SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU KMENŮ S ESBL U VYBRANÝCH DRUHŮ ENTEROBAKTERIÍ V CHOVECH SKOTU V ČR

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ODDĚLENÍ MIKROBIOLOGIE SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU KMENŮ S ESBL U VYBRANÝCH DRUHŮ ENTEROBAKTERIÍ V CHOVECH SKOTU V ČR (Diplomová práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie - směr Mikrobiologie) BRNO, 2010 Zuzana Jurčíčková

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí své práce Mgr. Lucii Pokludové, Dr. za ochotnou pomoc, informace potřebné k orientaci v dané problematice, za čas, který mi věnovala a cenné rady, kterými napomohla vzniku této práce. Chtěla bych poděkovat také RNDr. Monice Dolejské, Ph.D. za profesionální vedení a výrazné přispění svými odbornými znalostmi, za její názory a přátelský přístup. Mé poděkování patří také kolegyním Petře Slámové a Janě Soukupové za pomoc při zpracování materiálu a oběma laborantkám, paní Marii Slavíkové a Evě Suchanové, za vytvoření příjemného pracovního zázemí. Práci jsem vypracovávala na Ústavu mikrobiologie a imunologie na Fakultě veterinárního lékařství a na Ústavu biologie a chorob volně žijících zvířat na Fakultě veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně. Tato práce vznikla za finanční podpory věnované z grantu P502/10/P083 Grantové agentury České republiky. Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci zpracovala samostatně za použití uvedené literatury. V Brně dne 14. května 2010 2

OBSAH ÚVOD... 6 1. TEORETICKÝ ÚVOD A PROBLEMATIKA... 7 1.1. Problematika nadužívání antibiotik u potravinových zvířat...7 1.1.1. Spotřeba antibiotik v ČR a srovnání s členskými státy EU...8 1.1.2. Legislativa upravující používání antibiotik...10 1.2. Srovnání intenzivního chovu mléčného skotu a ekologického chovu...14 1.2.1. Srovnání chovu v Těšanech a ekologického chovu na farmě v Luboměři...14 1.2.2. Obecná kritéria pro ekologický chov...15 1.2.3. Legislativa ekologického zemědělství...16 1.2.4. Ekologický vývoj a význam ekofarem v ČR...17 1.3. Antibiotika...17 1.3.1. β-laktamová antibiotika...18 1.3.1.1. Peniciliny...19 1.3.1.2. Cefalosporiny...19 1.3.1.2.1. Cefalosporiny 3. a 4. generace veterinární cefalosporiny s použitím u potravinových zvířat...21 1.3.1.2.2. Mastitida...23 1.4. Rezistence k antimikrobiálním látkám...25 1.4.1. Mechanismy rezistence k antibiotikům...25 1.4.1.1. Mechanismy rezistence ß-laktamů...26 1.4.1.1.1. Enzymy β-laktamázy...28 1.4.1.2. ESBL...29 1.5. Mechanismy přenosu rezistence...34 1.5.1. Horizontální přenos genů...34 1.5.1.1. Plazmidy, transpozony, IS elementy, integrony, genové kazety, GI...34 1.5.2. Způsoby přenosu genů...36 1.5.3. Přenos rezistentních bakterií mezi zvířaty a lidmi...37 1.5.4. Mléčné filtry...38 1.6. Bakterie čeledi Enterobacteriaceae...39 1.6.1. Rod Escherichia...39 1.6.1.1. Escherichia coli...39 2. CÍLE PRÁCE... 41 3. METODIKA... 42 3.1. MIKROORGANISMY...42 3.2. KULTIVAČNÍ MÉDIA A ROZTOKY...42 3.3. PŘÍSTROJE...48 3

3.4. POMŮCKY...48 3.5. CHEMIKÁLIE A OSTATNÍ SUBSTANCE...49 3.6. METODY...50 3.6.1. Izolace producentů ESBL...50 3.6.2. Double-disk synergy test - DDST...51 3.6.3. Testování citlivosti k dalším antibiotikům diskovou difúzní metodou...53 3.6.4. Biochemická identifikace vybraných bakteriálních izolátů testem API 10S...54 3.6.5. Detekce genů rezistence metodou PCR...56 3.6.5.1. Izolace bakteriální DNA rezistentních izolátů...56 3.6.5.2. Polymerázová řetězová reakce se specifickými primery...56 3.6.5.3. Schéma testování integronů...59 3.6.6. Pulzní gelová elektroforéza...60 3.6.6.1. Příprava PFGE bločků z agarových kultur...60 3.6.6.2. Restrikční štěpení DNA v bločcích enzymem XbaI / S1...61 3.6.6.3. Příprava a nastavení programu vlastní PFGE...62 3.6.6.4. Barvení a vizualizace gelu...62 3.6.7. Izolace plazmidové DNA...63 3.6.8. Konjugace u ESBL + izolátů...64 3.6.9. Transformace plazmidové DNA do chemicky kompetentních buněk E. coli...66 3.6.10. Multiplex PCR...67 3.6.11. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů - RFLP...69 3.6.11.1. Příprava restrikční směsi...69 3.6.11.2. Agarózová gelová elektroforéza...69 4. VÝSLEDKY... 70 4.1. Farma v Těšanech...70 4.1.1. Spotřeba antibiotik na farmě v Těšanech...70 4.1.2. Výsledky biochemické identifikace...71 4.1.3. Výsledky fenotypových a genotypových metod k detekci antibiotické rezistence u izolátů E. coli z farmy v Těšanech...72 4.2. Ekologický chov Luboměř pod Strážnou...75 4.2.1. Spotřeba antibiotik na ekofarmě v Luboměři...75 4.2.2. Výsledky fenotypových a genotypových metod k detekci antibiotické rezistence u izolátů E. coli z ekofarmy v Luboměři...75 4.3. Výsledky pulzní gelové elektroforézy (PFGE) u ESBL + izolátů E. coli z farmy v Těšanech a Luboměři...77 4.4. Výsledky konjugace u ESBL + izolátů...79 4.5. Výsledky transformace plazmidové DNA do chemicky kompetentních buněk E. coli..81 4.6. Výsledky RFLP (makrorestrikční analýza)...83 4.7. Výsledky Multiplex PCR...84 4

