Ing. Miloš Faltus, Ph.D. Ing. Petr, Svoboda, CSc. RNDr. Alois Bilavčík, Ph.D. Ing. Jiří Zámečník, CSc. UPOZORNĚNÍ! Uvedená metodika neprošla dosud oponentním řízením a certifikací a její text není definitivní. Poskytovatel metodiky nenese odpovědnost za její užití. Metodika kryokonzervace genetických zdrojů chmele METODIKA Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2018
Metodika je výstupem řešení institucionálního projektu VÚRV, v.v.i. č. RO0418 a výzkumného projektu NAZV QJ1630301. Metodika proběhla oponentním řízením. O uplatnění metodiky byla dne XX. 12. 2018 uzavřena smlouva podle ustanovení 269 zákon č. 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. MZe, jako certifikační orgán, vydal Osvědčení č.j. xxxxx/2018-mze o uznání uplatněné certifikované metodiky dne XX.12. 2018. Autoři: Ing. Miloš Faltus, Ph.D., VÚRV, v.v.i. Praha Ing. Petr Svoboda, CSc., CHI Žatec RNDr. Alois Bilavčík, Ph.D., VÚRV, v.v.i. Praha Ing. Jiří Zámečník, CSc., VÚRV, v.v.i. Praha Název: Vydal: Redakce: Metodika kryokonzervace genetických zdrojů chmele Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06, Praha 6 Ruzyně Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06, Praha 6 Ruzyně Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Náklad: 40 výtisků Vyšlo v roce 2018, první vydání Vydáno bez jazykové úpravy Autor fotografií: Petr Svoboda Kontakt na vedoucího autorského kolektivu: faltus@vurv.cz Oponenti: Ing. Přemysl Landa, Ph.D., Ústav experimentální botaniky AV ČR, Praha Ing. Iva Křížková, Ph.D., Ministerstvo zemědělství ČR Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2018 ISBN 978-80-7427-298-1 2
Miloš Faltus a kol. Metodika kryokonzervace genetických zdrojů chmele METODIKA Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2018 3
Metodika kryokonzervace genetických zdrojů chmele Uchování genetických zdrojů chmele v polních podmínkách je ovlivněno řadou biotických a abiotických stresorů, které přinášejí riziko ztráty cenných položek. Kryokonzervace je metodou, která tato rizika eliminuje a umožňuje bezpečné dlouhodobé uchování genetických zdrojů chmele a je tedy vhodnou metodou uchování nejcennějších položek jako safety duplication, bezpečnostní duplikace. Metoda kryokonzervace je založena na uchování rostlinného materiálu při teplotě kapalného dusíku v životaschopném stavu, kdy jsou všechny procesy ve skladovaném materiálu prakticky zastaveny. Tato metodika popisuje postup přípravy explantátů před kryokonzervací, dehydrataci vzrostných vrcholů, způsob a zásady pro zamražení vzorků i regeneraci kontrolních rostlin, včetně hodnocení životnosti a regenerace explantátů. Uživatelem metodiky je MZe, které ji uplatní v rámci Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství. Klíčová slova: Humulus lupulus, L.; kryoprezervace; konzervace; odrůda Methodology for cryconservation of hop germplasm collection Storage of hop germplasm is endangered by biotic and abiotic stressors in the field conditions, and it is influenced with the risk of valuable accession loss. Cryoconservation is a method, which eliminates the risk and makes a safe long-term storage of plant germplasm possible and it is recommended for storage of the most valuable accessions as a safety duplication. Cryoconservation method is based on storage of plant material at a temperature of liquid nitrogen when all processes are practically stopped but the viability of plant material remains. This methodology describes preparation of plant explants before cryoconservation, apical shoot tip dehydration by cryoprotectants, procedure and principles of long-time plant storage and plant recovery for evaluation of explant survival and regeneration. The Ministry of Agriculture of the Czech Republic is the user of this methodology and it will utilize it in the framework of National Programme on Conservation and Utilization of Plant, Animal and Microbial Genetic Resources for Food and Agriculture. Key words: conservation; cryopreservation; genetic resources;humulus lupulus L. Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2018 4
Obsah: I. Cíl metodiky... 6 II. Vlastní popis metodiky... 6 a) Princip metody... 6 b) Materiál a metody... 6 c) Postup kryoprezervace chmele... 8 d) Označení a uložení kryoprezervovaných vzorků... 15 e) Záznam o provedené kryoprezervaci... 15 f) Stanovení minimálního rozsahu kryoprezervovaných vzorků... 15 III. Srovnání novosti postupů... 17 IV. Popis uplatnění metodiky... 17 V. Ekonomické aspekty... 17 VI. Seznam použité literatury... 19 VII. Seznam publikací... 19 VIII. Dedikace... 20 IX. Jména oponentů:... 20 5
