Hmotnostní spektrometrie. Hmotnostní spektrometrie 1

Hmotnostní spektrometrie 1

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Fyzikální principy: pohyb elektricky nabité částice v elektrickém a magnetickém poli 2

Princip metody (Mass spectrometry-ms) je separační technika, která převádí vzorek na ionizovanou plynnou fázi a vzniklé ionty separuje podle hodnoty podílu jejich hmotností a náboje m/z. Jedná se o destruktivní metodu-vzorek je při analýze znehodnocen. Ionizace vzorku nastává zpravidla nárazem prudce letících elektronů, nebo je využita chemická ionizace, kdy ionty vznikají chemickou reakcí. 3

VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT V hmotnostní spektrometrii se používají různé ionizační techniky, ale v praxi lze ionty vytvořit i z vysokovroucích, vysokomolekulárních sloučenin Od vodíku po proteiny s molekulovou hmotností v řádech 10 000, záleži na ionizační technice a hmotnostním spektrometru CO LZE ROZLUŠTIT Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA 1) Hmotnost iontu (popř. molekulovou hmotnost sloučeniny) 2) Přítomnost prvků, které mají výrazné zastoupení izotopů (např. Cl, Br) 3) Při pokročilé fragmentaci molekuly informace o struktuře sloučeniny 4) Je-li hmotnost molekulového resp. pseudomolekulového iontu měřena s dostatečnou přesnosti tak i možné elementární složení sloučeniny 4

Základními kroky v této technice odpaření vzorku ionizace jsou: akcelerace iontů do hmotnostního analyzátoru separace iontů hmotnostním filtrem detekce iontů 5

Při ionizaci molekuly složky dochází obvykle k těmto reakcím: M M + + e - ionizace molekuly a vznik molekulárního iontu o jednotkovém náboji M + A + + m 0.rozpad molekulárního iontu na fragmentový ion a elektroneutrální částici 6

Instrumentace (schema) 7

Vysoké vakuum v zařízení (10-4 10-8 )brání vzájemným kolizím částic v plynné fázi. Ve většině spektrometrů nastane reakce za vzniků iontů a po ní probíhá analýza. Výsledkem měření je hmotnostní spektrum, které se dále vyhodnocuje. 8

Konstrukční typy hmotnostního spektrometru:klasická konstrukce Vzorek je přiváděn do iontového zdroje (1) v podobě páry. V iontovém zdroji je bombardován elektronovým svazkem. Vznikající kationty přicházejí do akcelerační komory (2). Tady jsou urychleny napětím 3 až 10 kv. Ionty o hmotnosti m a náboje z jsou polem o napětí U urychleny na rychlost v. Získají kinetickou energii W. W z U 2 mv 2 9

Fyzikální odvození pohybu iontů Urychlené kationty vstupují do magnetického pole o indukci B. Silové účinky magnetického pole způsobí pohyb iontu po kruhové dráze o poloměru r. Na ionty působí odstředivá a dostředivá síla, které jsou v rovnováze. Za rychlost v dosadíme ze vztahu pro kinetickou energii, ze vzniklého výrazu vyjádříme m/z 10

Detektor je umístěn tak, že na něj dopadají ionty při určitém poloměru. Mění-li se hodnota B, mění se poloměr dráhy iontů s různou hodnotou m/z. Daného poloměru dráhy, při kterém ionty dopadají na detektor, nabývají postupně částice s různým poměrem m/z. 11

Podle čeho volit způsob ionizace (tj. ionizační techniku)? a/ těkavost látky (polarita) - pro těkavé látky za podmínek měření použití EI (elektronová ionizace) nebo CI (chemická ionizace) b/ tepelná stabilita látky - pro termolabilní látky nejsou vhodné techniky, kdy je nutné látku převést do plynné fáze před vlastní ionizací (EI, CI); volit šetrnější techniky, např. ESI (elektrosprejová ionizace) nebo MALDI c/ molekulová hmotnost (souvisí s těkavostí) - asi do MR=1000 lze EI/CI, do několika tisíc APCI/APPI, do desítek až stovek tisíc ESI a MALDI d/ chemické individuum nebo směs - pro směsi spojení s vhodnou separační technikou (např. GC/MS, HPLC/MS) e/ volba polarity ionizace (platí pro měkké ionizační techniky) - kladné ionty - pro většinu látek, musí být možné látku protonovat (vhodná přítomnost heteroatomu) či kationizovat (sodíkem, stříbrem, apod.) -záporné ionty - sulfonové a karboxylové kyseliny, polyhydroxylované látky (snadná deprotonace), tvorba aduktů s jednoduchými anionty (octan, mravenčan, chlorid, apod.) f/ studium nekovalentních interakcí nebo prostorového uspořádání molekul (zejména pro biomolekuly) - ESI 12