5. DISKUZE... 85 5.1. Používání cefalosporinů ve veterinární medicíně a dopad na vznik a šíření rezistence 85 5.1.1. Srovnání antibiotické politiky na farmě v Těšanech a ekofarmě v Luboměři...86 5.2. Záchyt ESBL + kmenů a antibiotická rezistence...86 5.2.1. Výskyt producentů ESBL na farmě v Těšanech a ekofarmě v Luboměři...87 5.2.2. Výskyt ESBL + kmenů ve veterinární oblasti...87 5.2.3. Výskyt producentů ESBL v humánní medicíně...88 5.2.4. Pandemické geny bla CTX-M...89 5.3. Význam ekologických chovů v souvislosti se spotřebou antibiotik a šířením rezistence...90 5.4. Analýza izolátů E. coli metodou PFGE...91 5.5. Analýza plazmidů nesoucích gen bla CTX-M...92 5.6. Horizontální přenos genů...94 5.6.1. Konjugace...94 5.6.2. Transformace...95 ZÁVĚR... 96 LITERATURA... 97 PŘÍLOHY... 104 5

ÚVOD Vše začalo objevem penicilinu a dnes už si lékařskou péči neumíme bez antibiotik ani představit. S objevením antibiotik se zdálo, že lidstvo má vyhráno. Nicméně bakterie se začaly bránit a vyvíjet mechanismy, jak odolat účinkům těchto léků. Povedlo se jim vytvořit několik způsobů obrany, včetně produkce enzymu β-laktamázy se širokým spektrem účinku. Postupně se vznik a šíření bakterií rezistentních k antibiotikům staly celosvětovým problémem. Mezi antibiotika, na které si bakterie vytvořily rezistenci, patří i cefalosporiny. Tyto léky jsou nezbytnými v oblasti humánní i veterinární medicíny a šíření rezistence mezi bakteriemi významně omezuje možnosti léčby. Aktuálním problémem je v současnosti nadužívání veterinárních léčivých přípravků s obsahem cefalosporinů především u potravinových zvířat. Nadměrná aplikace cefalosporinů totiž přispívá k selekci rezistentních klonů, které mohou své geny rezistence dále šířit mezi ostatními zvířaty, lidmi a prostředím. Spojovacím článkem mezi bakteriální mikroflórou zvířat a lidí je bakterie Escherichia coli, která se vyskytuje jako běžná součást lidské i zvířecí střevní mikroflóry. Spotřeba veterinárních léčiv je v České republice zaznamenávána od roku 2002 a je zde především snaha o racionální používání antimikrobiálních léčiv. Cílem je zajistit optimální terapeutický účinek daného léčiva, a to společně s respektováním bezpečnosti antibiotické léčby. Důsledným dodržování racionální antibiotické politiky lze totiž předejít vzniku a šíření rezistentních klonů. Zároveň je potřeba nastavit indikační omezení při použití u zvířat v souladu s požadavky používání antibiotik v humánní medicíně. Rychlost šíření genů rezistence mezi bakteriemi je stále vyšší a boj s bakteriemi, které odolávají účinkům antibiotik, se stává celosvětovým problémem. Proto je třeba uvědomit si závažnost situace a přijmout opatření, která by vedla ke snížení výskytu rezistentních kmenů. Konkrétní opatření by však měla být přijímána především na lokální úrovni a to na základě odborných podkladů. Proto je zcela zásadní získávat informace o stavu citlivosti a rezistence bakterií a rovněž informace o spotřebách antimikrobiálních léčiv na regionální úrovni. 6

