Kvasinky a jejich využití

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie Kvasinky a jejich využití (Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie směr Mikrobiologie) Jana Kopecká Brno 2009

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením doc. RNDr. Miroslava Němce, CSc. s použitím odborné literatury uvedené v seznamu. V Brně dne...... Jana Kopecká

Poděkování Ráda bych poděkovala panu doc. RNDr. Miroslavu Němcovi, CSc. za odbornou pomoc, cenné didaktické podněty, za čas a trpělivost při vzniku a konečné úpravě mé bakalářské práce.

Obsah 1. Seznam použitých zkratek...2 2. Úvod...3 3. Cíl práce...4 4. Kvasinky...5 4.1. Taxonomie kvasinek...5 4.2. Buňka kvasinek...5 4.2.1. Pouzdro...6 4.2.2. Buněčná stěna...6 4.2.3. Morfologie buňky...7 4.2.4. Morfologie kolonie...8 4.2.5. Chemické složení buňky...9 4.3. Metabolizmus kvasinek...10 4.3.1. Glykolýza...11 4.3.2. Aerobní respirace...11 4.3.3. Kvašení...12 5. Využití kvasinek...13 5.1. Pivovarské kvasinky...13 5.1.1. Způsoby zefektivnění klasické technologie...15 5.1.2. Flokulace...15 5.2. Vinařské kvasinky...17 5.3. Pekařské kvasinky...18 5.4. Lihovarské kvasinky...18 5.4.1. Netradiční organizmy pro výrobu etanolu...19 5.5. Patogenní kvasinky...20 5.6. Geneticky modifikované kvasinky...21 5.6.1. Pichia pastoris a produkce heterologních proteinů...22 5.7. Kvasinky jako modelový systém...23 5.7.1. Schizosaccharomyces pombe...24 5.7.1.1. Buněčný cyklus u eukaryot...24 5.7.2. Saccharomyces cerevisiae...26 5.7.2.1. Tvorba biofilmu...26 5.7.2.2. Vznik nádoru...27 5.7.2.3. Biosimulace metabolizmu léků...28 5.7.3. Yarrowia lipolytica...30 5.7.3.1. Vylučované proteiny...30 5.7.3.2. Brzká fáze sekrece proteinů...31 6. Diskuze...33 7. Závěr...35 8. Literatura...36 1

1. Seznam použitých zkratek Adh alkoholdehydrogenáza AEP alkalická extracelulární proteáza AIDS acquired immune deficiency syndrome (syndrom získaného selhání imunity) Ala alanin AOX promotor promotor alkohol oxidázy Arg arginin ATP adenosin-5 -trifosfát AXP kyselá proteáza DNA deoxyribonukleová kyselina ED-dráha Entner-Deudoroffova dráha ELISA enzyme-linked immunosorbent assay (imunoenzymatický test) EMP-schéma Embdenovo-Meyerhofovo-Parnasovo schéma ER endoplazmatické retikulum G+C báze guanin + cytosin GLP glucagon-like peptid (peptid podobný glukagonu) GPI glykosylfosfatidylinositol GSH glutathion v redukované formě HBV virus hepatitidy B HSP heat shock protein (stresový protein) Lys lysin NAD +, NADH nikotinamidadenindinukleotid a jeho redukovaná forma NADPH redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidfosfátu Phe fenylalanin Pro prolin RNA ribonukleová kyselina RNáza ribonukleáza SCP single cell protein potravinářská, krmná biomasa SRP signal recognition particle - signální rozpoznávací částice YPD živná půda z kvasničného extraktu, peptonů a dextrózy 2

2. Úvod Kvasinky jsou jedním z nejvyužívanějších mikroorganizmů vůbec. Považujeme je za nejstarší domestikovaný mikroorganizmus. Již ve starém Egyptě a antickém Řecku se vyráběl kynutý chléb a alkoholické nápoje, které byly předchůdci dnešního piva a vína. Jednotlivé kvasinky poprvé pozoroval Anton van Leeuwenhoek, který je popsal jako malé kuličky v pivě. V roce 1857 Louis Pasteur dokázal, že kvašení je život bez kyslíku a že organizmy, které ho způsobují nemusí být živé. V dalších letech vydal studii o pivu a vínu. V dnešní době mají kvasinky nezastupitelný význam mezi průmyslovými mikroorganizmy, a to především v potravinářském průmyslu pro výrobu kynutého pečiva, alkoholických nápojů, potravinářské a krmné biomasy. Jsou hojně využívány v řadě oblastí vědy, technologie a ve farmaceutickém průmyslu. Významná je jejich produkce biologicky aktivních látek a biodegradační aktivita. Některé kvasinky ovšem mohou vyvolávat onemocnění. Díky relativně jednoduché stavbě buňky, osekvencování genomu (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe), snadné manipulaci a kultivaci patří kvasinky k nejdůležitějším eukaryotickým modelovým organizmům. S rozvojem genového inženýrství vzrostl počet heterologních bílkovin produkovaných kvasinkami. Zisk nových a zlepšení stávajících vlastností kvasinek technikami rekombinantní DNA bude jistě i nadále předmětem mnoha studií a výzkumů. 3

3. Cíl práce Cílem mé bakalářské práce je zpracovat formou literární rešerše doposud známé poznatky o kvasinkách. Kromě obecnější charakterizace kvasinek se zaměřit i na jejich využití, a to nejen v tradičním potravinářském průmyslu, ale i jako důležitý organizmus pro produkci látek díky genetickým modifikacím či jako významný modelový systém pro eukaryotní organizmy. 4

4. Kvasinky Jako kvasinky se označují heterotrofní eukaryotní organizmy, které jsou řazeny mezi houby. Nejsou schopny fotosyntézy, mají pevnou buněčnou stěnu a vyskytují se buď jako jednobuněčné organizmy nebo ve formě vláken. Český název je odvozen od schopnosti většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně i trisacharidy. Jejich výskyt je díky těmto sacharolytických schopnostem svázán s materiály obsahujícími cukry, zvláště tedy na bobulovém a peckovém ovoci, cukernatých plodinách, ale i v půdě, vodě a ve střevním traktu. Význam kvasinek spočívá především ve využití produktů kvašení. Saccharomyces cerevisiae a Schizosaccharomyces pombe patří mezi nejdůležitější modelové eukaryotní organizmy. Některé kvasinky ovšem mohou být i patogeny. 4.1. Taxonomie kvasinek Kvasinky patří do domény Eukarya, říše Fungi - houby, dále však nejsou samostatnou taxonomickou skupinou. Podle způsobu pohlavního rozmnožování se řadí do oddělení Ascomycota vřeckovýtrusné houby, Basidiomycota stopkovýtrusné houby. U některých kvasinek není pohlavní rozmnožování známo, ty patří do pomocné skupiny Deuteromycota - imperfektní houby, která náleží k oddělení Ascomycota. Klasifikace i názvosloví se průběžně mění zejména díky objevování sexuálních stádií, která bývají většinou zařazována mezi Ascomycota. Vycházíme-li z hypotézy, že kvasinky vznikly jako redukované formy hub, považují se hyfovité kvasinkovité mikroorganizmy za vývojově starší než jednobuněčné formy (Kalina a Váňa 2005, Kocková-Kratochvílová 1990). 4.2. Buňka kvasinek Buňka kvasinek je eukaryotního typu a je tedy považována za mnohosložkový systém, ve kterém membrány ohraničují reakční prostory, kompartmenty. Velikost buněk je asi 3-15 µm a je dána především rodovou příslušností a způsobem kultivace. Chemické složení, stavba a funkce buněčných komponent bývají obvykle podobné jako u jiných eukaryot. Hlavní rozdíl spočívá v přítomnosti silné a pevné buněčné stěny, která chrání buňku před vnějšími vlivy a dává jí tvar. Některé kvasinky mohou tvořit i pouzdro. 5