Ionizace za atm. tlaku API jiný název: Sprejové ionizační techniky 3 ionizační techniky (ESI, APCI, APPI) pracující za atmosférického tlaku znamenaly naprostý průlom v řešení spojení HPLC/MS (Nobelova cena za ESI) vznikají převážně ionty se sudým počtem elektronů (existují výjimky) Elektrosprejová ionizace (ESI) pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu (např. mají kyslík nebo dusík v molekule), vhodný pro iontové sloučeniny 13

Ionizace za atm. tlaku API Elektrosprejová ionizace (ESI) analyt rozpuštěný ve vhodném eluentu je přiveden kovovou kapilárou, na kterou je vloženo vysoké napětí (3-5 kv) vznikající kapičky po rozprášení na výstupu z kapiláry za pomoci zmlžujícího plynu nesou na povrchu velké množství nábojů odpařováním rozpouštědla dojde k zvýšení hustoty povrchového náboje, až při dosažení kritické hodnoty dochází k tzv. Coulombické explozi, tj. rozpadu na ještě menší kapičky s rozdělením původních nábojů, opakování tohoto procesu vede až k uvolnění kvazimolekulárních iontů 14

Ionizace za atm. tlaku API Celý proces elektrospreje lze rozdělit na 3 základní kroky: 1/ zmlžení roztoku vzorku na malé elektricky nabité kapičky 2/ uvolnění iontů z kapiček 3/ transport iontů z atmosférické oblasti zdroje do vakua a hmotnostního analyzátoru 15

Ionizace za atm. tlaku Atmosférická chemická ionizace (APCI) - pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze) ale při vyšší teplotě než ESI, sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu princip APCI je obdobný jako pro konvenční chemickou ionizaci, ale ionizace probíhá za atmosférického tlaku 1/ Primární ionty vznikající ze zmlžujícího plynu 2/ Reakční ionty vznikající z mobilní fáze a aditiv 3/ Hlavní mechanismy ionizace analytu 16

Ionizace za atm. tlaku APCI 17

Ionizace za atm. tlaku často lze snadno odvodit základní strukturní rysy molekuly (štěpení labilních vazeb) a některých funkčních skupin, které snadno podléhají fragmentaci, např. nitro-, sulfo nebo karboxyskupiny, halogeny plně kompatibilní s HPLC v rozsahu průtoků cca 0.1-1 ml/min (někdy až 2 ml/min),mobilních fází používaných v systémech s obrácenými (např. methanol, acetonitril, voda) i normálními fázemi (např. hexan, dichlormethan, chloroform, ethylacetát, ethanol) těkavé iontové přísady do mobilní fáze (octan amonný, kyseliny mravenčí, octová, apod.) lze použít v koncentracích ca. do 10 mm, pokud možno co nejnižší netěkavé přísady (fosfátový či borátový pufr, kvartérní amoniové soli používané jako iontové páry) obecně nejsou vhodné a lépe nahradit těkavějšími analogy na iontové nebo výšemolekulární látky (MR>2000) APCI není vhodná, protože před ionizací musíme molekuly analytu převést do plynné fáze, proto se nehodí pro biopolymery, organokovové látky, nekovalentní komplexy, polysulfonované látky, apod. (pro uvedené aplikace je vhodnější ESI) 18

Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI) zdroj UV záření se používá kryptonová výbojka s energií fotonů 10 ev a minoritní 10.6 ev tato energie je větší než ionizační energie (IE) nepolárních organických molekul, ale menší než IE složek mobilní fáze (metanol, acetonitril, voda) nebo vzdušného kyslíku selektivní ionizace analytu a nikoliv mobilní fáze na rozdíl od ESI a APCI běžně vznikají ionty s lichým počtem e- výhodné použití tzv. dopantu (toluen,benzen, IE<10 ev), který potom reaguje ionmolekulárními reakcemi s analytem a nikoliv s mobilní fází vyšší citlivost obecně velmi podobná technika APCI,ale lze použít i pro velmi nepolární nebo Hmotnostní labilní spektrometrie sloučeniny oproti APCI 19

Mechanismy vzniku iontů v APPI -převládající mechanismus vzniku iontů závisí na řadě faktorů pro analyt, dopant a mobilní fázi: a/ ionizační energie (IE), b/ protonová afinita (PA), c/ elektronová afinita (EA), atd. 1/ Typické reakce popisující vznik kladných iontů M + h (10 ev) M +. (bez dopantu) D + h (10 ev) D +. (dopant) D +. + M M +. + D (výměna náboje) D +. + S [D-H]. +[S+H] + (přenos protonu) [S+H] + + M [M+H] + + S (přenos protonu) + řada dalších možných reakcí kde M... molekula analytu, D... dopant, S... solvent 20

Mechanismy vzniku iontů v APPI převládající mechanismus vzniku iontů závisí na řadě faktorů pro analyt, dopant a mobilní fázi: a/ ionizační energie (IE), b/ protonová afinita (PA), c/ elektronová afinita (EA), atd. 2/ Typické reakce popisující vznik záporných iontů D + h (10 ev) D +. + e - S + e - S -. nebo [S-F]. + [F] - O 2 + e - O 2 - M + O 2 - [M-H] - + HO 2 pokud kys G(M) < kys G(HO 2.) M + e - M -., pokud EA(M) > 0 M + O 2 - M -. + O 2, pokud EA(M) > EA(O 2 ) = 0.451 ev M + O 2 - [M-X+O] - + OX., kde X = H, Cl, NO 2 kde M... molekula analytu, D... dopant, S... solvent, F... fragment, kys G... kyselost v plynné fázi 21

Ionizace za atm. tlaku IONIZACE LASEREM ZA ÚČASTI MATRICE - MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION (MALDI) ionizace vzorku v přítomnosti pevné matrice vzorku laserem vhodné pro vysokomolekulární, teplotně nestálé sloučeniny i nepolární (polymery, proteiny) princip: vzorek je rozpuštěn a smísen s vhodnou matricí, pak odpaření rozpouštědla; krátký laserový puls je absorbován matricí, následně dojde k přenosu absorbované energie a ionizaci a desorpci iontů vzorku a jejich ion-molekulárním reakcím; pulzní ionizační technika téměř výhradně ve spojení s TOF analyzátorem matrice musí absorbovat laserový puls, aby mohlo dojít k ionizaci; nejčastěji dusíkové UV lasery (4 ns puls, UV 337 nm), IČ lasery jsou dražší ale citlivější důležitá je správná příprava vzorku, volba vhodné matrice a rozpouštědla vzorku nejčastěji pozorované kladné ionty [M+H] +, [M+2H] 2+, [M+Na] +, [M+K] +, záporné ionty: [M-H] -, pro nepolární analyty možnost tvorby aduktů, např. [M+Ag] +, [M+Li] + 22

Elektronová ionizace (Electron Ionization, EI) tvrdá ionizační technika - molekula získá velký přebytek vnitřní energie, který se projeví fragmentací molekulárního iontu (asi v 10% případů v takovém rozsahu, že molekulární ion zcela chybí ve spektru) nejstarší ionizační technika (od r. 1913), podrobně popsána pravidla pro jednotlivé třídy látek, rozsáhlé knihovny EI spekter podmínkou změření EI hmotnostních spekter je dostatečná těkavost látky za podmínek ionizace (teplota 150-400 o C, tlak - 10-3 - 10-5 Pa) EI nelze použít pro netěkavé látky a pro látky termolabilní (musí mít dostatečnou tepelnou stabilitu za podmínek měření) 30

Elektronová ionizace (Electron Ionization, EI) žhavená katoda (W nebo Re vlákno) emituje elektrony, které jsou po průchodu iontovým zdrojem zachyceny na anodě ( lapač elektronů ) urychlující potenciál mezi katodou a anodou určuje energii elektronů, vyjadřuje se v elektronvoltech (1 ev = 1.602*10-19 J) 31