1. TEORETICKÝ ÚVOD A PROBLEMATIKA 1.1. Problematika nadužívání antibiotik u potravinových zvířat Nadšení pro používání antibiotik k léčbě potravinových zvířat vyústilo ve zvyšující se počet bakterií, které jsou rezistentní k jednotlivým antibiotikům (Sawant et al., 2007). Rostoucí odolnost bakterií komplikovala a stále komplikuje léčení infekcí v humánní i veterinární medicíně. Tato situace vedla k důležitým změnám v oblasti antibiotické politiky (zpřísnění používání a předepisování léků), zvláště pak v případě nasazování antibiotik jako růstových stimulátorů či profylakticky. V dřívější době byla antibiotika používána k léčbě, preventivně, či jako růstové stimulátory (Sawant et al., 2005). V případě používání antibiotik jako růstových stimulátorů byla podávána v nízkých dávkách po dlouhou dobu. Preventivně se antibiotika používala také v nízkých dávkách z toho důvodu, aby se zabránilo vzniku onemocnění. Antibiotika v subklinických dávkách mohou být z hlediska produkčního považována za užitečná z těchto důvodů: 1. urychlují růst dobytka 2. snižují riziko vzniku onemocnění 3. zlepšují trávení zvířat 4. přírůstek hmotnosti zvířete je vyšší 5. zkracují dobu a množství krmiva, které jsou potřebné pro dosažení porážkové hmotnosti zvířete Na druhou stranu nadměrné podávání antibiotik dobytku umožní bakteriím adaptovat se a rozvíjet mechanismy rezistence (Sawant et al., 2005). Selektivní tlak je hlavním faktorem, který dovolí bakteriím s novými mutacemi či nově získanými vlastnostmi přežít a množit se. Jak uvádí Billová (2007): Antimikrobiální léčiva mají u potravinových zvířat svou nezastupitelnou úlohu při léčbě a předcházení infekčním onemocněním vyvolaných bakteriemi, jsou nenahraditelná v léčbě infekčních onemocnění lidí a zvířat. Zároveň však jejich neuvážlivé používání může vést k rozvoji rezistence mikroorganismů, rezistentní zárodky se mohou dále šířit a snižovat účinnost terapie nejen ve veterinární sféře, ale i v oblasti humánní medicíny. 7

Cefalosporiny 3. a 4. generace jsou používány k léčbě hospodářských zvířat a mohou tedy ovlivnit výskyt rezistence (EMEA). Bakterie pocházející z hospodářských zvířat a rezistentní k cefalosporinům 3. a 4. generace jsou považovány za nebezpečné, vyskytují-li se v potravinách. Mohou se uplatňovat přímo jako lidské patogeny (např. Salmonella, Escherichia coli), nebo mohou napomáhat horizontálnímu přenosu genů rezistence. Navíc jsou cefalosporiny na seznamu antibiotik, která jsou velmi důležitá pro použití v humánní i veterinární medicíně. V té humánní oblasti medicíny jsou také často využívána. 1.1.1. Spotřeba antibiotik v ČR a srovnání s členskými státy EU Informace o spotřebě antimikrobiálních látek používaných u hospodářských zvířat nejsou v EU ještě komplexně dostupné, nicméně časem by se to mělo zlepšit (EMEA). Zaznamenaná data jsou většinou uváděna pro všechny druhy zvířat, včetně psů a koček. Navíc vypovídají o ß-laktamových antibiotikách obecně, či jsou záznamy rozděleny na peniciliny a cefalosporiny, a to bez rozlišení jednotlivých generací, jako např. v Tabulce 1. Je proto složité srovnávat údaje o spotřebě cefalosporinů v rámci jednotlivých generací. Tabulka 1. Spotřeba veterinárních léčivých přípravků (VLP) v České republice v letech 2003 2008 (vybrané skupiny antibiotik) (upraveno dle Hera et al., 2009a) Skupina antibiotik 2003 (kg) 2004 (kg) 2005 (kg) 2006 (kg) 2007 (kg) 2008 (kg) Cefalosporiny 202,53 207,62 337,76 291,39 420,33 546,94 Peniciliny 16213,76 19905,89 26590,59 22934,74 12963,91 17865,35 Peniciliny + kyselina klavulanová 753,16 520,69 612,02 571,16 1162,43 636,97 Celkem 17169,45 20634,2 27540,37 23797,29 14546,67 19049,26 V Tabulce 1 je zaznamenána spotřeba jednotlivých skupin antimikrobiálních látek v České republice mezi léty 2003 a 2008. Jednotlivá ß-laktamová antibiotika jsou rozdělena na peniciliny a cefalosporiny. Přehledy neuvádějí rozlišení jednotlivých generací cefalosporinů. Spotřeba cefalosporinů vzrostla od roku 2003 více než dvojnásobně, zatímco penicilinových přípravků se spotřebovalo nejvíce v roce 2005, a poté bylo zaznamenáno snížení spotřeby. Co se týče celkové spotřeby antibiotik, je tendence stabilně vzrůstající. 8