4.2.1. Pouzdro Pouzdro tvoří jen málo rodů kvasinek (Rhodotorula, Cryptococcus, Pichia...). Přítomnost pouzdra se obvykle prokazuje mikroskopicky negativním barvením nebo chemickou reakcí s jódem - reakce s polysacharidy. Opouzdřené buňky tvoří obvykle slizovité kolonie. Pouzdro se skládá z polysacharidů, které tvoří síť radiálně orientovaných mikrofibril vycházejících od buněčné stěny. Polysacharidy vždy obsahují manózu a kyselinu glukuronovou, další sacharidy (např. xylóza, galaktóza, glukóza) jsou u různých druhů kvasinek zastoupeny v odlišných poměrech. Pouzdro má zřejmě velký podíl na virulenci patogenních kvasinek (Eisenman a kol. 2007). 4.2.2. Buněčná stěna Buněčná stěna je pevná, odolná a elastická struktura, pro niž je typická odlišnost chemického složení od buněčné stěny rostlinných a bakteriálních buněk a tvorba jizev, jako trvalých struktur po pučení. Významnou roli sehrává buněčná stěna při shlukování buněk, rozpoznávání mezi buňkami opačného párovacího typu, sporulaci, zprostředkování kontaktu mezi patogenní houbou a hostitelským organizmem. Velikost buněčné stěny se pohybuje v rozmezí 100-400 nm. Může se však lišit jak mezi tak i uvnitř druhu. Nativní buněčná stěna představuje velmi složitý heterogenní polymer. Základní složky (glukan, manan, protein a chitin) tvoří až 90% buněčné stěny. Množství lipidů je malé a nestálé. Ve stěně byla prokázána i přítomnost enzymů (invertáza, fosfatáza, proteázy...). Chitin je na povrchu buněčné stěny rozložen nerovnoměrně. Nejvíce se nachází v oblasti jizev. Jizvy jsou terčovité útvary, které jsou dobře barvitelné fluorescenčními barvivy a které zůstávají na povrchu buňky v místě, kde se oddělil pupen. Složení může být do jisté míry ovlivněno růstovými podmínkami (Rose a Harrison 1991). Detailní struktura buněčné stěny není stále známa, ale předpokládá se, že jde o trojvrstevnou strukturu. Vnitřní vrstvu tvoří vlákna glukanu, který je odpovědný za udržení tvaru buňky a je ve vzájemné interakci s mananproteinem, který má vliv na antigenní vlastnosti. Manan je lokalizován především na vnější straně buněčné stěny (Nobel a Lipke 1994). Vnější vrstva reguluje propustnost buněčné stěny (Mee a kol. 2007). Buněčná stěna Saccharomyces cerevisiae (Obr. 1) je tvořena převážně β-1,3-glukanem, β-1,6-glukanem, glykozylovanými bílkovinami (mananproteiny) a chitinem (Mazáň a kol. 2006). 6

Obr. 1: Schématické složení buněčné stěny kvasinek s vyznačením vzájemných kovalentních vazeb. GPI-CWP bílkoviny buněčné stěny kovalentně zakotvené v buněčné stěně přes GPI-zbytek; PIR-CWP - kovalentně vázané bílkoviny buněčné stěny obsahující opakující se úseky aminokyselin; ASL-CWP kovalentně vázané bílkoviny; disulfidové vazby mezi bílkovinami nejsou znázorněny. (Mazáň a kol., 2006, upraveno) 4.2.3. Morfologie buňky Tvar buněk kvasinek do značné míry souvisí se způsobem vegetativního rozmnožování (pučení, příčné dělení), částečně je ovlivněn i vnějšími podmínkami, např. povrchové napětí, složení živného prostředí, oxidačně-redukční potenciál atd. Zejména je však určen rodovou příslušností. Za základní tvar se považuje rotační elipsoid se dvěma možnými odchylkami, a to buď na tvary kulaté nebo na podlouhlé až vláknité (Obr. 2). Kvasinky mohou měnit svůj tvar i během svého vývoje. Buňky rodu Trigonopsis mohou mít za určitých kultivačních podmínek i trojúhelníkovitý tvar (Šašek a Becker 1969). Některé rody či kmeny vytvářejí protáhlé buňky, které pučí pouze na pólech a zůstávají spojeny v dlouhá zaškrcovaná vlákna pseudomycelia. V určitých místech pseudomycelia vznikají svazky blastospor krátké elipsoidní buňky, např. u rodu Candida (Vázquez-Tsuji a kol. 2005). U některých rodů (Candida, Rhodotula) se může vytvářet i tzv. pravé mycelium - vlákno vzniklé příčným dělením protáhlých buněk. 7

Obr. 2: Různé tvary buněk kvasinek. 1 2 3 4 5 6 7 1) kulaté; 2) oválné; elipsoidní; 3) citronkovité; 4) ogivální; 5) lahvovité; 6) protáhlé; 7) vláknité (Kocková-Kratochvílová, 1982, upraveno) 4.2.4. Morfologie kolonie Vzhled kolonií je různý (Obr. 3 a 4) a do jisté míry je druhově a rodově specifický. Závisí na složení živné půdy, kultivačních podmínkách (teplota, vlhkost, vyčerpání živin, vliv metabolitů,...), tvaru a velikosti buněk, tvorbě spor a na spontánních mutacích. Nejčastěji jsou kolonie označovány jako hladké, drsné nebo slizovité. Za tyto vlastnosti jsou zodpovědné geny rgh1, rgh2 a rgh3. Některé kvasinky (např. Cryptococcus) tvoří množství mimobuněčného polysacharidu slizovité konzistence, který obaluje buňky jako pouzdro. Kultivací v čistých kulturách se tvorba slizu snižuje a časem se může dokonce vytratit úplně (Kocková-Kratochvílová 1982). Obr. 3: Typy povrchů o okrajů kolonií. 1 2 3 4 5 6 7 1) centrálně pruhovaný; 2) radiálně pruhovaný; 3) ucelený okraj; 4) lalokovitý okraj; 5) pilovitý okraj; 6) cípovitý okraj; 7) rhizoidní okraj (Kocková-Kratochvílová, 1982, upraveno) Obr. 4: Různé typy průřezů koloniemi. 1) hladká kolonie; 2) hladká kolonie s vyvýšeným středem; 3) hladká kolonie, kráterovitá; 4) plochá kolonie; 5) kráterovitá kolonie, ve středu zvlněná; 6) vyvýšená, zvlněná kolonie; 7) plochá, zvlněná kolonie; 8) rhizoidní kolonie s pseudomyceliem (Kocková-Kratochvílová, 1982, upraveno) 1 5 2 6 3 7 4 8 8