Princip elektronové ionizace interakcí urychleného elektronu s valenčním elektronem molekuly dojde k ovlivnění jejich elektromagnetických polí, což může vést až k uvolnění valenčního elektronu a tím vzniku radikálkationtu M +., účinnost EI je pouze 1/105 = 10-3 % M + e - M +. + 2 e - vzniklé ionty jsou odpuzovací (vytěsňovací) eletrodou vypuzeny z iontového zdroje, svazek iontů je dále fokusován (zaostřen) a urychlen dalšími elektrodami směrem do analyzátoru iontů molekula může získat při ionizaci příliš velký přebytek vnitřní energie, což se projeví fragmentací (tj. rozpadem na menší nabité a nenabité části), při rozsáhlé fragmentaci může ve spektru chybět molekulární ion M +. ionizační potenciál většiny organických látek je ca. 7-16 ev, standardní urychlující potenciál e- pro měření knihovních EI spekter je 70 ev (v rozmezí 50-100 ev má energie jen malý vliv na vzhled spektra) proč tak vysoká energie ionizace? vysoká citlivost, pro většinu látek zároveň přítomnost řady fragmentových iontů i molekulárního iontu, ale pro ca. 10% organických látek molekulární ion M +. za těchto podmínek chybí 32

Chemická ionizace (Chemical Ionization, CI) konstrukce iontového zdroje a princip analogické EI, ale ve zdroji je přítomen tzv. reakční plyn o tlaku ca. 100 Pa - nadbytek reakčního plynu oproti vzorku -104:1, nejdříve jsou ionizujícími e - ionizovány molekuly reakčního plynu, které potom ionmolekulárními reakcemi ionizují molekuly analytu (použitý tlak zaručuje, že dojde k dostatečnému počtu srážek molekul analytu s ionty reakčního plynu); v iontovém zdroji probíhá řada konkurenčních reakcí patří mezi měkké ionizační techniky - obvykle vznik [M+H] +, [M-H] + (u alkanů, alkenů, nitrilů) nebo [M-H] - nebo jiných aduktů podle použitého reakčního plynu (všechny ionty mají sudý počet elektronů na rozdíl od M +. při EI) nejběžnější reakční plyny: methan (vznikající ionty [CH 5 ] +, [C 2 H 5 ] +, [C 3 H 5 ] +, isobutan (ion [t-c 4 H 9 ] + ) a amoniak (ionty [NH 4 ] +, [(NH 3 ) 2 H] +, 33 [(NH 3 ) 3 H] + )

Chemická ionizace (Chemical Ionization, CI) několik základních mechanismů (ion-molekulárních reakcí) vzniku iontů při CI (R = reakční plyn, M = analyzovaná molekula): a/ R + e - R +. + 2 e - (ionizace reakčního plynu EI) b/ R +. + R [R+H] + + [R-H]. nebo [R+H]. + [R-H] + (ion-molekulární reakce R) c/ [R+H] + + M R + [M+H] + (protonace) d/ [R-H] + + M (R-2H) + [M+H] + (protonace) e/ [R-H] + + M R + [M-H] + (abstrakce hydridu) f/ R +. + M R + M +. (výměna náboje - charge exchange) g/ R + + M [R+M] + (kondenzace) nejčastější je protonace (přenos protonu z plynné Brönstedovy kyseliny na neutrální molekulu) příkladem kondenzace je reakce iontů z methanového plazmatu [C 2 H 5 ] + a [C 3 H 5 ] + s molekulou za vzniku [M + C 2 H 5 ] + a [M + C 3 H 5 ] + 34