I. CÍL METODIKY Cílem metodiky je definovat nový, inovovaný postup pro dlouhodobé uchování genetických zdrojů chmele pomocí metody kryoprezervace. II. VLASTNÍ POPIS METODIKY A) PRINCIP METODY Podstatou této metody je uchování materiálu při teplotě bodu varu kapalného dusíku (-196 C), kdy se rostlinný materiál nachází v tzv. skelném stavu. Skelný stav je amorfní pevná fáze hmoty, která umožňuje uchování rostlinného materiálu ve stabilním a funkčním stavu. Další důležitou podmínkou bezpečného uchování vzorků je zamezení tvorby ledových krystalů, který letálně poškozuje uložený materiál. I když je chmel obecný (Humulus lupulus, L.) druhem, který snáší mráz, jeho mrazuvzdornost, podobně jako mrazuvzdornost jiných druhů rostlin má své limity. Metoda pro kryoprezervaci chmele tento limit překonává. Otužení nízkou teplotou však zvyšuje účinnost metody kryoprezervace. Proto metoda kryoprezervace chmele využívá vlivu nízké teploty, osmotického přizpůsobení a ochranného účinku sacharosy pro dosažení stavu rostlinného materiálu, který umožňuje překonání vlivu ultranízké teploty v životaschopném stavu. B) MATERIÁL A METODY 1. Přístrojové vybavení Pro provedení metody kryokonzervace je třeba disponovat následujícím přístrojovým vybavením: Práce s tkáňovými kulturami rostlin v in vitro podmínkách Kultivační box, Laminární box Vybavení pro sterilizaci materiálu a kultivačních medií Autokláv, Horkovzdušný sterilizátor Přístroje pro přípravu a uchování kultivačních medií Analytické váhy, přesné váhy, ph-metr, Laboratorní míchačka, Chladnička Vybavení pro stanovení sušiny vzorků Laboratorní sušárna, Analytické váhy Uchování kapalného dusíku a kryopkonzervovaných vzorků Dewarova nádoba na kapalný dusík, Dewarova nádoba pro uložení vzorků v kapalném dusíku Záznamy, výpočty a tisk čárového kódu PC, Tiskárna čárového kódu, Tiskárna 6
2. Chemikálie V následujícím seznamu jsou všechny chemikálie potřebné pro metodu kryokonzervace: Příprava kultivačních medií Destilovaná voda Soli dusičnan amonný, dusičnan draselný, kyselina dihydrogen fosforečná, chlorid vápenatý, síran hořenatý, síran manganatý, síran zinečnatý, síran železnatý, jodid draselný, kyselina boritá, molybdenan disodný, chlorid kobaltnatý, síran měďnatý Vitamíny Thiamin, Pyridoxin, Kyselina nikotinová, Glycin Fytohormony kyselina indolyl máselná, kyselina giberelová, benzylaminopurin Glukosa (P.A.) Agar (Sigma Aldrich) Příprava kryoprezervačního roztoku Desikant Sacharosa (P.A.), Destilovaná voda Silikagel Chladící a skladovací medium: Kapalný dusík 3. Drobné pomůcky Následující pomůcky jsou potřebné pro realizaci metody kryokonzervace chmele: Příprava roztoků a medií Erlenmeyerova baňka 500 ml Odměrný válec 1000 ml Pasteurova pipeta 3 ml Střička Váženky Kultivace rostlin Kultivační zkumavky s hliníkovým uzávěrem 12 x 1,7 cm Stojánek na zkumavky Plastové kultivační nádoby 10 x 10 x 9 cm (Duchefa) Plastové Petriho misky 6 cm Skleněné Petriho misky 15 cm Erlenmeyerova baňka 25 ml Hliníková fokie Izolace a dehydratace vzrostných vrcholů Injekční jehly 0,7 x 40 mm Filtrační papír 11 cm Hliníkové plíšky 20 x 6 x 0,05 mm Nádobky na silikagel 200 ml 7
Skleněné Petriho misky 4, 12, 15 a 20 cm Stříkačky 10 ml Kryokonzervace Stojánek na kryozkumavky Kryozkumavky 1,8 ml Polystyrénový džbán 1L Odtávání vzorků Erlenmeyerova baňka 100 ml Nerezová miska Parafilm 4. Výchozí rostlinný materiál a kultivační podmínky Výchozím materiálem pro aplikaci popisované metody kryoprezervace jsou explantátové kultury chmele v podmínkách in vitro. Explantáty jsou pěstovány v aseptických podmínkách na pevném agarovém mediu v kultivačním boxu při teplotě 25 ± 1 C, hustotě světelného toku 80 µmol m -2 s -1 a fotoperiodě 16/8 h. Plastové krabičky o velikosti 10 x 10 x 9 cm obsahují 100 ml media a třicet jednonodálních stonkových řízků. Pro otužování explantátů se používá stejný režim jako při kultivaci rostlin, ale při snížené teplotě (2 ± 1 C). 