Kolonie se zdají být méně rezistentními a méně komplexními než přírodní biofilm a tvoří jakýsi přechod mezi ním a nechráněnou jednotlivou buňkou. Kolonie jsou modelem pro studium interakcí a signálů mezi mikroorganizmy uvnitř mnohobuněčné společnosti. Vzhled laboratorních a čerstvě izolovaných divokých kmenů z prostředí se velmi liší (Obr. 5). Laboratorní kmeny Saccharomyces cerevisiae obvykle tvoří hladké kolonie, zatímco čerstvě izolované divoké kmeny vytvářejí kolonie vločkovitě strukturované. Elektronová mikroskopie a biochemické testy dokázaly, že buňky uvnitř vločkovitých kolonií jsou spojeny mimobuněčnou matrix, která má funkci jakési kostry. Tato matrix pravděpodobně obsahuje vysokomolekulární protein nebo komplex proteinů. U hladkých kolonií žádný podobný materiál pozorován nebyl. Navyknutí na laboratorní podmínky je doprovázeno ztrátou této matrix a značně změněnou expresí asi 320 genů. Hlavní změny se týkají metabolizmu cukrů a vitamínů, buněčné stěny, buněčného cyklu a polarity (Kuthan a kol. 2003). Na přechod od vločkovité ke hladké formě má také vliv potlačení genu aqy1, který kóduje aquaporiny. To vede ke změnám v propustnosti vody a povrchových vlastnostech buněk. U většiny laboratorních kmenů je gen aqy1 mutován a tyto kmeny tvoří hladké kolonie. Adaptace na laboratorní podmínky je spojována i s chromatinovou přestavbou, s histonovými deacetylázami (Hda1 a Rpd3) a Sir2, který tlumí specifické oblasti na chromozomu. Růst ve vločkovitém uspořádání zřejmě přináší kvasinkám výhody za nepříznivých podmínek, protože při růstu na bohatém médiu v podmínkách in vitro se tato struktura nevytváří (Palková 2004). Obr. 5: Rozdíl mezi divokými a laboratorními mikroorganizmy. 1) 2) 3) 4) 5) Kolonie laboratorních (1) a divokých (2-5) kmenů Saccharomyces cerevisiae. (Palková, 2004, upraveno) 4.2.5. Chemické složení buňky Chemické složení buňky kvasinek je závislé na druhu a kmeni, fyziologickém stavu buněk, na kultivačních podmínkách, na živných půdách a na stáří kultury. 9

Voda tvoří hlavní část protoplasmy kvasinek, její obsah je obvykle 65-80%. U Saccharomyces cerevisiae se uvádí složení sušiny následovně: dusíkaté látky 45-60%, cukry 15-37%, lipidy 2-12%, minerální látky 6-12%, dále jsou přítomny růstové látky a biologicky významné sloučeniny (vitamin B a C, provitamin A a D...). Kvasinky produkují také specifické proteiny jako je cerevizin (albumin), zymokasein (fosfoprotein) a glutatiol. V buňkách se vyskytuje i značné množství volných aminokyselin. Sacharidy se dělí na sacharidy tvořící buněčnou stěnu - glukan, manan - a na sacharidy vnitrobuněčné - glykogen, manan (Sugawara a kol. 2004). Nukleové kyseliny jsou mimo jádra přítomné i v mitochondriích. Lipidy jsou v buňkách obsaženy jako tuky vázané v buněčné stěně nebo jako tuky volné v cytoplazmě ve formě tukových kapének. Podstatnou část lipidické složky zaujímají složené tuky, především glykolipidy a fosfolipidy - lecitin a kefalin (Tosch a kol. 2005). Z minerálních látek je nejvíce zastoupen P 2 O 5, vápník, hořčík, měď, mangan a zinek (Němec a Horáková 2002). 4.3. Metabolizmus kvasinek Metabolizmus je souhrn látkových přeměn, které se odehrávají v kvasinkových buňkách a jejich činností i v prostředí, kde rostou a množí se. Přeměna látek zásobuje kvasinky stavebním materiálem a energií, což je nezbytné pro životní pochody buňky. Metabolickou aktivitu můžeme rozdělit na anabolizmus a katabolizmus. Anabolizmus vede k syntéze složek buňky, při které se spotřebovává energie, zatímco katabolizmus představuje degradativní pochody vedoucí k tvorbě energie, kterou může následně využít anabolizmus. Toto je označováno jako energetické spřažení drah. Pro mikroorganizmy je charakteristická vysoká intenzita metabolizmu, která je silně ovlivněna vnějšími podmínkami. Dostatečný přísun živin, vhodná teplota a ph prostředí vede k intenzivnímu metabolizmu a rychlé syntéze buněčné hmoty. Ta se za optimálních podmínek u Saccharomyces cerevisiae nebo Candida utilis zdvojnásobí už zhruba za 2 hodiny (Vodrážka 2006). Jako zdroj uhlíku a energie kvasinky využívají především mono- a disacharidy, méně pak oligo- či polysacharidy. Jako zdroj uhlíku mohou být využity i další látky glycerol, laktát, etanol, metanol, alkany atd. Zpracování zdrojů uhlíku a energie probíhá u většiny kvasinek za aerobních podmínek glykolýzou a navazujícím Krebsovým cyklem. Avšak u převážně fermentujících kvasinek je energie tvořena v průběhu kvašení. Při distribuci pyruvátu vznikajícího mezi respiratorní a fermentatorní reakcí je důležitá aktivita pyruvátdehydrogenázy, která se nachází v mitochondriích a produkuje acetylkoa pro vstup 10

do Krebsova cyklu, a cytoplazmatické pyruvátdekarboxylázy, která napomáhá vzniku acetaldehydu a tím i etanolu (Pronk a kol. 1996). Produkty metabolizmu kvasinek mohou být nejen CO 2, etanol, H +, ale i glycerol, acetát, sukcinát atd. U různých kmenů lze poměry produktů ovlivnit kultivačními podmínkami. 4.3.1. Glykolýza Glykolýza je hlavní cestou pro odbourávání sacharidů. Reakce probíhají v cytoplazmě a jsou katalyzovány enzymy, které nejsou vázány na buněčné struktury. Mechanizmus glykolýzy vysvětluje EMP-schéma (Obr. 6). Prvním krokem je přeměna glukózy přes fruktóza-1,6-bisfosfát za spotřeby 2 ATP na vhodný donor atomů vodíku, glyceraldehyd-3-fosfát. Následuje jeho dehydrogenace, kdy je vodík odebírán NAD +, a vznik kyseliny pyrohroznové. Čistý zisk z jedné molekuly hexózy jsou 2 ATP. Obr. 6: EMP-schéma. glukóza fruktóza-1,6-difosfát 4 ADP 4 ATP 2 kyselina fosfoglycerová 2ATP 2ADP 2 NADH+H + 2 NAD + kyselina pyrohroznová glyceraldehyd-3-fosfát + dihydroxyacetonfosfát (Němec a Horáková, 2002, upraveno) 4.3.2. Aerobní respirace Při aerobní respiraci je substrát oxidován na CO 2 a H 2 O cyklem seřazených reakcí, jimiž jsou postupně odebírány vodíky výchozí látce acetyl-koa, který vzniká oxidační dekarboxylací kyseliny pyrohroznové za přítomnosti KoA. Cyklus bývá často označován jako Krebsův cyklus, cyklus trikarbonových kyselin či jako citrátový cyklus a slouží nejen k terminální oxidaci substrátů, ale podílí se svými meziprodukty i na procesech biosyntézy. Jde tedy o typický amfibolický děj. Celkový výtěžek aerobní respirace je 36 ATP. Fakultativně anaerobní kvasinky využívají raději aerobní respiraci, protože je energeticky mnohem výhodnější než kvašení. 11

Při nadbytku může být organický substrát, který slouží jako zdroj energie, pouze částečně oxidován za vzniku velkého množství organického produktu. Toho se průmyslově využívá při aerobní kvasné výrobě některých organických kyselin, např. kyseliny citrónové u Yarrowia lipolytica (Kamzolova a kol. 2007). 4.3.3. Kvašení Při kvašení nedochází k úplnému rozkladu substrátu jako u aerobní respirace, proto i množství získané energie je menší (2 ATP). Fermentace je shodná s EMP-dráhou (Obr. 6) až do vytvoření kyseliny pyrohroznové, ta je dále dekarboxylována pyruvátdekarboxylázou na acetaldehyd, který je redukován na etanol. Na redukci acetaldehydu se podílí alkoholdehydrogenáza I (AdhI), která se nachází v cytoplazmě. U Saccharomyces cerevisiae byly zjištěny ještě další typy, které se účastní především oxidace etanolu. AdhII je lokalizována v cytoplazmě a při nízké buněčné koncentraci etanolu může být využita i při kvašení. Dehydrogenázy AdhIII a AdhIV se nacházejí v mitochondriích, AdhV v cytoplazmě a lokalizace AdhVI a AdhVII není přesně známa (Smidt a kol. 2008). AdhVI je striktně specifická k NADPH a je aktivní k řadě substrátů, které obsahují alifatické a aromatické primární alkoholy a aldehydy. Katalytická aktivita AdhVI může vést k biodegradaci ligninu (aldehyd veratrový a anýzový) a umožňuje kvasinkám růst i při již toxické koncentraci těchto aldehydů (Larroy a kol. 2002). 12