Chemická ionizace (Chemical Ionization, CI) příklad ion-molekulárních reakcí pro methan: CH 4 + e - CH + 4. + 2 e - (primární vznik kation-radikálu EI, není ion-mol. reakce!) CH 4+. + CH 4 CH 3. + CH + 5 CH 4+. CH + 3 + H. (monomolekulární rozpad, nikoliv ion-molekulární reakce) CH + 3 + CH 4 C 2 H + 5 + H 2 CH 2+. + CH 4 C 2 H + 3 + H 2 + H. C 2 H + 3 + CH 4 C 3 H + 5 + H 2, atd. uvedené reakce nejsou stejně pravděpodobné, v methanovém plazmatu jsou z 95% zastoupeny [CH 5 ] + (m/z 17), [C 2 H 5 ] + (m/z 29) a [C 3 H 5 ] + (m/z 41), které reagují s molekulami vzorku nejčastěji za vzniku [M + H] + a někdy i méně intenzivních aduktů [M + C 2 H 5 ] + a [M + C 3 H 5 ] + ; jestliže jsou přítomny stopy vody, pak je dominantní [H 3 O] + proč tolik různých reakčních plynů? reakční plyny i analyzované látky mají různou protonovou afinitu = možnost optimální volby protonová afinita (PA) čím vyšší hodnota PA, tím pevněji se proton váže k molekule (ještě jinak: čím pevněji se váže proton k molekule, tím menší chuť má molekula uvolnit ho jinak) B + H + Hmotnostní BH +, spektrometrie - H = PA(B) 35

Starší (historické) ionizační techniky dnes se používají výjimečně, většinou byly vývojově překonány jinými ionizačními technikami s výhodnějšími vlastnostmi, ale je dobré znát stručně znát princip Ionizace termosprejem (Thermospray Ionization, TSI) Ionizace urychlenými atomy (Fast Atom Bombardment, FAB) Ionizace urychlenými ionty (Fast Ion Bombardment, FIB) Ionizace polem (Field Ionization, FI) Desorpce polem (Field Desorption, FD) Desorpce plazmou kalifornia 252 ( 252 Cf Plasma Desorption) 36

Volba ionizační techniky a polarity záznamu záznam kladných iontů většina sloučenin, poměrně univerzální záznam záporných iontů sloučeniny obsahující sulfo, karboxy, (poly)hydroxy nebo nitro skupiny, halogenované sloučeniny, organokovy, atd. 37

Detekce iontů 1/ elektronový násobič nejběžnější, ionty dopadající na povrch elektrody z ní vyrazí e -, dále zesíleny systémem dynod až 108krát, životnost 1-2 roky 2/ fotonásobič - ionty dopadají na konverzní dynodu, z ní na fosforovou destičku, uvolní energii ve formě fotonu, zesílení až 105-107 krát, delší životnost 3/ Faradayova klec dopadající ionty se vybijí na sběrné elektrodě, vybití kondenzátoru je úměrné počtu iontů, velmi přesné na izotopická měření 38

Separátory iontů Cílem hmotnostního analyzátoru je separace iontů v plynné fázi podle poměru jejich hmotnosti a náboje (m/z) separace iontů v analyzátoru probíhá za vysokého vakua (přibližně 10-3 - 10-6 Pa,výrazně závisí na typu analyzátoru) různé typy hmotnostních analyzátorů mohou využívat různé fyzikální principy separace iontů: magnetický analyzátor - v magnetickém poli dochází k zakřivení dráhy iontů, které je závislé na hodnotě m/z (m/z je úměrné druhé mocnině poloměru dráhy iontu r 2 ) analyzátor doby letu (TOF) - urychlené ionty se pohybují různou rychlostí v závislosti na hodnotě m/z ( menší ionty se pohybují rychleji) kvadrupólový analyzátor - v daný okamžik jsou oscilace stabilní pouze pro určitou hodnotu m/z a tento ion projde kvadrupólovým analyzátorem, ionty s jinými hodnotami m/z mají nestabilní oscilace a jsou zachyceny na tyčích kvadrupólu, změnou napětí postupně projdou na detektor ionty se všemi hodnotami m/z iontová past - opakované selektivní vypuzení iontů podle hodnoty m/z z iontové pasti na detektor 39

Analyzátory MS Analyzátor doby letu (Time-of-Flight, TOF) Princip: ionty s menší hodnotou m/z o stejné kinetické energii se pohybují rychleji v oblasti bez pole, takže se rychleji dostanou na detektor (hovorově řečeno: malé ionty letí rychleji ) jedná se o typicky pulzní hmotnostní analyzátor, protože nejdříve jsou velmi krátkým pulzem ionty urychleny na vstupu do analyzátorové trubice a potom se přesně měří čas (řádově ns ms), za který ionty dolétnou k detektoru, podle čehož se určí jejich m/z skenování je velice rychlé a hmotnostní rozsah m/z není teoreticky omezen, záleží pouze na době, po kterou budeme čekat na dopad iontů (lze m/z > 106) 40