5. Složení kultivačních medií Pro kultivaci rostlin se použije agarové kultivační medium podle Murashige a Skooga (1964) se sníženým obsahem dusíku a bez rostlinných fytohormonů (Faltus et al. 2007) se 40 g l -1 glukosy a 7 g l -1 agaru. Toto medium se použije jak pro multiplikaci rostlin, tak pro otužování explantátů před jejich kryoprezervací. Pro regeneraci rostlin se použije regenerační medium, které má stejné složení jako kultivační medium, ale pro vyšší regeneraci rostlin po kroprezervaci obsahuje směs fytohormonů (0,02 mg l -1 kyseliny giberelové, 0,1 mg l -1 kyseliny indolyl máselné, 0,01 mg l -1 6-benzylaminopurinu) (Faltus et al. 2007). 6. Příprava silikagelu pro dehydrataci rostlinného materiálu Dehydratace explantátů chmele probíhá ve skleněných nádobkách (200 ml) s 50 mg vysušeného sterilního silikagelu. Silikagel je sušen dva dny v horkovzdušném sterilizátoru při teplotě 170 C. Poté následuje sterilace při stejné teplotě, ale se zavřenými nádobkami po dobu 10 hodin. C) POSTUP KRYOPREZERVACE CHMELE Postup kryoprezervace explantátů chmele tvoří šest základních kroků: Multiplikace explantátů Otužování explantátů Izolace a otužování vzrostných vrcholů Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem 8
Vlastní kryoprezervace vzrostných vrcholů chmele Hodnocení životnosti a regenerace 1) Multiplikace explantátů Explantáty chmele mají subkultivační interval 6 až 8 týdnů. Z toho vyplývá náročnost při plánování jejich kryoprezervace. Při dvou pasážích rostlin trvá pouze multiplikace rostlinného materiálu pro kryokonzervaci přibližně čtyři měsíce. Explantáty chmele ve stáří 6 až 8 týdnů se použijí pro nařezání nodálních segmentů. Nodální segmenty se kultivují v počtu 30 kusů v krabičkách se 100 ml multiplikačního media. Při první multiplikaci se vysadí jedna krabička s třiceti nodálními segmenty a dalších dvacet explantátů se vysadí do deseti zkumavek pro uchování klonu v in vitro podmínkách. Při druhé multiplikaci se z třiceti rostlin odvodí sto nodálních segmentů a vysadí se do třech krabiček. Postup multiplikace explantátů je schématicky znázorněn na Obrázku 1. 1. multiplikace 2. multiplikace 25 ± 1 C 25 ± 1 C 25 ± 1 C 25 ± 1 C Uchování genotypu Obrázek 1. Postup multiplikace in vitro rostlin chmele 2) Otužování explantátů Nodální segmenty se v počtu 100 kusů vysadí do krabiček s 50 ml multiplikačního media. Od každého genotypu se vysadí 300 nodálních segmentů. Po 7 až 10 dnech kultivace při 25 C se krabičky s nodálními segmenty přenesou do kultivačního boxu s teplotou 2 C. Po 7 až 10 dnech otužování nízkou teplotou se do krabiček s nodálními segmenty aplikuje 25 ml 0,7 M roztoku sacharosy, který se nechá působit dalších 7 až 10 dní. Postup otužování explantátů chmele je znázorněn na Obrázku 2. 3) Izolace a otužování vzrostných vrcholů Vzrostné vrcholy (přibližně 2 mm) se vyřežou z nodálních segmentů pomocí injekční jehly, která se použije jako mikroskalpel. Vrcholy chmele se umístí na 20 hodin při teplotě 22 C do Petriho misky (12 cm) na sterilní filtrační papír nasycený 0,7 M roztokem sacharosy (14 ml) s fytohormony shodného složení jako 9
v regeneračním mediu (0,02 mg l -1 kyseliny giberelové, 0,1 mg l -1 kyseliny indolyl máselné, 0,01 mg l -1 6- benzylaminopurinu) do tmy nebo jsou vrcholy zastíněny (Obrázek 3). Odvození nodálních segmentů Otužování nízkou teplotou 25 ± 1 C 25 ± 1 C 2 ± 1 C Aplikace 0,7 M sacharosy Společné působení nízké teploty a roztoku sacharosy 2 ± 1 C Obrázek 2. Otužování in vitro rostlin chmele působením nízké teploty a 0,7 M sacharózy 25 ± 1 C Izolace vzrostných vrcholů Sycení vrcholů 0,7 M sacharosou Obrázek 3. Sycení vzrostných vrcholů chmele 0,7 M sacharózou Důležitým aspektem je způsob izolace vzrostných vrcholů, který významným způsobem ovlivňuje výslednou regeneraci rostlin. Důležitá je jednotná velikost pro rovnoměrnou dehydrataci jednotlivých vzrostných vrcholů a 10
je třeba postup přizpůsobit růstu jednotlivých segmentů tak, aby velikost izolovaného vrcholu byla vždy přibližně 2 mm s ohledem na růst prvního nodu. V případě přípravy segmentů typu 4c) lze výrazně zvýšit úspěšnost kryoprezervace, respektive regenerace rostlin po kryoprezervaci, protože izolovaný segment v tomto případě obsahuje kromě vrcholového meristému i dva meristémy boční v paždích listů. a) b) c) d) Obrázek 4. Způsob izolace vzrostných vrcholů chmele v závislosti na růstu výhonu. Úsečky přestavují osu řezů mikroskalpelem. 4) Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem Vrcholy chmele nasycené sacharosou se umístí na hliníkové plíšky po deseti kusech a vždy dva plíšky se umístí do jedné Petriho misky (4 cm). Spodní díl Petriho misky s plíšky a explantáty se umístí pomocí sterilní pinzety do nádoby se silikagelem (Obrázek 4). Dehydratace vzrostných vrcholů chmele probíhá při teplotě přibližně 22 C. Dehydratace explantátů probíhá přibližně 1,5 1,75 hodiny do dosažení vlhkosti materiálu přibližně 0,4 g vody na 1 g sušiny. Uvedená doba dehydratace platí pouze pro nádoby a množství silikagelu a rostlinného materiálu, které jsou uvedeny v této metodice; jakákoliv změna způsobuje změnu doby dehydratace vzrostných vrcholů. Obsah vody ve vzorcích je stanoven vážením u kontrolních vzorků, které se připravují shodným způsobem jako vzorky kryoprezervované, ale nejsou uloženy v kapalném dusíku a namísto toho se vysuší v sušárně pro stanovení hmotnosti sušiny. Nejprve je stanovena hmotnost vzorků před dehydratací, poté hmotnost vzorků po dehydrataci a nakonec hmotnost sušiny po dosušení vzorků v sušárně při 105 C po dobu 72 hodin. Umístění vrcholů na plíšky 22 ± 1 C Dehydratace vrcholů nad silikagelem Obrázek 5. Dehydratace vzrostných vrcholů chmele nad silikagelem. Odhad vhodné doby dehydratace vzrostných vrcholů významně ovlivňuje odolnost rostlin vůči působení kapalného dusíku. Optimální doba dehydratace pro dosažení optimálního obsahu vody závisí na velikosti a počátečním obsahu vody ve vzrostných vrcholech (Obrázek 6). Zatímco u malých vzrostných vrcholů o velikosti nižší než 0,7 mg může být optimální doba dehydratace 90 minut, v případě vrcholů větších než 1,7 mg může být doba dehydratace delší než 160 minut. Řešením tohoto problému je příprava vrcholů homogenní velikosti v rozsahu přibližně 1,2 ± 0,3 mg. Ale i v tomto případě může optimální doba dehydratace kolísat v rozmezí 30 minut. 11
Obrázek 6. Závislost doby dehydratace na počátečním obsahu vody a velikosti vzrostného vrcholu. Velikost bodů odpovídá jejich čerstvé hmotnosti. Problémem je, že obsah vody lze stanovit až po 2-3 dní sušení v sušárně, a proto lze obsah vody v průběhu dehydratace lze pouze odhadovat na základě poklesu obsahu čerstvé hmotnosti. Pokles čerstvé hmotnosti v průběhu dehydratace je v lineárním vztahu k poklesu obsahu vody (Obrázek 7). Jedná se o lineární funkci obecného tvaru y = a. x -1. Kde y je obsah vody, x je procento čerstvé hmoty vzhledem k původnímu obsahu před dehydratací. Směrnice přímky, která určuje rychlost poklesu funkce, je v tomto případě ve skutečnosti převrácenou hodnotou procenta sušiny. Každý vzorek však vykazuje specifickou závislost, danou mírně odlišnou směrnicí této závislosti, tedy počátečním obsahem sušiny, respektive vody (Obrázek 7). Obrázek 7. Vztah mezi poklesem čerstvé hmotnosti a obsahu vody během dehydratace. Směrnice závislosti je pro specifická pro jednotlivé vzorky. 12
Porovnáme-li hodnoty těchto směrnice s počátečním obsahem vody vzrostných vrcholů, je patrné, že se jedná o matematickou závislost mezi počátečním obsahem vody ve vzorcích a zmíněnou směrnicí ve tvaru: y = 0,01. x + 0,01, kde y je směrnicí z předchozí závislosti, a zbývající členy rovnice jsou konstanty s hodnotou 0,01. Obrázek 8. Vztah mezi poklesem čerstvé hmotnosti a obsahu vody během dehydratace. Směrnice vztahu mezi poklesem čerstvé hmotnosti a obsahu vody závisí na počátečním obsahu vody a představuje matematickou závislost. Lze tedy definovat vztah mezi počátečním obsahem vody vzrostných vrcholů a potřebným poklesem čerstvé hmotnosti v průběhu dehydratace, který odpovídá požadovanému obsahu vody 0,4 g na g sušiny. Pro výpočet procenta poklesu hmotnosti čerstvé hmoty, která odpovídá obsahu vody 0,4 g. g -1 sušiny, lze použít vzorec: %FW(v/s=0,4) = (0,4+1)/a, kde a je směrnice závislosti mezi obsahem vody a procentem čerstvé hmotnosti vzhledem k hodnotě před počátkem dehydratace z výše uvedené rovnice y = a. x - 1. Pro každou hodnotu počátečního obsahu vody můžeme vypočítat odpovídající hodnotu poklesu čerstvé hmotnosti, kterou můžeme stanovit v reálném čase v průběhu dehydratace (Tab. 1). Tab. 1: Výpočet procenta poklesu čerstvé hmoty na úroveň odpovídající obsahu vody 0,4 g. g -1 sušiny (FW(0,4)) na základě obsahu vody před dehydratací (WC), která ovlivňuje směrnici a, která je převrácenou hodnotou obsahu sušiny (DW). WC (g. g -1 sušiny) 1,8 1,9 2 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3 Směrnice a 0,028 0,029 0,03 0,031 0,032 0,033 0,034 0,035 0,036 0,037 0,038 0,039 0,04 DW (%) 36 34 33 32 31 30 29 29 28 27 26 26 25 FW(0,4) (%) 50 48 47 45 44 42 41 40 39 38 37 36 35 Přesnost doby dehydratace můžeme tedy upřesňovat podle dvou parametrů. Jedním z nich je velikost izolovaných vzrostných vrcholů v úrovni přibližně 1,2 mg a druhým je standardní postup jejich přípravy tak, aby počáteční obsah vody byl v úrovni 2,5 g.g -1 sušiny. Doba dehydratace je pak přibližně 1:40 a pokles čerstvé hmotnosti na 40% původní hmotnosti. 13