5. Využití kvasinek Kvasinky jsou celosvětově jedním z průmyslově nejvyužívanějších mikroorganizmů. Jsou nezastupitelné v potravinářském a farmaceutickém průmyslu a v některých oblastech vědy, techniky i medicíny. Mohou být využity jako biologické modelové systémy pro studium obecných regulací metabolizmu a genetiky eukaryotických buněk. Saccharomyces cerevisiae je z tohoto hlediska nejvíce prostudovanou kvasinkou. Kvasinky bývají označovány jako nejstarší domestikovaný organizmus, který je po tisíce let používán k výrobě alkoholických nápojů a kynutého pečiva. Podstatná je také produkce biologicky aktivních látek, biodegradační aktivita a výroba potravinářské a krmné biomasy. V současné době nacházejí kromě tradičních technologií stále větší uplatnění i v řadě dalších aplikací (např. výroba organických kyselin, vitamínů, atd.). Geneticky modifikované kvasinky produkují farmakologické preparáty pro prevenci i léčbu onemocnění. V budoucnu lze díky technikám rekombinantní DNA očekávat další rozvoj využití kvasinek. 5.1. Pivovarské kvasinky Při kvašení piva se využívá tzv. spodních a svrchních kvasinek a jejich schopnosti přeměny jednoduchých cukrů (glukóza), disacharidů (maltóza) a některých trisacharidů (maltotrióza) na etanol a CO 2 anaerobním kvašením. Spodní kvasinky se v konečné fázi shlukují ve vločky (flokulace) a sedimentují na dně kvasné nádoby. Po stáhnutí piva se properou studenou vodou a po promytí se znovu použijí pro další proces. Proces kvašení probíhá při teplotě 6-12 C. Svrchní kvasinky jsou po skončení kvašení vynášeny na povrch fermentační kapaliny, kde tvoří hustou pěnu. Snášejí vyšší teploty než kvasinky spodní, mohou kvasit v rozmezí 10-25 C. Jako svrchní kvasinky bývají označovány Saacharomyces cerevisiae, jako spodní Saccharomyces carlsbergensis či Saccharomyces uvarum. Při reklasifikaci založené na elektroforetických analýzách buněčných enzymů, antigenní aktivitě mananů buněčné stěny a na procentuálním obsahu G+C bází v jaderné DNA bylo prokázáno, že všechny kvasinky využívané pro alkoholovou fermentaci patří do stejného druhu, a to Saccharomyces cerevisiae (Obr. 7). Přesto se díky tradici a zvyku v pivovarnictví užívá staršího názvosloví (Jin a Speers 1998). 13

Obr. 7: Změny nomenklatury Saccharomyces cerevisiae. (Jin a Speers, 1998, upraveno) taxonomická studie v roce: 1952 1970 1984 S. cerevisiae S. willianus S. cerevisiae S. coreanus S. coreanus S. carlsbergensis S. uvarum S. logos S. bayanus S. pastorianus S. oviformis S. beticus S. uvarum S. bayanus S. heterogenicus S. heterogenicus S. chevalieri S. fructuum S. italicus S. steineri S. chevalieri S. italicus S. globosus S. globosus S. aceti S. prostoserdovii S. oleaceus S. capensis S. diastaticus S. hienipiensis S. inusitatus S. norbensis S. abuliensis S. cordubensis S. gaditensis S. hispalensis S.cerevisiae Pivovarské kvasinky mají zpravidla oválný až kulatý tvar. Důležité je, aby kultura měla vyrovnaný tvar, stabilní vlastnosti, omezenou sporulaci a pohlavní rozmnožování, které je největším zdrojem proměnlivosti. Rozsah laboratorního posuzování vlastností kvasnic záleží na účelu kontroly. Sleduje se především schopnost zkvašování mladiny, flokulace, sedimentace a vliv na organoleptické vlastnosti piva. Jako vedlejší kvasné produkty, které dotvářejí chuť a aroma piva, se uvádějí především alifatické alkoholy (isoamylalkohol), estery (etylacetát, etylhexanoát, isoamylacetát), aldehydy a mastné kyseliny. Jako nežádoucí produkt je potom diacetyl, který ovlivňuje chuť i v malém množství. Při podrobnější charakteristice se u kmenů ověřuje míra zkvašování rafinózy, tolerance k etanolu, osmofilie, tendence k tvorbě 14

pseudomycelia, vzhled kolonií atd. Na produkci látek a tedy i na kvalitu piva má velký vliv fyziologický stav a stáří kultury (Bendová a Kahler 1981). 5.1.1. Způsoby zefektivnění klasické technologie V současném pivovarnictví je snaha o efektivnější, kratší výrobu a tím i snížení nákladů a dosažení lepších výtěžků při kvašení. Kyslík je důležitý pro zisk energie při aerobní respiraci a pro syntézu sterolů a nenasycených mastných kyselin, které jsou nezbytné pro buněčnou membránu. Bez těchto složek se buňky nemohou rozmnožovat a klesá jejich životaschopnost. Proto byly kvasinky kultivovány za různého stupně provzdušňování. Bylo zjištěno, že průběžné provzdušňování při kultivaci kvasnic má významný vliv na metabolizmus kvasinek, jejich výnosnost a na kvalitu piva. Každý kmen kvasinek ale reaguje odlišně na různé stupně provzdušňování při kultivaci. V průběhu kvašení byl pozorován účinek pouze u prvního nasazení kvasnic, potom kvasinky získaly zpátky své původní vlastnosti (Chul a kol. 2007). Další možností pro zlepšení technologie výroby piva může být mutageneze kvasnic, které by mělo zlepšit především využití substrátu - cukrů. Mutantní kmen kvasinek SGM11 je geneticky stabilní a jeho schopnost zkvašování maltotriózy byla výrazně zdokonalena zvýšenou expresí příslušných transportérů. Kvalita piva vyrobeného pomocí kmene SGM11 byla hodnocena jako standardní (Liu a kol. 2008). Vnesení genu bgls homologní rekombinací do lokusu PEP4 S. cerevisiae má zdokonalit filtraci piva, zvýšit výtěžek z extraktu a předcházet β-glukanovým kalům. Gen bgls z Bacillus subtilis kóduje endo-1,3-1,4-β-glukanázu, která hydrolyzuje β-glukany, ty jsou zodpovědné za tvorbu kalu a špatnou filtrovatelnost piva. Saccharomyces cerevisiae neumí štěpit β-1,4-vazby β-glukanů, je tedy nutné dodávat komerčně připravované enzymy. Rekombinantní kmeny SC-βG s genem bgls tuto vlastnost mají, tím se zvyšuje filtrovatelnost a stabilita produktu. Kmeny SC-βG mohou ale štěpit pouze β-1,4-vazby přilehlé k β-1,3-vazbám (Zhang a kol. 2008). 5.1.2. Flokulace Flokulace je reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky) a následně usazeninu. U spodních kvasinek se projevuje tvorbou pevného sedimentu na dně. U svrchních kvasinek souvisí se shlukováním i pevnost kvasničné deky na povrchu mladého piva. Flokulace a sedimentace musí proběhnout až po ukončení kvašení, kdy je 15