V některých členských státech EU je na cefalosporinových lécích uvedeno v souhrnu údajů o přípravku, případně v příbalové informaci nebo na obale zvláštní upozornění o používání v souvislosti s antibiotickou rezistencí (Bilová et al., 2007). Česká republika má tento typ upozornění nazvaný indikační omezení uveden u přípravků obsahujících cefalosporiny 3. a 4. generace (indikační omezení je uvedeno rovněž pro některá další antibiotika, např. pro fluorochinolony). Z Tabulky 2 vyplývá, že zatímco ve Švýcarsku je spotřeba antimikrobiálních látek ročně přibližně stejná jako v České republice, v severských státech je výsledná spotřeba, i přes větší rozlohu státu, téměř poloviční. Je to důsledek dlouhodobé antibiotické politiky těchto států a celkově menšího množství registrovaných léčiv s antibiotiky, epizootologické situace, managementu chovů či zainteresovanosti veterinárních lékařů na zisku z prodeje VLP (veterinární léčivé přípravky). Tabulka 2. Spotřeby penicilinů a cefalosporinů (uvedeno v tunách) v různých evropských státech v roce 2007 (EMEA) Skupina antibiotik ČR Dánsko Holandsko Švédsko Švýcarsko Finsko Peniciliny 12,96 35,66-8,51 12,40 7,86 Cefalosporiny 0,42 0,66-0,95 0,50 1,00 ß-laktamy - 36,32 64,00 9,46 12,90 8,86 V Evropě byl zaznamenán zvyšující se výskyt rezistence k cefalosporinům 3. generace (např. u bakterií K. pneumoniae, E. coli) (EMEA). Důvodem je ve většině případů používání cefalosporinů v lékařství, nicméně není vyloučeno ani šíření genů rezistence z potravinových zvířat přes jídlo či okolním prostředím. Vyšší frekvence výskytu rezistence koresponduje rovněž s vyšší frekvencí používání cefalosporinů 3.generace. Graf 1. ukazuje na trendy ve spotřebách cefalosporinů 3. a 4. generace a celkové spotřeby cefalosporinů v porovnání s trendy v počtu hlavních druhů potravinových zvířat zastoupených v ČR. Rostoucí spotřeba cefalosporinů vyšších generací je v posledních letech velmi výrazná, nicméně spotřeba této skupiny antibiotik je relativně nižší ve srovnání s ostatními skupinami antibiotik. 9

Graf 1. Trend ve spotřebě cefalosporinů 3. a 4. generace v letech 2003-2008 v závislost na počtu kusů potravinových zvířat (ovce, skot, prasata) (Pokludová et al., Poster EAVPT Leipzig, 2009) Srovnání spotřeby cefalosporinů s počtem zvířat v ČR v letech 2003-2008 spotřeba cefalosporinů (kg) / počet kusů zvířat (x 10 000) 600 500 400 300 200 100 0 2003 2004 2005 2006 2007 2008 rok Cefalosporiny 3. a 4. generace Cefalosporiny všech generací Počet potravinových zvířat (skot, prasata, ovce) 1.1.2. Legislativa upravující používání antibiotik (EMEA) V současnosti nejsou žádná striktní zákonná pravidla určující používání cefalosporinů u hospodářských zvířat (EMEA). Směrnice Evropské federace veterinářů doporučuje: je-li dostupné antibiotikum s užším spektrem účinku, mělo by být použito přednostně. Problém většiny států je ovšem v tom, že pokyny pro používání antibiotik v rámci jednotlivých indikací jsou pouze na obecné úrovni a bez specifikace cefalosporinů. V oblasti veterinární medicíny jsou léčiva obsahující antibiotika používána kromě individuální terapie také pro tzv. hromadné použití prostřednictvím medikovaných krmiv. Pro tyto aplikace jsou nutné přísné předpisy, aby se předešlo poškození zdraví lidí rezidui veterinárních léčiv či šíření rezistentních bakteriálních kmenů. V České republice není prostřednictvím hromadné medikace používán žádný přípravek obsahující cefalosporiny 3. a 4. generace. 10

Existuje několik způsobů, jak se mohou rezistentní zárodky k člověku dostat (Billová et al., 2007). Jsou to: 1. přímý kontakt se zvířaty zdravými nositeli rezistentních organismů, či nemocnými zvířaty 2. prostřednictvím potravního řetězce skrze potraviny, které jsou kontaminovány rezistentními zárodky 3. přenos genů rezistence mezi jednotlivými druhy bakterií Evropská léková agentura EMEA/CVMP vydala: (EMEA: European Medicines Agency Evropská léková agentura, od 1.1. 2010 změna označení na EMA, CVMP: Committee for Medicinal Products for Veterinary Use Komise pro veterinární léčivé přípravky) dokument jako revidovaný pokyn upravující SPC (Summary of Products Characteristics Souhrn údajů o přípravku) antimikrobiálních přípravků platný od 1. května 2008 (EMEA/CVMP/SAGAM/383441/2005) dokument, který pojednává o strategii CVMP v oblasti antibiotik pro období 2006-2010 (EMEA/CVMP/353297/2005) pokyn pro prokázání účinnosti veterinárních léčivých přípravků obsahujících antibiotika (EMEA/CVMP/627/01) také revidovaný dokument věnovaný problematice používání cefalosporinů 3. a 4. generace u potravinových zvířat, který je v platnosti je od 11. března 2009 (EMEA/CVMP/SAGAM/81730/2006-Rev.1*) CVMP strategie je založena na třech klíčových oblastech: (Hera et al., 2009b) 1. Registrace antimikrobiálních veterinárních léčivých přípravků Požadavky na dokumentaci pro veterinární léčivé přípravky jsou dány Směrnicí 2001/82/EC, ve znění pozdějších předpisů, resp. pro ČR zákonem č. 378/2007 Sb., o léčivech a jeho prováděcími předpisy (vyhláška č. 228/2008 Sb., o registraci léčivých přípravků). Úlohou 11