Zvýšení rozlišení u TOF analyzátoru rozlišení lineárního TOF analyzátoru není příliš vysoké (cca. 1000 3000), použitím dále uvedených technik lze výrazně zvýšit RP až na ca. 15-25000 1/ Analyzátor doby letu s reflektronem(rtof) použití tzv. iontového zrcadla neboli reflektronu, které slouží k vyrovnání různých kinetických energií pro ionty se stejnou hodnotou m/z (při ionizaci získají ionty kinetickou energii s určitou distribucí, což vede k rozšíření jejich píků a tím ke zhoršení RP) 2/ Opožděná extrakce iontů (Dealyed Extraction) ionty jsou ze zdroje extrahovány s malým zpožděním, čímž dojde díky vzájemným srážkám ke sjednocení jejich kinetických energií 41

Analyzátory MS 42

Analyzátory MS 43

KVADRUPOLOVÝ SEPARÁTOR - HMOTNOSTNÍ FILTR - různá stabilita oscilací iontů v kombinaci stejnosměrného napětí a vysokofrekvenční střídavé složky (10 MHz) 44

KVADRUPOLOVÝ SEPARÁTOR - HMOTNOSTNÍ FILTR Hmotnostní spektrometr s kvadrupólem a vstup vzorku, b iontový zdroj, c kvadrupól, d detektor, e - vakuum 45

Iontová past (Ion Trap IT) ionty jsou pulzně přivedeny do pasti, zde jsou zachyceny a potom jsou postupně vypuzovány na detektor podle jejich m/z, jedná se v podstatě o trojrozměrný kvadrupól - buď lze použít externí ionizaci (obvyklé zejména u HPLC/MS) nebo interní ionizaci v iontové pasti (běžné u GC/MS s EI) - iontová past složena ze 2 koncových elektrod a jedné kruhové elektrody 46

Iontová past (ion trap) účinkem elektrického pole jsou ionty uzavřeny v ohraničeném prostoru. Iontová past se skládá ze vstupní a z výstupní elektrody kruhového průřezu a z prstencové středové elektrody. Krajní elektrody jsou uzemněny, na středovou elektrodu je vkládáno vysokofrekvenční napětií s proměnnou amplitudou. Ionty jsou nuceny pohybovat se uvnitř iontové pasti po uzavřených kruhových drahách, s rostoucí amplitudou napětí se ionty s rostoucím m/z dostavají na nestabilní trajektorie a opouštějí prostor iontové pasti směrem do detektoru. 47

Proč je v pasti helium? snížení kinetické energie iontu, zvýšení citlivosti, pomáhá udržet ionty ve středu iontové pasti zvýšení rozlišení a citlivosti, slouží jako kolizní plyn, vyvolává fragmentaci 49

Přesnost 53

Schéma hmotnostního analyzátoru 54

Iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR) Parametry ICR vybočují z rámce všech ostatních analyzátorů (cena, rozlišení, vakuum) vznik iontů, jejich MS i MSn analýza může být ve stejném místě nebo s přivedením z externího zdroje (např. ESI), všechny ionty jsou detegovány zároveň, snadná změna polarity. Nemá nedostatky výše uvedených analyzátorů. Má navíc magnetický a elektrostatický sektor a nevyužívá základní plyn. Pracuje pod velmi vysokým vakuem. Daní za dokonalost zařízení jsou jeho nároky na prostor, 55 cenu a omezení použití pro vědecká pracoviště.