vyčerpáno dostatečné množství cukru. Mechanizmus zatím není zcela uspokojivě objasněn (Stratford 1992). U spodních kvasinek je flokulace řízena lektinovým mechanizmem, vyžaduje vápník, je inhibována manózou a jinými cukry, ale není ovlivňována etanolem. Začátek flokulace souvisí s objevením aktivního lektinu na povrchu buněk a se snížením koncentrace cukrů v roztoku. U svrchních kvasinek flokulace neprobíhá stejným mechanizmem, není inhibována manózou a nevyžaduje přidání vápníku. Nástup flokulace je ovlivněn změnou buněčného povrchu a zvýšením koncentrace etanolu. Jediný důkaz pro adhezní mechanizmus je potřeba malého množství vápníku (Dengis a kol. 1995). Kvasinky můžeme dělit do 4 skupin, a to na neflokulující (prachové), mírně flokulující, silně flokulující a kvasinky, které se usazují na začátku kvašení díky tvorbě řetízků. Některé kvasinky flokulují pouze v přítomnosti jiných kvasinek (koflokulující). Na flokulaci má vliv řada faktorů: kmen kvasinek (genetické, fyziologické vlastnosti, metabolizmus), složení živného média a růstové podmínky (přítomnost anorganických iontů, etanolu, živin, teplota, ph, aerace, obsah rozpuštěného O 2, ). Vločky se mohou skládat až z tisíců buněk a protože buňky nevykazují Brownův pohyb, má míchání při flokulaci velký význam. Flokulace je geneticky podmíněná vlastnost řízená skupinou genů FLO, jejichž produkty FLOp jsou soustředěny na povrchu buňky. Hydrofóbní C-konec FLOp je nezbytný pro ukotvení na buněčném povrchu a pro mezibuněčné interakce. Naproti tomu N-konec působí jako reakční doména (Jin a Speers 1998). Transkripční aktivita genů je ovlivněna živinami stejně tak jako stresovými faktory. Flokulace je tedy závislá na stavbě buněčné stěny a morfologii buňky (Verstrepen a kol. 2003). Jako inhibitory flokulace se uvádějí především maltóza a manóza, méně účinné jsou sacharóza a glukóza, neúčinné jsou galaktóza a fruktóza. Od toho se pak odvozuje dělení fenotypů, Flo1 fenotyp je citlivý pouze k manóze, NewFlo fenotyp je kromě manózy citlivý i ke glukóze a maltóze. Flokulující kvasinky se ale také mohou rozlišovat na MS (citlivé k manóze), GMS (citlivé k manóze a glukóze) a MI (necitlivé k manóze). Flokulace je založena na interakci proteinů buněčné stěny a je závislá na iontech vápníku. Pro vysvětlení mechanizmu flokulace jsou dvě hypotézy: tvorba vápenatých můstků a lektinová hypotéza. Dříve se předpokládalo, že vápenaté ionty tvoří můstky mezi flokulujícími buňkami a negativním nábojem na buněčném povrchu, k udržení této struktury je zapotřebí vodíkových vazeb. V současné době je spíše uznávána lektinová hypotéza (Obr. 8). Charakteristický 16

povrchový protein zymolektin, který je přítomen u flokulujících kvasinek, váže manózové zbytky mananových molekul na povrch sousední buňky. Vápenaté ionty udržují správnou stavbu zymolektinové vazebné sítě (Janderová a Bendová 1999). Obr. 8: Lektinová hypotéza flokulace u kvasinek. 1) 2) Tvorba vazeb mezi 1) flokulujícími kvasinkami a 2) flokulující a neflokulující kvasinkou. Flokulující buňky FLO1 mají vazebná místa i receptory, zatímco neflokulující buňky flo1 mají na svém povrchu pouze receptory. (Jin a Speers, 1998, upraveno) 5.2. Vinařské kvasinky Vinařské kvasinky mají protáhlé elipsoidní buňky, jsou tolerantní k SO 2 (zasíření moštu). Kvašení probíhá do teploty 25 C po dobu 7-14 dnů. Oproti pivovarským kvasinkám jsou odolnější k alkoholu. Do moštu se dostávají buď s povrchu bobulí (spontánní kvašení) nebo přidáním čisté kultury ušlechtilých kvasinek (čisté kvašení). Ve vinařství se uplatňuje především Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus s různými názvy dle původu, dále pak Kloeckera, Hanseniaspora guilliermondii, Saccharomyces beticus (produkce buketních látek) či Saccharomyces oviformis, která se označuje jako dokvášecí kvasinka a je tolerantnější k alkoholu. Autolýza kvasinek přispívá k buketu vína. Pro každou vinařskou oblast je typická jiná mikroflóra na hroznech, která se odráží v buketu přirozeně fermentovaného vína. Kvasinky na bobulích se liší jak mezi většími oblastmi, tak i mezi vinicemi uvnitř regionu (Pennisi 2005). I za standardních laboratorních 17

růstových podmínek se transkripční profil divokých vinařských a laboratorních kmenů kvasinek výrazně liší v několika genech, které jsou spojovány s charakteristickými vlastnostmi vinařských kvasinek. Pokusy ukázaly, že vinařské kmeny jsou více kolonizovány transpozony než kmeny laboratorní. Transpozony by mohly být použity jako vhodný prostředek pro rozlišení průmyslových kmenů na molekulární úrovni (Hauser a kol. 2001). Složení mikroflóry rovněž ovlivňuje, zda byl hrozen napaden plísní či nikoliv. Při fermentaci hroznů napadených plísní Botrytis působí ze začátku slabě fermentující kvasinky (Hanseniaspora, Issatchenkia, Clavispora, Metschnikowia, Pichia, Candida atd.), které jsou později nahrazeny rodem Saccharomyces (Nisiotou a kol. 2007). Vliv na výsledné aroma vína mají použité kmeny kvasinek a jejich schopnost produkovat těkavé thioalkoholy a další metabolity fermentace, kterými se dotváří výsledná chuť. Kmeny, které produkují více thioalkoholů, způsobují u vína Sauvignon Blanc vyšší barevnost zralého vína a právě to je kladně hodnoceno při degustaci. Výběr kmene kvasinek tedy nabízí určitou možnost, jak pozměnit chuť vína (Swiegers a kol. 2009). 5.3. Pekařské kvasinky Stejně jako u pivovarských kvasinek se požaduje vyrovnanost tvaru (vejčitý či krátce elipsoidní), velikosti buněk a stálost technologických vlastností. Ty se získaly selekcí kmenů s poškozenou schopností sporulace. Pekařské droždí je připraveno aerobní fermentací okyselených melasových zápar s přidanými amonnými solemi a fosfátem. Zápary jsou silně provzdušňovány a aerobní metabolizmus je také zajišťován opakovanými přídavky čerstvé zápary. Kvasinky se potom rychleji množí i v prostředí s nízkou koncentrací cukru. Přesto se však produkuje malé množství etanolu. Kvasinky by neměly aglutinovat a autolyzovat, což je velmi důležité pro delší trvanlivost droždí (Šilhánková 2002). Obsah lipidů, hlavně sterolů a fosfolipidů, má vliv na odolnost kvasinek k zmrznutí (Gélinas a kol. 1991). Při snížené koncentraci glukózy v živném médiu mohou pekařské kvasinky tvořit rozsáhlý biofilm a pevně se vázat na podložku. S. cerevisiae je dobře prostudovaný organizmus a má osekvencovaný celý genom, proto by tento model mohl být významný při odhalení funkce genů a bílkovin u patogenních hub (Helmuth 2001). 5.4. Lihovarské kvasinky Při výrobě lihu se nejvíce využívají vyšlechtěné kvasinky Saccharomyces cerevisiae, které jsou přizpůsobeny různým lihovarským záparám, především melase. Je pro ně typická 18