5) Vlastní kryoprezervace vzrostných vrcholů chmele Nejprve se připraví polystyrenová nádoba s kryozkumavkami a naplní se kapalným dusíkem. Vysušené explantáty umístěné na hliníkových plíšcích jsou kryoprezervovány prudkým ponořením do kapalného dusíku. Víčko kryozkumavky se nechá mírně uvolněné a tím dochází k pronikání kapalného dusíku přes závit do kryozkumavky v Dewarově nádobě. Postup zamrazení vzorků je znázorněn na Obrázku 5. 22 ± 1 C 196 C Ponoření vrcholů do kapalného dusíku 196 C Uložení vzorků do Dewarovy nádoby Obrázek 6. Zamrazení a uložení vzorků v kapalném dusíku. 6) Hodnocení životnosti a regenerace Po kryoprezervaci se provede odtání kontrolních vzorků chmele. Kryozkumavky se umístí do stojánku s kapalným dusíkem. Pinzetou se rychle vytáhnou hliníkové plíšky s vrcholy z kryozkumavek a ponoří se do vodní lázně o laboratorní teplotě. Explantáty se pomocí pinzety vyjmou z vody a přenesou na regenerační medium s fytohormony (0,02 mg l -1 kyseliny giberelové, 0,1 mg l -1 kyseliny indolyl máselné, 0,01 mg l -1 6- benzylaminopurinu). Vyjmutí vzorků z kapalného dusíku Odtání vzorků ve vodní lázni Hodnocení životnosti a regenerace Vysázení na regenerační medium Obrázek 7. Odtání a regenerace vzrostných vrcholů chmele. 14
Po dvou týdnech kultivace na regeneračním mediu se provede hodnocení životnosti rostlin a po osmi týdnech hodnocení jejich regenerace. Živé explantáty jsou takové, u nichž je patrný růst a nedochází u nich ke ztrátě chlorofylu. Regenerace rostlin je definována jako apikální růst stonku s tvorbou nových nodálních uzlů. D) OZNAČENÍ A ULOŽENÍ KRYOPREZERVOVANÝCH VZORKŮ Kryozkumavky se označí specifickým čárovým kódem. Kód obsahuje pořadové číslo kryoprezervace dané položky, její přesnou lokalizaci ve skladovacím systému a datum jejího uložení. Kryoprezervované vzorky se v označených kryozkumavkách umístí do Dewarovy nádoby naplněné kapalným dusíkem. Z důvodu odparu je třeba zabezpečit jeho pravidelné doplňování kapalného dusíku do Dewarových nádob. E) ZÁZNAM O PROVEDENÉ KRYOPREZERVACI Postup kryoprezervace každé položky se zaznamená v kryoprotokolu, který obsahuje základní a případně další informace o kryokonzervovaných vzorcích a metodě kryokonzervace. Základní údaje: Materiál: Množství: Označení: Kryo: Výsledek: plodina, genotyp, identifikátor ECN, interní identifikátor počet kryoprezervovaných vzrostných vrcholů, počet kontrolních rostlin číslo položky, pozice v kryoskladu, datum zamrazení metoda kryoprezervace životnost, regenerace Doplňující údaje: Předkultivace: počet dní kultivace, počet dnů otužování, počet dnů působení roztoku sacharosy Dehydratace: čerstvá hmotnost vzrostných vrcholů, počáteční obsah vody, konečný obsah vody, doba dehydratace, podíl krystalické fáze, přítomnost a charakteristika skelných přechodů (teplota skelného přechodu, změna tepelné kapacity) Poznámky: odchylky od standardního postupu F) STANOVENÍ MINIMÁLNÍHO ROZSAHU KRYOPREZERVOVANÝCH VZORKŮ Výsledky regenerace rostlin kontrolního vzorku lze použít pro výpočet počtu rostlin, které budou regenerovat při dané pravděpodobnosti z rostlin uložených v kapalném dusíku (Dussert et al. 2005). Minimální počet kontrolních rostlin schopných regenerace, aby existovala 95%-ní pravděpodobnost regenerace alespoň minimálního stanoveného počtu rostlin ze vzorků uložených v kapalném dusíku, závisí na velikosti kontrolního souboru a na počtu uložených vzorků v Dewarově nádobě. 15