CVMP je dále vytvářet pokyny pro žadatele a hodnotitele, které zpřesňují požadavky na informace, které musí být doloženy. V České republice je sledování spotřeby antibiotik v kompetenci ÚSKVBL (Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv) a podle zákona o léčivech jsou od roku 2005 data o spotřebách antibiotik zveřejňována ve Věstníku této instituce, od roku 2010 jsou pak dostupné rovněž na webové stránce Ústavu (ÚSKVBL 1 ) 2. Mezinárodní aktivity v oblasti antibiotik Na evropské úrovni se oblasti antibiotické politiky a problematice rezistence na antibiotika věnuje vědecká skupina poradců pro antimikrobiální terapii Scientific Advisory Group On Antimicrobials (SAGAM). Tato skupina poskytuje expertízy CVMP k problematice týkající se registrace a používání antimikrobiálních léčiv. Kromě toho předkládá komisi CVMP kritické aspekty k současné situaci a trendům antibiotické rezistence v EU. Podrobné informace jsou veřejně dostupné na stránkách: http://www.ema.europa.eu/htms/general/contacts/cvmp/ CVMP_SAGAM.html. 3. Další rozvoj V oblasti antimikrobiálních léčiv dochází bezesporu k rychlému vývoji a tudíž i častým změnám, zejména pokud jde o vznik určité rezistence či používání antibiotik při léčbě. Proto je nutná aktualizace informací i strategie postupu boje proti rezistenci. V případě cefalosporinů je doporučeno nepoužívat je profylakticky, uvádět doporučení o rozumném používání na obalech, v příbalových informacích a v souhrnu údajů o přípravku. Dále je vhodné sledovat stav rezistence a spotřeby (s rozdělením spotřeby do jednotlivých generací) a vzdělávání veterinářů. Obecný postup při minimalizaci rizika spojeného s užíváním cefalosporinů zahrnuje: (Moulin, 2009) Identifikaci nebezpečí je třeba si uvědomit, že užívání antibiotik (včetně cefalosporinů) vede k selekci bakteriální rezistence Charakteristiku nebezpečí používání přípravků obsahujících cefalosporiny, zvláště 3. a 4. generace, u zvířat vede ke vzniku rezistence zvířecích patogenů a food-borne patogenů (patogenů pocházejících z potravin) a následně k selhání léčby infekcí, které jsou vyvolány těmito patogeny 12

Zhodnocení rizika provádí se na základě poskytnutých údajů o výši bakteriální rezistence v populaci mikroorganismů a to na základě údajů o spotřebě je třeba vyhodnotit trendy v této oblasti Řízení rizika opatření, která vedou ke snížení rizika jsou: o používání přípravků obsahujících cefalosporiny jen v případě závažných infekcí, či není-li jiná vhodná alternativní léčba o omezení využívání cefalosporinů k profylaktickým účelům o definování přesného dávkování o uvedení přesných instrukcí a informací o uvážlivém používání cefalosporinů na obale, v příbalové informaci a v souhrnu údajů o přípravku o vzdělávání veterinářů v oblasti antimikrobiální rezistence CVMP (Komise pro veterinární léčivé přípravky) velmi podporuje následující pokyny k zamezení šíření rezistence k cefalosporinům: (EMEA) Dodržení biologické bezpečnosti (např. potřebná vzdálenost nutná k udržení nemoci z dosahu populace, stáda či skupiny zvířat, ve kterých nemoc nepropukla, nebo omezení šíření nemoci ve stádu) Vzdělávání veterinářů a farmářů v postupech potřebných pro zmenšení či minimalizování antibiotické rezistence Sledování rezistence k cefalosporinům u patogenních bakterií Monitorování používání cefalosporinů v jednotlivých státech a zakročení, je-li to nutné. Následné zaznamenání dat, rozdělení spotřeby cefaloporinů pro lokální či systémové použití a rozlišení cefalosporinů vyšších generací Zábrana distribuce (reklamních nabídek) cefalosporinů majitelům zvířat Od 1.1.2006 nejsou v EU povoleny k používání žádné antibiotické růstové stimulátory (Billová et al., 2007). Jak Billová, (2007) uvádí: Rezistence bakterií k antibiotikům se stala vážným celosvětovým problémem. Důvodem je nadměrná spotřeba antimikrobiálních látek a jejich nezodpovědné používání. Důsledky se pak projevují v selhávání léčby, vyšší mortalitě a značných ekonomických nákladech. Při řešení nepříznivé situace musí být aktivně zapojeny 13