F = mv2/r F = mv2/r 56

Iont pohybující se po cyklotronové orbitě s frekvencí danou vztahem: Poloměr běžné cely: 1-3 cm Počáteční poloměr pohybu iontu: 0.01-0.1 mm Běžná síla magnetického pole: 1-12 Tesla např. 7T magnet, m/z 100, 1 sec 1000 000 cyklu (30 km) 58

Koherentní cyklotronový pohyb indukuje proudový obraz, který je amplifikován a detekován. Přítomnost iontu s různými m/z se projeví jako superpozice sinusoidálních signálu na detektoru. excelentní rozlišení (~ 106) a přesnost 1-0.1 ppm 59

Fourierova transformace a rozlišení 60

Spojení hmotnostní spektrometrie a separačních technik Proč spojení? můžeme v jedné analýze zároveň separovat i identifikovat složitou směs látek, kombinace výhod obou technik alternativní způsob spočívající v izolaci látek po jejich chromatografické separaci a následném změření hmotnostních spekter pro jednotlivé látky offline technikou je pracný, časově náročný a pro složité směsi látek nebo látky ve stopové koncentraci ve směsi nemusí být vůbec proveditelný Proč bylo technické řešení spojení GC/MS a zejména HPLC/MS složité? rozdíl tlaků mezi hmotnostním analyzátorem (např. kvadrupól či iontová past 10-3 Pa) a analyzovanými látkami vstupujícími do iontového zdroje za atmosférického tlaku (tj. 105 Pa) je nejméně 8 řádů (!!!), pro další typy hmotnostních analyzátorů ještě více, např. TOF (vakuum 10-5 Pa, tj. 10 řádů rozdíl) nebo FTICR (vakuum 10-10 Pa, tj. rozdíl 15 řádů) navíc analyzované látky jsou neseny v toku plynu (GC, průtok u kapilárních kolon asi 1ml/min) nebo kapaliny (HPLC, asi 1 ml/min nebo méně), které jsou v obrovském nadbytku a musí být odstraněny před vstupem do vakuové části přístroje, v současnosti již rutinní použití 62

Spojení plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC/MS) v současnosti zcela rutinní metoda, téměř výhradně se používá ve spojení s kapilárními kolonami (průtok cca. 1 ml/min) ve spojení s konvenční elektronovou ionizací (EI) nebo chemickou ionizací (CI), pro současné vakuové pumpy není problém odčerpat nosný plyn v minulosti se pro spojení GC/MS s náplňovými kolonami s vyššími průtoky nosného plynu používaly různé separátory, jejichž cílem bylo odstranění nadbytku nosného plynu před vstupem do iontového zdroje a analyzátoru používané koncentrace u GC i MS jsou obdobné, ideální pro detekci použití EI umožňuje přímé softwarové porovnání naměřených spekter s databází spekter v počítači (stovky tisíc spekter) a následné kritické posouzení porovnání 63

GC/MS - shrnutí většinou ve spojení s elektronovou (EI) nebo chemickou ionizací (CI) nejběžnější hmotnostní analyzátory pro GC/MS: Q (cca 1.5 mil. Kč), IT (3 mil. Kč), TOF (5 mil. Kč), QqQ (6 mil. Kč) obvykle ve spojení s kapilárními kolonami, průtok helia jako nosného plynu řádově 1 ml/min stačí odčerpat vakuové pumpy - není třeba děliče toku často se v praxi málo využívají možnosti MS, rutinní porovnání s knihovnou spekter, identifikace pouze na základě shody spekter s knihovnou 65

Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (HPLC/MS) technicky mnohem náročnější ve srovnání s GC/MS, místo 1 ml/min nosného plynu (pro GC/MS) musíme před vstupem do hmotnostního analyzátoru odstranit 1 ml/min kapaliny, tj. 22.4x více (pro HPLC/MS) u ionizačních technik pracujících za atmosférického tlaku (ESI, APCI, APPI) se mobilní fáze se přímo účastní ionizačního procesu spektra není možné porovnávat s knihovnou, protože knihovny pro HPLC/MS spektra většinou neexistují, mohou se výrazně lišit podle použité ionizacní techniky, pracovních podmínek i typu přístroje (platí kromě EI) - spektra je nutné interpretovat manuálně (velmi záleží na zkušenostech operátora, na porovnání s analogickými typy látek či literaturou) výjimkou v tvorbě knihoven jsou specifické případy proteomických knihoven (dostupné přes internet zdarma či zpoplatněné), laboratorní knihovny pro omezený rozsah látek (např. skupiny zakázaných drog, pesticidů či podobně definovaná skupina známých cílových analytů), většinou se jedná o knihovny MS/MS spekter (na rozdíl od MS spekter u GC/EI-MS), převoditelnost knihoven mezi různými typy hmotnostních analyzátorů může přinést problémy kvůli významným rozdílům 66