Pro jeden genotyp je doporučeno použít 120 vzrostných vrcholů pro uložení v kapalném dusíku a 40 vzrostných vrcholů pro kontrolu životnosti a regenerace rostlin, která musí umožnit regeneraci alespoň 14 nových rostlin (Tab. 2). Na základě odhadu pravděpodobnosti regenerace uložených rostlin, lze rozsahem kryoprezervovaných vzorků ovlivnit jistotu (a bezpečnost) uchování a regenerace uložených genotypů a případně i cenu za jejich uložení do kapalného dusíku. Pokud je regenerace rostlin v kontrolním vzorku nízká, lze dosáhnout zvýšení pravděpodobnosti regenerace kryoprezervovaného genotypu zvýšením rozsahu uložených vzorků. V případě stabilně vysoké regenerace kontrolních vzorků lze snížit náklady na uložení genotypu snížením počtu uložených vzorků. Tab. 2: Minimální procento rostlin zregenerovaných v kontrolním vzorku, který umožňuje regeneraci minimálně 14-ti rostlin s pravděpodobností 95 % z uložených vrcholů v kryobance, v závislosti na jejich počtu a počtu kontrolních vrcholů při požadavku dosažení maximálního počtu uložených vzrostných vrcholů. Celkový počet kryoprezervovaných vzrostných vrcholů Počet vrcholů uložených v kryobance Z toho Počet vrcholů pro kontrolu regenerace Minimální procento regenerace kontroly pro minimálně 14 ks regenerujících rostlin z počtu v kryobance 140 120 20 40 150 120 30 33 160 120 40 30 170 140 30 30 180 120 60 28 190 140 50 26 200 150 50 24 210 150 60 23 220 170 50 22 230 160 70 21 240 150 90 21 250 170 80 20 260 160 100 20 270 210 60 18 280 210 70 17 290 210 80 16 300 200 100 16 310 210 100 16 320 220 100 15 330 240 90 14 340 250 90 14 350 250 100 14 360 270 90 13 370 270 100 13 380 280 100 13 390 290 100 13 400 300 100 12 16
III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ Nově navržená metodika navazuje na dosavadní metodiku, která je využívána pro kryoprezervaci vzrostných vrcholů chmele v rámci Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství. Nová metodika přináší aktuální poznatky výzkumu, čímž lépe a přesněji definuje přípravu rostlinného materiálu pro jeho kryoprezervaci a tím nahrazuje metodiku dosavadní. Změny oproti stávajícímu postupu tkví ve třech hlavních oblastech. Zaprvé definuje přesně přípravu rostlinného materiálu izolaci vzrostných vrcholů co se týká velikosti explantátu, pro homogenitu materiálu a vyrovnanost podmínek, i způsobu jeho izolace, který umožňuje zvýšení jeho regenerační schopnosti po kryoprezervaci díky přítomnosti až tří meristematických pupenů namísto jednoho, čímž může být pravděpodobnost regenerace nové rostliny zvýšit až třikrát. Tato znalost umožňuje vhodnou dobou kultivace ovlivnit růst bočních výhonů tak, aby bylo možné izolovat vysoký podíl explantátů se třemi meristémy, které celkově zvyšují účinnost metody kryoprezervace. Druhou změnou je zlepšení odhadu doby dehydratace, která je klíčovým parametrem pro zachování životaschopnosti po působení kapalného dusíku. Prokázání matematické závislosti mezi rychlostí poklesu obsahu vody a rychlostí poklesu obsahu čerstvé hmotnosti lze lépe odhadnout obsah vody v pletivech v reálném čase prostřednictvím měření rychlosti poklesu čerstvé hmotnosti. Tím bylo vyřešeno dilema nalezení optimální doby dehydratace vzrostných vrcholů. Poslední zásadní změnou je využití znalosti statistického nástroje pro výpočet počtu rostlin, které regenerují s pravděpodobností minimálně 95 % z celkového počtu v kryobance uložených vzrostných vrcholů. Metodika nově definuje vhodnou volbu počtu vzrostných vrcholů, které lze využít ke kontrole regenerace, aby při minimálním požadavku na regenerační schopnost byl uložen maximální počet vzrostných vrcholů. Při každé kryoprezervaci je izolován odlišný počet vzrostných vrcholů, což závisí na genotypu, množství napěstovaných segmentů, náhodné kontaminaci a dalších i provozních záležitostech Tento postup řeší běžné dilema, kolik vzrostných vrcholů má být použito pro potřeby kontrolní regenerace a kolik uloženo do kryobanky, aby nedošlo ke zbytečnému plýtvání cenným materiálem při kontrole regenerace a bylo uloženo co nejvyšší množství vzrostných vrcholů, ale zároveň byl počet dostačující pro statistické prokázání dostatečné míry regenerace. IV. POPIS UPLATNĚNÍ METODIKY Uživatelem metodiky kryokonzervace je MZe ČR a to prostřednictvím Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin, zvířat a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství. Využitím této nové metodiky kryokonzervace chmele dojde ke zvýšení účinnosti a spolehlivosti ukládání vybraných genetických zdrojů chmele ve stabilním, skelném, stavu v kapalném dusíku a tím dojde k eliminaci rizik ztráty cenných genotypů. Aplikací metodiky dojde k vytvoření bezpečnostní zálohy nejcennějších genetických zdrojů chmele podobně jako je tomu již po několik let na předních pracovištích ve světě, které se zabývá konzervací a kryoprezervací genofondu chmele NCGR (National Clonal Germplasm Repository) (Reed 2001, Reed et al. 2003) v Corvallis a NCGRP (National Center for Genetic Resources Preservation) ve Fort Collins (Ellis a Jenderek 2008) v USA. V. EKONOMICKÉ ASPEKTY Náklady na zavedení postupů uvedených v metodice závisí na tom, jestli se zavádí nově celý provoz pro práci s rostlinami v aseptických podmínkách nebo se pouze implementuje tato metodika kryokonzervace do stávajících provozů tkáňových kultur. V případě, že laboratoř již postup kryokonzervace explantátů používá, jsou náklady na zavedení nové metodiky nulové. 17