všechny složky, kterých se rezistence mikroorganismů k antibiotikům dotýká od veterinárních lékařů, přes farmaceutický průmysl, po řídící autority (národní lékové agentury, EMA, další mezinárodní organizace a vládní struktury). Jednotná strategie je základem úspěchu v boji proti antimikrobiální rezistenci. 1.2. Srovnání intenzivního chovu mléčného skotu a ekologického chovu 1.2.1. Srovnání chovu v Těšanech a ekologického chovu na farmě v Luboměři Na obou farmách je chováno plemeno Holštýn. V Těšanech najdeme výhradně plemeno Holštýn černý, v Luboměři je z menší části zastoupeno plemeno Holštýn červený a ve více než 50 % je zde zastoupeno plemeno Čestr zušlechtěné Montbeliardem. Na těšanské farmě je chován pouze mléčný skot, zatímco v Luboměři chovají skot mléčný i masný. Na farmě v Luboměři se dodržují pravidla platná pro ekofarmy a řídí se zde pokyny platnými pro ekochov. Najdeme zde 180 mléčných krav, 80 masných krav a 50 telat, což je zhruba o jednu třetinu méně než v Těšanech, kde mají 360 mléčných krav a 80 telat. Co se týče spotřeby antibiotik, na farmě v Těšanech je vysoká. Frekvence aplikací antibiotik za rok 2008 (392 kusů dobytka) je 2-3 aplikace antibiotika na zvíře za rok. Vyskytují se zde ovšem i dojnice s aplikací 7-10 antimikrobiálních látek z různých farmakologických skupin. Mezi pět nejčastěji používaných antibiotik patří ceftiofur (cefalosporin 3. generace), amoxicilin + kyselina klavulanová, cefoperazon (cefalosporin 3. generace), kloxacilin a penicilin + neomycin. Ve srovnání s chovem v Těšanech vidíme na farmě v Luboměři velký rozdíl ve spotřebě antibiotik. Frekvence aplikací antibiotik je nízká a pohybuje se okolo 0,5 podání antibiotika na zvíře za rok. Mezi pěti nejčastěji používanými antibiotiky jsou CTC (chlortetracyklin), streptomycin, sulfathiazol, penicilin a kloxacilin. 14

V roce 2008 byly v Luboměři používány veterinární léčivé přípravky (VLP) obsahující následující účinné látky: (Záznamy ošetřujícího veterinárního lékaře o VLP podávaných léčebně na farmě) Betalaktamy: penicilin, prokain benzyl penicillin, kloxacilin benzatin Aminoglykosidy: neomycin, streptomycin sulfát, dihydrostreptomycin Tetracykliny: OTC - oxytetracyklin, CTC - chlortetracyklin Nebyly používány žádné přípravky z kategorie cefalosporinů 3. a 4. generace. Farma v Těšanech má vyšší užitkovost. Produkce mléka se pohybuje v průměru okolo 30 litrů na jednu dojnici a roční užitkovost je tedy asi 9000 litrů mléka. Produkce mléka v chovu v Luboměři je opět zhruba o jednu třetinu nižší, tedy okolo 6000 litrů mléka ročně. 1.2.2. Obecná kritéria pro ekologický chov (Ekologické zemědělství - http://ec.europa.eu/agriculture/organic/organic-farming/what-organic _cs) Jak uvedlo Generálního ředitelství pro zemědělství a rozvoj venkova při Evropské komisi v rámci kampaně na zvýšení povědomí o ekologickém zemědělství v celé Evropské unii, představuje ekologické zemědělství systém, který se snaží poskytovat spotřebitelům čerstvé a chutné potraviny, a přitom respektovat přirozené přírodní podmínky (Ekologické zemědělství, cit. 2010). Tohoto dosahuje ekologické zemědělství na základě pravidel a obecných principů, které se zaměřují na snížení negativního působení člověka na životní prostředí. Snahou je, aby celý tento zemědělský systém fungoval co nejvíce přirozeně. Typické postupy ekologického zemědělství zahrnují např.: Velmi přísné limity pro používání syntetických pesticidů, hnojiv a antibiotik u hospodářských zvířat, stejně jako pro používání potravinových aditiv a pomocných látek při zpracování a pro používání jiných podobných vstupů Absolutní zákaz používání geneticky modifikovaných organismů Využívání místních zdrojů, např. statkových hnojiv nebo krmiv vyprodukovaných přímo na farmě Výběr rostlinných a živočišných druhů rezistentních k chorobám a přizpůsobených místním podmínkám 15