Schéma HPLC/MS systému 67

Ionizační techniky pro HPLC/MS Podle typu analytu lze použít několik ionizačních technik: ionizační techniky pracující za atmosférického tlaku (API) ionizace elektrosprejem (ESI), chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI) a fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI) nejběžnější a nejvýhodnější řešení pro většinu aplikací ionizace a desorpce laserem za účasti matrice (MALDI) - on-line nebo off-line spojení konvenční elektronová ionizace (EI) méně obvyklé, ale pro specifické aplikace může být smysluplné kvůli možnosti využití EI knihoven spekter v minulosti další techniky: ionizace termosprejem (TSI), ionizace urychlenými atomy či ionty (FAB/FIB), atd. dnes se prakticky nepoužívají vzhledem k výrazným přednostem a univerzálnosti API technik 68

Hmotnostní spektrum: 69

Analytické využití: všestranná, rychlá a citlivá analytická metoda, která je často využívána ke kvantitativní i kvalitativní chemické analýze, protože poskytuje velké množství informací o vzorku a jeho složení. napomáhá k identifikaci, určení struktury organické látky a určení její relativní molekulové hmotnosti. Je velmi užitečná pro základní výzkum vysoce reaktivních molekul v plynné fázi. 70

Kvantitativní analýza Kvalitativní analýza Sledování obsahu vybraných analytů v různých matricích Identifikace sloučenin(především nízkomolekulární sloučeniny), pomoc při odvození respektive potvrzení struktury molekuly (výšemolekulární sloučeniny) 71

Kvantitativní analýza: nezbytné je použití vnitřního (interního) standardu pro potlačení vlivu matrice či kontaminace na účinnost ionizace analytu, použití vnějšího standardu není vhodné a většinou je nepřijatelné nejpřesnější postup je tzv. metoda izotopického zřeďování použití izotopicky značeného standardu analytu izotopomer má identické všechny základní chemicko-fyzikální vlastnosti kromě posunu m/z odpovídající počtu značených izotopů (nejčastěji deuterace), doporučený posun alespoň +3 jednotky m/z pokud je izotopicky značených standard nedostupný, pak lze jako interní standard alternativně volit analogickou sloučeninu nebo homolog tento postup ale nemusí být zcela optimální, nicméně v praxi někdy není jiná možnost (musí být jistota, že zvolený interní standard se nemůže vyskytovat ve vzorku, jinak by kvantita byla ovlivněna) kvantita v HPLC/MS/MS použití skenů selektivního záznamu iontové reakce (SRM) nebo reakcí (MRM) poskytuje mimořádně citlivou a velmi přesnou kvantitu použití pouze selektivního záznamu iontů (SIM) nelze obecně doporučit, riziko interferencí na dané hodnotě Hmotnostní m/z, spektrometrie výjimečně lze použít 72

Kalibrace hmotnostní stupnice externí kalibrace kalibrace a vlastní měření není ve stejný okamžik, nejdříve kalibrace a pak měření (nebo naopak), což někdy může způsobit určitý posun hmoty obecně poskytuje mírně horší výsledky oproti interní kalibraci, ale je menší riziko hmotnostních interferencí analytu s kalibrantem interní kalibrace kalibrant i analyt jsou do iontového zdroje přivedeny ve stejný okamžik, tudíž ve spektru pozorujeme v jednom spektru jak analyt tak i kalibrant poskytuje nejpřesnější výsledky, ale hrozí riziko hmotnostních interferencí (tzn. analyt a kalibrant nesmí mít příliš blízké hmotnosti, aby je daný typ analyzátor dokázal spolehlivě rozlišit, pokud by se píky analytu a kalibrantu ovlivnily, pak vzniká chyba) kalibranty musí se jednat o látky s přesně definovaným elementárním složením a známým typem iontu, hodnoty m/z nesmí interferovat s analytem, výhodné může být též blízký strukturní typ analytu (není podmínkou) nebo přítomnost monoizotopických prvků (např. perfluorované látky, CsI), typické kalibranty: syntetické polymery (např. PEG, PPG), klastry solí (např. monoizotopický CsI), směsi peptidů, apod. 73