Náklady na zavedení celého aseptického provozu jsou následující: Vybavení pro sterilizaci materiálu a kultivačních médií: autokláv horkovzdušný sterilizátor Celkem od 105 tis. Kč (repasovaný do 40 tis. Kč) od 34 tis. Kč od 139 tis. Kč (74 tis. Kč) Práce s tkáňovými kulturami rostlin v in vitro podmínkách: kultivační box laminární box Celkem od 300 tis. Kč (repasovaný od 200 tis. Kč) od 150 tis. Kč od 450 tis. Kč (350 tis. Kč) Přístroje pro přípravu a uchování kultivačních médií: analytické váhy od 43 tis. Kč (bez interní kalibrace od 23 tis. Kč) přesné váhy od 7,5 tis. Kč stolní ph-metr od 25 tis. Kč laboratorní míchačka od 5 tis. Kč chladnička cca 4 tis. Kč mikrovlnná trouba cca 1 tis. Kč dávkovač od 4 tis. Kč pipety (3 ks) od 7 tis. Kč Celkem od 96,5 tis. Kč (76,5 tis. Kč) Nádoby na kapalný dusík Dewarova nádoba na kapalný dusík Dewarova nádoba na uchování vzorků v kapalném dusíku Celkem 27 tis. Kč 120 tis. Kč 147 tis. Kč Spotřební materiál Sklo Plasty Chemikálie Pinzety, nůžky, skalpely Celkem cca 10 tis. Kč cca 12 tis. Kč cca 35 tis. Kč cca 5 tis. Kč cca 62 tis. Kč Celková cena za zavedení metodiky 895 tis. Kč (710 tis. Kč) Z uvedeného přehledu je patrné, že zavedení nové metodiky kryokonzervace explantátů chmele v in vitro podmínkách začíná na částce přibližně 700 tis. Kč, která je odvozena od nákladů za vybavení laboratoře přístroji pro práci s materiálem v aseptických podmínkách. Protože se předpokládá, že nová metodika nahradí standardní metodiku kryokonzervace chmele, lze konstatovat, že zavedení nové metodiky nebude vyžadovat žádné nové investice do nového zařízení ani spotřebního materiálu ve srovnání se stávající metodikou. 18
Ekonomický přínos pro uživatele Předpokládané ekonomické přínosy využití této metodiky jsou minimálně 200 tis. Kč ročně při předpokladu každoroční kryokonzervace deseti nových genotypů chmele. Vychází se ze skutečnosti, že tato částka by byla vynaložena na kryokonzervaci genotypů chmele, ale k jejich úspěšné kryokonzervaci by nedošlo z důvodu nedosažení optimálních podmínek kryokonzervace. Zmíněná částka vychází z nákladů na namnožení in vitro rostlin, jejich otužení a kryokonzervaci, včetně kontrolní regenerace a následného uchování 10 genotypů chmele na 1 rok. Protože se jedná o metodu určenou pro dlouhodobé uchování genetických zdrojů, souvisí rentabilita této metody s dobou uchování vzorků v kapalném dusíku. Náklady na kryokonzervaci jsou nejvyšší na počátku při zavádění do kryobanky, ale samotné náklady na skladování v kapalném dusíku jsou poměrně nízké. Proto lze návratnost vstupních nákladů očekávat po osmi letech kryokonzervace a ekonomický přínos metodiky bude přímo úměrný době uchování vzorků v kapalném dusíku. Hlavním přínosem uplatnění této metodiky však bude bezpečné uchování cenných genotypů chmele v podmínkách, které umožňují dlouhodobou neměnnost skladovaného materiálu, což je hlavním požadavkem na uchování jakýchkoliv genetických zdrojů rostlin. VI. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Dussert S, Engelmann F, Noirot M, 2003, Development of probabilistic tools to assist in the establishment and management of cryopreserved plant germplasm collections. CryoLetters 24, s. 339-350. Ellis D. D., Jenderek M. M., 2008, Operational cryopreservation of multi-genera plant genetic resources collections at the National Center for Genetic Resources Preservation, In: Proceeding Joint Meeting of Working Group 1 and 2, COST871, 20th-23rd of February 2008, Oulu, Finland, s. 8-9. Faltus M., Bilavčík A., Zámečník J., Svoboda P., 2007, Effect of phytohormone composition of nutrient medium on in vitro plant regeneration in hop clones with different sensitivity to indole-3-butyric acid, ISSN 0394-6169, Advances in Horticultural Science, 21(4), s. 219-224. Murashige T., Skoog