Chov hospodářských zvířat na pastvě, ve venkovních výbězích a krmení ekologickými krmivy Používání chovatelských postupů odpovídajících různým druhům hospodářských zvířat 1.2.3. Legislativa ekologického zemědělství (Legislativa - http://ec.europa.eu/agriculture/organic/news/press-releases_cs#organic) Pravidla o ekologickém zemědělství byla v EU formulována Nařízením Rady (EHS) č. 2092/91 z 24. června 1991, o ekologické produkci zemědělských výrobků a označování zemědělských produktů a potravin (Legislativa, cit. 2010). Avšak od 1. ledna 2009 musí farmáři, distributoři, kontrolní orgány a kompetentní úřady ve všech členských státech EU používat obnovenou legislativu o ekologickém zemědělství, která zahrnuje: 1. Směrnice rady (ES) č. 834/2007 z 28. června 2007 o ekologické výrobě a označování ekologických výrobků, 2. Směrnicí rady (ES) č. 967/2008 z 29. září 2008 doplňující směrnicí (ES) č. 834/2007, o ekologické výrobě a označování ekologických výrobků, které vstoupily v platnost k 1. lednu 2009 Logo Logo EU pro ekologické zemědělství ubezpečuje spotřebitele o původu a kvalitě potravin a nápojů (Legislativa, cit. 2010). Přítomnost tohoto loga na výrobku zaručuje, že výrobce respektoval Nařízení EU týkající se ekologického zemědělství. V současné době mohou ekologičtí zemědělci umisťovat logo EU na své výrobky dobrovolně, nicméně od 1. července 2010 se stane označování bioproduktů logem povinné. Na Obrázku 1 je logo platné od prvního července 2010. Obrázek 1. Logo EU pro ekologické zemědělství platné od července 2010. 16

1.2.4. Ekologický vývoj a význam ekofarem v ČR (Hrabalová et Zander, 2006) Trh s ekologickými produkty je v ČR malý, možnosti pro nabídku produktů ekologického zemědělství jsou omezené. Z toho důvodu je podpora státem nepostradatelná. Historie a vývoj Počátky ekologických chovů v České republice lze datovat okolo roku 1990. V té době se v zemi vyskytovaly pouze 3 ekologické farmy. Od roku 1990 jsou produkty ekologického zemědělství podporovány z veřejných prostředků Ministerstvem zemědělství. Největší rozmach oblastí využívaných pro ekologické chovy nastal v letech 1998-2001. Zejména tomu napomohlo obnovení státních příspěvků farmářům. Zastoupení zvířat v ekologickém zemědělství Hospodářství v ekologickém zemědělství jsou nejvíce zastoupena pasoucím se dobytkem, většinou skotem pasoucím se na pastvinách. Převažují stáda chovných krav v porovnání s mléčnými farmami, přičemž podíl krav chovaných pro maso a pro mléko je v poměru 95:5. Důležitou otázkou je, zda-li je zisk dostatečně vysoký k pokrytí všech nákladů. Zatím se ukazuje, že ano. Nicméně velká část příjmů u farem v celé západní Evropě je zajištěna státními dotacemi. 1.3. Antibiotika Antibiotika pro potravinová zvířata se rozdělují podle dvou kritérií, která byla stanovena jednotlivými členskými státy EU: (Biological Standards Commission, 2007) Kritérium 1 je splněno v případě, že více než polovina členských zemí považuje určitou antimikrobiální třídu za důležitou. Kritérium 2 je dodrženo, jestliže jsou jednotlivé antimikrobiální látky v rámci třídy nezastupitelné pro danou infekci anebo je pro ně jen velmi málo alternativních látek. 17

Na základě těchto kritérií byly antimikrobiální látky určené pro potravinová zvířata rozděleny do tří skupin: Veterinární kriticky významná antibiotika v případě, že byla splněna obě kritéria (např. aminoglykosidy, cefalosporiny, makrolidy, peniciliny, amfenikoly, chinolony, sulfonamidy, tetracykliny) Veterinární vysoce významná antibiotika je-li splněno jen jedno z kritérií (např. ansamyciny, fosfomycin, linkosamidy, pleuromutiliny a polypeptidy) Veterinární významná antibiotika ani jedno z kritérií nebylo splněno (např. bicyclomycin, kyselina fusidová, novobiocin) V rámci skupiny vysoce významných antibiotik se mohou některá z nich řadit do skupiny kriticky významných v případě určitých druhů zvířat. Cefalosporiny U zvířat by měla být tato skupina antibiotik vyhrazena jen pro léčbu závažných onemocnění, v případě, že není jiná alternativa pro léčbu. Cefalosporinové přípravky se mohou podávat ve formě injekce, intramamární suspenze, tablety či prášku, který je určen pro podání léku ve vodě či mléčných náhražkách. Intramamární aplikace antibiotika však snižuje účinnost látky (ve smyslu systémového účinku) (EMEA). V mnoha členských státech jsou cefalosporiny často používány v období laktace či zaprahlosti (období mimo dojení) u skotu, což vede k selekci rezistentních bakterií. Navíc, pokud jsou telata krmena mlékem od nedávno léčené krávy, kdy ještě nevypršela ochranná lhůta (OL) na mléko, je mikroflóra telat vystavena účinkům používaného antibiotika. 1.3.1. β-laktamová antibiotika Mezi ß-laktamová antibiotika řadíme peniciliny, cefalosporiny, karbapenemy a monobaktámy. Významnou skupinou související s ß-laktamy jsou antibiotika označovaná jako inhibitory ß- laktamáz. 18