velká tolerance k etanolu a teplotě (až 30 C), vysoká rychlost kvašení (24-48 hod), vysoký výtěžek na jednotku spotřebovaného substrátu a malé množství vedlejších produktů. Kvasinky by neměly aglutinovat a sedimentovat. Nejsou schopny zkvašovat škrob, pentózy a laktózu. 5.4.1. Netradiční organizmy pro výrobu etanolu V současnosti se pro kvašení používá mnohodruhové mikrobiální společenstvo, které obsahuje kvasinky, bakterie i houby (Candida sp., Kluyveromyces, Monilia, Fusarium, Clostridium), nebo se aerobně naštěpí celulóza a pentózy a pak se anaerobně vyrábí líh. Nevýhodou těchto organizmů je větší tvorba vedlejších produktů, které líh znehodnocují. Kvašení většinou probíhá pomaleji. Bakterie Zymomonas mobilis je toleratní k etanolu, má vyšší výtěžky etanolu a menší produkci biomasy oproti kvasince S. cerevisiae. Z. mobilis využívá pro zisk etanolu sacharózu, glukózu a fruktózu ED-dráhou, není ale schopna přeměňovat polymery (škrob, celulóza, hemicelulóza). Nevýhodou je tvoření vedlejších produktů, např. sorbitol, acetoin, glycerol, laktát. Genetické manipulace (vnesení genů pro hydrolytické enzymy,...) zdokonalily fermentační vlastnosti Z. mobilis a snížily významně tvorbu vedlejších produktů. Tím by se mohlo zvýšit průmyslové využití tohoto organizmu (Gunasekaran a Raj 1999). Vláknitá kvasinka Monilia sp. produkuje hemicelulázy a celulázy a může tedy kromě glukózy a xylózy zkvašovat na etanol i celulózu (Cheng-Shung Gong a kol. 1981). Anaerobní termofilní bakterie Thermoanaerobacter ethanolyticus tvoří etanol ze škrobu, celulózy a xylózy. Vytvořený etanol ale potlačuje růst bakterií a tím i další produkci etanolu. Řešením může být vnesení genu pro větší toleranci k etanolu do genomu bakterie (Peng a kol. 2008). Grampozitivní bakterie Clostridium sp. při produkci etanolu odebírá 5-ti uhlíkaté cukry z lignocelulózové biomasy, jako zdroje uhlíku dále využívá anorganické i organické sloučeniny (Cotter a kol. 2009). Mirkoskopická houba Fusarium oxysporum produkuje nejen celulázy, xylanázy, ale i β-glukosidázy a může k tvorbě etanolu využívat lignocelulózový komplex, který se skládá z celulózy, hemicelulózy, ligninu a extraktů. Vedlejšími produkty jsou např. xylitol a kyselina octová (Ruiz a kol. 2007). Netradiční kvasinky, které se průmyslově využívají k produkci etanolu nebo k tomu mají předpoklady, patří do rodů Pichia, Candida, Kluyveromyces, Issatchenkia, Rhodotula, Zygosaccharomyces, Clavispora, Debaryomyces, Metschnikowia a Cryptococcus. Tyto 19

kvasinky zkvašují xylózu, výtěžek etanolu je 0,12-0,38 g na 1 g xylózy (Rao a kol. 2008). Lignocelulózové zbytky (D-glukóza, D-xylóza) využívá i kvasinka Pachysolen tannophilus (Sánchez a kol. 2002). 5.5. Patogenní kvasinky Mezi kvasinkami se vyskytuje málo patogenních rodů, nejčastější jsou rody Candida, Cryptococcus, Malassezia a Trichosporon. Většinou jde o potenciální patogeny, kteří vyvolávají onemocnění zejména u oslabeného organizmu. V posledních letech přibývají klinické nálezy i dalších kvasinek (Geotrichum, Rhodotula, Saccharomyces, Hansenula anomala) u pacientů se sníženou imunitou (např. léčba antibiotiky, kortikoidy, prodělaný chirurgický zákrok, závažné onemocnění AIDS, leukémie). Není ovšem zcela jasné, zda tyto kvasinky přímo souvisí s onemocněním (Bonini a kol. 2008, Mestroni a Bava 2003). Onemocnění vyvolaná kvasinkami jsou obecně špatně léčitelná, protože antibiotika jsou obvykle neúčinná. Candida albicans běžně kolonizuje slizniční povrchy. Pro oslabený organizmus se může stát patogenem a může způsobit chronické povrchové infekce, v horším případě i multiorgánové smrtelné infekce. Patogenita závisí na změně exprese, funkce a aktivitě běžných genů. Nejvýznamnější z nich je proteolytická aktivita enzymů (Meiler a kol. 2009, Thewes a kol. 2008). Candida glabrata je další klinicky běžně izolovanou kvasinkou. Mechanizmus virulence C. glabrata není zcela přesně znám, ale přisuzuje se změnám v karyotypu, kdy organizmus buď ztratí nebo získá chromozom (Poláková a kol. 2009). Cryptococcus neoformans je opouzdřená kvasinka, která může být příležitostný vnitrobuněčný patogen a může způsobovat nemoci u pacientů se sníženou imunitou, zejména u lidí s AIDS, pacientů s transplantacemi a zhoubnými nádory (Wozniak a Levitz 2008). Malassezia spp. je součástí běžné kožní mikroflóry lidí i zvířat, u oslabeného organizmu může způsobovat kožní i systémové onemocnění (Tai-An Chen a Hill 2005). Trichosporon spp. je oportunně patogenní kvasinka, která je běžným etiologickým agens rozšířených kvasinkovitých infekcí a bílých plísňovitých onemocnění vlasů (Chagas-Neto a kol. 2008). Klinický výskyt Trichosporon asahii se týká především vážných systémových a nozokomiálních infekcí předčasně narozených dětí nebo novorozenců (Téllez-Castillo a kol. 2008). Saccharomyces cerevisiae je rovněž oportunní patogen. V současné době vzrůstá počet klinických izolátů od jedinců se sníženou imunitou. Byla proto porovnávána virulence klinických izolátů, kmene z ovoce a běžného laboratorního kmene na myším modelu. 20