F.A., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15 : 473 497 Reed B. M., 2001, Implementing cryogenic storage of clonally propageted plants, CryoLetters 22, s. 97-104. Reed B. M., Okut N., D'Achino J., Narver L., Denoma J., 2003, Cold Storage and Cryopreservation of Hops (Humulus L.) Shoot Cultures Through Application of Standard Protocols, Cryoletters 24, s. 389-396. Reed, B. M., 1990, Survival of in vitro-grown apical meristems of Pyrus following cryopreservation. HortScience 25, s. 111-113. VII. SEZNAM PUBLIKACÍ Faltus M., Svoboda P,.Bilavčík A., Zámečník J., 2018, Metoda kryoprezervace pro uchování genetických zdrojů chmele (Humulus lupulus, L.), Úroda 12/2018, vědecká příloha časopisu, 127-130. Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A. & Kotková R. 2012. Comparison of Cryopreservation Methods of Vegetatively Propagated Crops Based on Thermal Analysis. In: Katkov, I. (ed.). Current Frontiers in Cryopreservation. InTech, Rijeka, Croatia, pp. 333-357. 19
Faltus M, Zamecnik J and Jadrna P, 2011, Cryopreservation and cryobanking of different vegetatively propagated crops: comparisons and contrasts. COST Action 871 CryoPlaNet Final meeting 7-11 February 2011. Zámečník J. & Faltus M. 2011. Behavior of Water in Plants at Low and Ultralow Temperatures. In: Pessarakli, M. (ed.). Handbook of Plant and Crop Stress. CRC Press, United States of America, pp. 288-313. Faltus M., Zámečník J., Svoboda P., Patzak J. & Nesvadba, V. 2011. Progress in the Czech Hop Germplasm Cryoconservation. Acta Horticulturae, 908: 453-460. Faltus M., Zamecnik J.: Konzervace genetických zdrojů chmele (Humulus lupulus, L.) pomocí metody kryoprezervace. Metodika pro praxi. Odběratel metodiky: MZe, Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008, první vydání, 40 výtisků. Faltus M., Bilavčík A., Zámečník J., Svoboda P., 2007, Effect of phytohormone composition of nutrient medium on in vitro plant regeneration in hop clones with different sensitivity to indole-3-butyric acid, ISSN 0394-6169, Advances in Horticultural Science, 21(4), s. 219-224. Faltus M., Zámečník J., Bilavčík A., 2007, Odolnost in vitro rostlin chmele k desikaci ve vztahu k jejich kryoprezervaci, ISBN 978-80-87011-00-3, In: Vliv abiotických a biotických stresů na vlastnosti rostlin 2007, Praha 21.3.2007, s. 558-562. Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2007, Cryoprotocols used for cryopreservation of vegetatively propagated plants in the Czech cryobank, ISSN 0394-6169, Advances in Horticultural Science, 21(4), s. 247-250. Zámečník J., Bilavčík A., Faltus M., 2007, Metody dehydratace vzrostných vrcholů pro kryoprezervaci vegetativně množených plodin, ISBN 978-80-87011-00-3, In: Vliv abiotických a biotických stresů na vlastnosti rostlin 2007, Praha 21.3.2007, s. 573-576. Faltus M., Bilavčík A., Zámečník J., 2006, Effect of different pretreatment on hop cryopreservation, In: Plenary papers of the Conference "Biotechnology 2006", 15th-16th February 2006, University of South Bohemia, České Budějovice, s. 558-560. Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2006, Conservation of biodiversity of vegetative propagated crops by cryopreservation methods, In: Plenary papers of the Conference "Biotechnology 2006", 15th-16th February 2006, University of South Bohemia, České Budějovice, s. 493-495. VIII. DEDIKACE Metodika je výstupem řešení institucionálního projektu VÚRV, v.v.i. č. RO0418 a NAZV QJ1630301. IX. JMÉNA OPONENTŮ: Odborný oponent: Ing. Přemysl Landa, Ph.D. ÚEB AV ČR, Rozvojová 263, 165 02 Praha 6 - Lysolaje Oponent ze státní správy: Ing. Iva Křížková, Ph.D. Oddělení OZE a environmentálních strategií, MZe, Těšnov 65/17, 117 05 Praha 1 20
Název: Metodika kryokonzervace genetických zdrojů chmele CERTIFIKOVANÁ METODIKA Autoři (podíl na práci): Ing. Miloš Faltus, Ph.D. (35 %) Ing. Petr Svoboda, Ph.D. (25 %) RNDr. Alois Bilavčík, Ph.D. (20 %) Ing. Jiří Zámečník, CSc. (20 %) Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06, Praha 6 Ruzyně Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Náklad: 40 výtisků Vyšlo v roce 2018, první vydání Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory: faltus@vurv.cz bilavcikurv.cz zamecnik@vurv.cz Autor fotografií: Miloš Faltus, Petr Svoboda Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2018 ISBN 978-80-7427-298-1 Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2018 21