1.3.1.1. Peniciliny Jak uvádí Votava et al. (2005), jsou peniciliny vysoce účinná antibiotika s nízkou toxicitou. Jsou získávány z kultury plísně Penicillium chrysogenum a dalších plísní, které produkují kyselinu 6-aminopenicilanovou. V molekule této kyseliny se vyskytuje ß-laktamový kruh konjugovaný s pětičlenným thiazolidinovým kruhem. Biochemické substituce tohoto meziproduktu vedou k rozmanitým druhům penicilinů. Liší se šířkou antibakteriálního spektra, stabilitou vůči nízkému ph a vůči ß-laktamázám. 1.3.1.2. Cefalosporiny Cefalosporiny jsou semisyntetická β-laktamová antibiotika odvozená od cefalosporinu C, produkovaného houbou Acremonium chrysogenum (Rafii et al., 2009). Cefalosporiny inhibují biosyntézu peptidoglykanu, ovšem některé bakterie produkují enzymy β-laktamázy schopné tyto cefalosporiny inaktivovat. Třetí a 4. generace cefalospoinů, jako jsou cefotaxim, ceftazidim, cefchinom či ceftiofur, jsou označovány jako širokospektré β-laktamy. Cefalosporiny a cefamyciny se řadí společně do skupiny a jsou klasifikovány na základě svých účinků in vitro, strukturních podobností a v některých případech dle roku jejich objevení (EMEA). ATCvet je systém klasifikace látek určených k terapeutickým účelům ve veterinární medicíně a může sloužit jako nástroj pro vyhledávání a orientaci v lékařsky využívaných výrobcích. Další informace je možno získat na veřejně dostupných stránkách http://www.whocc.no/atcvet. Podle ATCvet (Anatomic Therapeutic Chemical index) z ledna roku 2010 se rozdělují na tyto čtyři skupiny: První generace cefalosporinů (v ČR registrovány veterinární léčivé přípravky - VLP s účinnými látkami cefalexin, cefadroxil, cefalotin, cefapirin) vyznačují se nejužším spektrem účinku. Výborně působí na grampozitivní koky, včetně stafylokoků produkujících penicilinázu. Naproti tomu účinek na gramnegativní baterie je omezený. Druhá generace cefalosporinů (v ČR registrován VLP s účinnou látkou cefaclor) v porovnání s první generací vykazují širší spektrum účinku. Obecně působí lépe proti gramnegativním bakteriím. 19

Třetí generace cefalosporinů (v ČR registrovány VLP s účinnými látkami ceftiofur, cefoperazon, cefovecin) je u nich známo, že mají široké spektrum účinku se zvyšující se odolností k mnoha ß-laktamázám. Takovéto ß-laktamázy dovedou inaktivovat první a druhou generaci cefalosporinů, stejně jako ostatní ß-laktamová antibiotika. Čtvrtá generace cefalosporinů (cefchinom) nalezneme zde rozšířené spektrum účinku proti gramnegativním bakteriím stejně jako vyšší odolnost k ß-laktamázám v porovnání s třetí generací. Prozatím jen pro humánní medicínu je dostupný nezařazený cefalosporin ceftobiprol medocaril, jenž byl schválen Evropskou lékovou agenturou (EMA) k použití v humánních léčivech na podzim roku 2008 (Doc.Ref.EMEA/CHMP/552347/2008). Historie Cefalosporiny 3. a 4. generace představují antibiotika, která jsou velmi důležitá pro léčbu závažných a invazivních lidských infekcí, proto jsou pod dohledem zdravotnictví (EMEA). V 80. letech 20. století bylo zaznamenáno první velké propuknutí výskytu bakterií, které odolávaly účinkům těchto cefalosporinů prostřednictvím produkce ß-laktamáz. Následně se ukázalo, že je výskyt infekcí způsobených těmito rezistentními bakteriemi celosvětovým problémem. Dříve byly v Evropě bakteriální infekce s rezistencí k cefalosporinům 3. a 4. generace nejčastěji způsobovány bakterií K. pneumoniae. V posledním desetiletí se ovšem situace změnila a rezistentních bakterií rapidně přibývá a to nejen v nemocnicích, ale i v kolektivech. Patogeny nesoucími geny, které kódují rezistenci k cefalosporinům 3. a 4. generace, jsou nyní především bakterie E. coli a Salmonella. Zavedení cefalosporinů 3. generace do praxe počátkem 80. let 20. století velmi napomohlo rozšíření léčebných prostředků v humánní i veterinární medicíně (Vo et al., 2007). Bohužel zanedlouho byla objevena jejich rezistence k širokospektrým cefalosporinům. Tato rezistence byla studována nejprve u lidských izolátů čeledi Enterobacteriaceae a následně i u izolátů z hospodářských zvířat. Jedinou indikací k použití cefalosporinů 3 a 4. generace u skotu je závažná mastitida se život ohrožující sepsí, která je způsobena zástupcem z čeledi Enterobacteriaceae (např. E. coli, Klebsiella) (EMEA). Cefalosporiny vyšších generací se navíc jen zřídkakdy dostanou do mléka. Možné alternativy cefalosporinů, které prokázaly odpovídající účinnost při léčbě mastitid jsou florochinolony, nebo cefalosproiny 3 a 4. generace 20