fáze pohyblivá - obsahuje dělené látky, které mají různou afinitu ke stacionární