Rostlinný kmen byl pro myš letální, laboratorní kmen se ukázal jako avirulentní. Virulentní kmeny neobsahovaly gen ssd1 a rostly za vyšší teploty. Potlačení funkce genu ssd1, který mění složení a stavbu buněčné stěny na povrchu buňky, je odpovědné za růst virulence (Wheeler a kol. 2003). Pekařské kvasinky mohou mít ale také terapeutický význam. Alkoholový extrakt se po léta užívá jako podpora léčby hemeroidů, popálenin a různých poranění. Tento extrakt obsahuje 3 stresové proteiny (superoxid-dismutáza, ubiquitin a HSP 12) a protein II pro vazbu acyl-koa. V kultuře myších buněk, která byla vystavena působení extraktu, okamžitě vzrostla buněčná respirace a kinázová aktivita (Schlemm a kol. 1999). Jako běžný dietní antigen jsou pekařské kvasinky užívány u pacientů s vředovitými záněty tlustého střeva. Titry protilátek k S. cerevisiae se zdají být specifické ke Crohnově chorobě, což by mohlo být významné při odlišení této nemoci od podobných infekcí. Není ale vyloučena možnost druhotné infekce neznámým agens, které způsobují vysokou koncentraci těchto protilátek (Main a kol. 1988). 5.6. Geneticky modifikované kvasinky Nejvhodnějším modelem pro genové manipulace u eukaryot jsou kvasinky. Bakterie mají jiné posttranslační úpravy a jsou geneticky méně komplexnější. Kvasinky mají stabilní haploidní i diploidní stav, rostou rychle, je zde možnost klonování a snadná izolace mutantů. Geneticky modifikované kvasinky jsou obvykle nepatogenní. Rekombinantní proteiny jsou získány s malými náklady v relativně velkém množství. Neobsahují toxiny či virové inkluze, tím jsou bezpečné pro použití i člověkem. Pozměněné či umělé kombinace genů mění či doplňují genovou výbavu kvasinek, a to především metabolické dráhy, které se týkají tvorby sloučenin (vitamíny, aminokyseliny, antibiotika, enzymy). Dochází tedy k produkci bílkovin, které se přirozeně vytvářejí v nepříbuzných organizmech. Pro modifikace se využívá mutageneze DNA, rekombinantních technik, regulace genové funkce, mimojaderné dědičnosti atd. U Saccharomyces cerevisiae byl objeven tzv. 2 µm plazmid, který se stal základem pro konstrukci řady epizomálních plazmidových vektorů. Plazmidy se v eukaryotní buňce přirozeně nacházejí jen zřídka. Dalšími druhy vektorů jsou integrační či replikační plazmidy, umělé chromozomy atd. (Brown 2007). Organizmy, u nichž jsou v největší míře prováděny genové manipulace, jsou Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe a v posledních letech výrazně i Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha či Kluveromyces lactis. Genové inženýrství pomohlo mnoha objevům a výzkumu různých molekulárních jevů a dějů 21

(existence intronů v genech eukaryot). Praktické využití nových vlastností kvasinek a jejich produktů v průmyslu, zemědělství a zdravotnictví je základem pro moderní biotechnologie (Rosypal a kol. 2002). 5.6.1. Pichia pastoris a produkce heterologních proteinů Jako hostitelského organizmu pro intracelulární i extracelulární expresi heterologních proteinů se využívá metylotrofní kvasinka Pichia pastoris. Výhodou proteinů produkovaných eukaryotickou expresí je vhodné sbalení a správná formace disulfidických vazeb, glykozylace a vylučování. P. pastoris je málo náročná na kultivační prostředí, jako zdroj energie a uhlíku slouží metanol. Díky jednoduchému složení média se vyloučené bílkoviny snáze čistí a izolují, což P. pastoris zvýhodňuje oproti jiným kvasinkám či jiným mikroorganizmům. V literatuře se udává, že k úspěšné expresi došlo již u 400 prokaryotních, eukaryotních i virových bílkovin. GLP-1 (peptid podobný glukagonu), který má pravděpodobně léčebné účinky u diabetes typu 2, a lidský sérový albumin (HSA) byly plazmidovým vektorem vneseny do genomu P. pastoris, kde se spojily a vznikl protein KGLP-1/HSA. GLP-1 je v organizmu rychle odbouráván dipeptidyl-peptidázou IV a je odstraňován ledvinami. Proto je jeho působení v organizmu velmi krátké. Ukázalo se, že vzniklý protein KGLP-1/HSA chrání GLP-1 a prodlužuje jeho délku účinku v organizmu, což by mohlo vést k jeho využití v léčebných procesech (Gao a kol. 2009). Pro zisk HBsAg (virové povrchové antigeny hepatitis B) je využita kvasinka P. pastoris GS115 s HBsAg genem vloženým do lokusu pro AOX promotor. HBsAg se skládají do charakteristických zhruba 22 nm velkých viru podobných částic, které jsou vysoce imunogenní a jsou schopné vyvolat účinné neutralizační protilátky. Nově navržený dvoufázový proces se skládá z jednorázové dávky glycerolu a konstantního přítoku metanolu. Tímto způsobem se získalo až 7x více HBsAg než u předcházejících metod. To by mělo vést k výraznému snížení ceny vakcíny proti HBV a jejímu rozšíření i do chudých zemí (Gurramkonda a kol. 2009). Kromě produkce úplné HBsAg je možné exprimovat i rekombinantní fragment protilátky (Ning a kol. 2005). Pro ověření přítomnosti HBsAg se běžně užívá antigenů, které jsou získány z krevní plazmy jedinců nakažených HBV. Tyto antigeny ale mají jisté nevýhody, např. vysoká cena, riziko infekce, obtížná příprava. Alternativou mohou být HBsAg získané díky technologii rekombinantní DNA. Rekombinantní HBsAg se úspěšně používají jako vakcína pro HBV, ale pro stanovení HBaAg nejsou vhodné zejména pro jejich nízkou citlivost a reaktivitu. Proto byl 22

do P. pastoris vložen S gen HBV. Ukázalo se, že S protein může nahradit krevní HBsAg při detekci HBsAg metodou ELISA (Hu Bo a kol. 2005). Gen lsd1 kódující dextranázu z Lipomyces starkeyi KSM22 byl dříve klonován do Saccharomyces cerevisiae, nyní byl plazmidovým vektorem (Obr. 9) přenesen do P. pastoris. Výtěžek bílkoviny z transformované P. pastoris byl zhruba 4,2x vyšší než u S. cerevisiae. Dextran je vysokomolekulární polysacharid složený z glukózových jednotek. Tvoří ho například ústní streptokokové a účastní se vzniku zubního plaku. Jeho produkce půdními bakteriemi má velký podíl na nákaze cukrové třtiny, a způsobuje tedy velké problémy při produkci cukrů. V současné době je v popředí zájmu hydrolýza mikrobiálního dextranu, která by měla vést k vyšší citlivosti mikrobů vůči antibiotikům (Hee-Kyoung a kol. 2009). Obr. 9: Plazmid ppic9k-lsd1 vytvořený pro gen lsd1 z Lipomyces starkeyi pro expresi v rekombinantní P. pastoris. Promotor 5 AOX, který je po přenosu indukován metanolem, S je sekvence sekrečního signálu ze S. cereviasiae, LSD1 představuje oblast kódující gen pro dextranázu z Lipomyces starkeyi. SacI je restrikční místo pro linearizaci plazmidu před elektroporací do P. pastoris. (Kang a kol., 2008, upraveno) 5.7. Kvasinky jako modelový systém Vhodným modelovým organizmem pro studium exprese DNA i bílkovin, genových manipulací, posttranslačních modifikací genového produktu atd. u eukaryot jsou kvasinky. 23

Kvasinky jsou snadno kultivovatelné a díky vysoké koncentraci metabolitů a hustotě buněk je u nich možné zjistit i malá množství metabolitů. Umožňují změřit i stresové odpovědi buňky spojené s metabolizmem. Kvasinky jsou dobře prostudované, proto mohou značně usnadnit studium pochodů uvnitř buňky. 5.7.1. Schizosaccharomyces pombe S. pombe je jeden z šesti eukaryotních organizmů, jehož genom byl kompletně osekvencován; fyzická mapa genomu v roce 1993 (Mizukami a kol. 1993, Hoheisel a kol. 1993), osekvencování genomu v roce 2001 (Wood a kol. 2002). Tento jednobuněčný organizmus má 3 chromozomy s 4 824 geny, což je méně než u některých prokaryot. V průměru má jeden gen 2 528 bp. Díky své jednoduchosti je vhodným modelem pro řadu fyziologických, metabolických pochodů i pro studium stavby buňky. Pro S. pombe jsou typické velké centromery, které jsou významným znakem jejich genomu. Není ale zcela jasné, proč kvasinky, které se rozmnožují příčným dělením, mají centromery asi 300-1 000x větší než stejné kvasinky, které se rozmnožují pučením. Modelem centromer pro vyšší eukaryota je 2-doménová struktura (centrální a vnější repetiční doména) dělících se kvasinek, která se považuje za obecnou formu centromerické DNA. Díky sekvencování genomu je možné zjistit, které geny jsou jedinečné pro buňky eukaryot. Vysoce konzervované geny mezi osekvencovanými eukaryoty jsou např. geny pro cytoskeleton, kontrolu buněčného cyklu, proteolýzu, atd. Celkem se určilo 62 vysoce konzervovaných genů u eukaryot, které nejsou přítomny u prokaryot. Tyto geny jsou nezbytné pro stálou eukaryotickou strukturu buňky (Yanagida 2002). 5.7.1.1. Buněčný cyklus u eukaryot Buněčný cyklus je doba, za kterou buňka zdvojnásobí svůj obsah a rozdělí se ve dvě dceřinné buňky. Je to základní proces rozmnožování u všech buněk. Je nezbytný pro rozvoj, růst a opravy složitějších organizmů. Regulace a zapojené geny jsou podobné u všech eukaryotních organizmů. Pro studium buněčného cyklu se využívá kvasinky Schizosaccharomyces pombe. Buněčný cyklus je rozdělen na 4 fáze G1, S (syntéza DNA), G2 a M (mitóza). Ve fázi G1 a G2 se buňka připravuje na replikaci a segregaci DNA. Střídání fází, souhru růstu a dělení nejvíce ovlivňují dimery cyklinu (Cdc2/Cig2 a Cdc2/Cdc13) a cyklin-dependentní 24

kinázy, které u kvasinek podporují nástup fáze S a M, ale brání ukončení mitózy (Obr. 10). Cdc2/Cdc13 negativně regulují 4 proteiny (Slp1, Ste9, Rum1 a Wee1), je aktivován Cdc25. Ve fázi G1 dimer Cdc2/Cig2 pomáhá aktivovat replikaci DNA. U eukaryot jsou geny pro tyto bílkoviny vysoce konzervované a jsou pojmenovány podle genů kvasinek (Sveiczer a kol. 2003). Obr. 10: Hlavní body, přeměny a kontrolní uzly eukaryotického buněčného cyklu. APC komplex podporující anafázi; Rum1 reverzní stechiometrický inhibitor; Wee1 tyrozinová kináza; Cdc2/Cig2 a Cdc2/Cdc13 - dimery cyklinu; (Sveiczer a kol., 2003, upraveno) Buněčný cyklus eukaryot má tři kontrolní body začátek (přechod fází G1/S), přechod fází G2/M a přechod metafáze/anafáze mitózy (Obr. 10). Buňky ve fázi G1 musí mít dost živin a musí dosáhnout kritické velikosti, aby se DNA mohla replikovat. Pokud je buňka malá nebo má poškozenou či neúplně zreplikovanou DNA kontrolní bod G2/M zdrží nástup 25

mitózy. Třetí kontrolní bod zajišťuje, aby se sesterské chromatidy nerozcházely dříve, než jsou chromozomy správně uspořádány na dělícím vřeténku. Kontrolní body ovlivňují buněčný cyklus řízením činnosti dimeru Cdc2/Cdc13 (Tyson a kol. 2002). 5.7.2. Saccharomyces cerevisiae S. cerevisiae je snadno kultivovatelná, fakultativně anaerobní kvasinka. Je velmi dobře prostudovaná, proto může být ideálním modelem, který napomáhá chápání fyziologických a metabolických pochodů u eukaryot. 5.7.2.1. Tvorba biofilmu Seskupováním mikroorganizmů do mnohobuněčných struktur vzniká biofilm, který umožňuje lepší adhezi buněk na podložku (např. umělé hmoty, slitiny kovů, ale i tkáně a lékařské nástroje, implantáty). Mikrobiální buňky v biofilmu jsou také odolnější vůči antimikrobní léčbě než jednotlivé buňky. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae mohou tvořit biofilm v laboratorních podmínkách. Biosyntéza β-1,3-glukanu a chitinu neprobíhá ani u rostlin ani u savců, je to tedy vhodné cílové místo pro působení nových antimykotik a pro genetické rozbory funkcí povrchových proteinů při patogenezi. Buňky S. cerevisiae mohou přilnout na polystyrenovou desku a zůstat na ní i po opakovaném umytí. Přilnavost buněk k povrchu byla zvýšena snížením koncentrace glukózy v živném prostředí, ale při úplné absenci glukózy byla přilnavost snížena. Podmínkou pro vznik biofilmu je aktivní metabolizmus (Reynolds a Fink 2001). Pro tvorbu biofilmu jsou nezbytné povrchové bílkoviny (flokuliny) kódované genem flo11, které jsou důležité jak pro přilnavost buněk k agaru tak pro flokulaci (Wan-Sheng Lo a Dranginis 1996). Gen flo8 kóduje regulační protein pro gen flo11. Porušením těchto dvou genů se výrazně sníží přilnavost buněk k povrchu. Transkripci genu flo11 u buněk rodu Saccharomyces značně ovlivňuje počet sad homologních chromozomů (Obr. 11). Přilnavost buněk k povrchu a nárůst povlaku tedy klesá se vzrůstajícím počtem sad chromozomů v buňce. Protein Flo11p má vlastnosti, které ho odlišují od ostatních povrchových proteinů kvasinek a které podporují vznik biofilmu a klouzavého pohybu, protože vzrůstá povrchová hydrofobnost buněk (Reynolds a Fink 2001). 26

Obr. 11: Vliv počtu sad homologních chromozomů na nárůst a přilnavost buněk. 1) 2) 3) 4) Řada kmenů S. cerevisiae 1) haploid; 2) diploid; 3) triploid; 4) tetraploid na YPD-0,3% agarových deskách po 13-ti denní kultivaci při 25 C. (Reynolds a Fink, 2001, upraveno) 5.7.2.2. Vznik nádoru U nádorových buněk probíhá často intenzivní glykolýza v přítomnosti kyslíku s doprovodným snížením mitochondriální respirace a vysokou produkcí laktátu. Pozornost byla spíše věnována možné spojitosti mezi zvýšenou glykolýzou a rozvojem nádoru, zatímco snížená respirace byla opomíjena. Vhodným organizmem pro manipulace s mitochondriální respirací jsou buňky Saccharomyces cerevisiae. Zvýšení respirace spouští buněčnou smrt, která tak chrání buňku před nádorovým bujením. Ke vzniku nádoru přispívá tedy jak zvýšená glykolýza tak i snížená respirace, která buněčnou smrt potlačuje. Silně snížená respirační schopnost může být rozhodující při vzniku zhoubných nádorů (Ruckenstuhl a kol. 2009). Rychle se množící kvasinky vykazují podobné fermentační hodnoty jako nádorové buňky. To tedy dovoluje studovat vztah mezi energetickým metabolizmem a rychlým rozmnožováním buněk. Apoptóza, která chrání organizmus před vznikem nádoru, je úzce spojena s procesy odehrávající se v mitochondriích savčích buňek. Buňky kvasinek ale díky chování mitochondrií (depolarizace membránového potenciálu) odolají programované buněčné smrti (Pereira a kol. 2008, Madeo a kol. 1999). Při pokusech přežívaly kmeny neschopné respirace lépe než divoké kmeny, které respirovaly. Apoptóza se výrazně snížila u respiračně deficientních oxa1 mutantů při srovnání s kontrolou divokého kmene. Podmínkou buněčné smrti u kvasinek je fragmentace mitochondrií. Stavba mitochondrií byla pozorována po 5-ti denní kultivaci buněk divokého kmene. Starší buňky ze středu kolonie prokázaly výrazné zvýšení fragmentace mitochondrií, které měly děravější strukturu. Naproti tomu u mladších buněk, z okraje kolonie, měly mitochondrie normální tubulární stavbu (Obr. 12). 27