METODICKÉ MOŽNOSTI STANOVENÍ PROTEINŮ V KREVNÍM SÉRU 1. STANOVENÍ CELKOVÉHO DUSÍKU (BÍLKOVIN) V KREVNÍM SÉRU POMOCÍ KJELDAHLOVY METODY Princip : Základem je mineralizace organických látek při varu s kyselinou sírovou, koncentrovanou. Tím se dusík převede na amoniak, který se naváže ve formě síranu amonného - (NH 4 ) 2 SO 4. Amoniak se uvolní alkalizací (NaOH) vzorku a je jímán po destilaci do roztoku kyseliny borité s indikátorem. Alkalizací kyseliny dojde ke změně zabarvení roztoku z růžové na zelenou. Množství amoniaku se stanoví titračně se slabou kyselinou sírovou do růžového zabarvení. Činidla : koncentrovaná kyselina sírová! POZOR! ŽÍRAVINA! mineralizační práškový katalyzátor: bezvodý síran měďnatý a bezvodý síran draselný hydroxid sodný 7,503 mol/l! POZOR! ŽÍRAVINA! kyselina boritá s indikátorem 0,647 mol/l kyselina sírová 0,00715 mol/l Postup : - propařte aparaturu po dobu nejméně 10ti minut vodní párou Do mineralizační baňky napipetujte: - 3 ml 10x zředěného krevního séra - 3 ml koncentrované kyseliny sírové (odměřovat válečkem!) a na špičku nože přidejte práškový mineralizační katalyzátor Připravte 2 vzorky a jeden slepý vzorek (slepý vzorek je totožný se vzorkem, jen místo krevního séra použijte neionizovanou vodu). Je možné připravit vnitřní standard (kontrolní sérum) lyonorm, s kterým se pracuje stejně jako se vzorkem. - mineralizujte v digestoři, plameny kahanů seřiďte tak, aby obsah baněk mírně vřel - zpočátku mineralizujte opatrně, hrozí nebezpečí vystříknutí, případně zhasnutí plamene - mineralizujte nejméně 2 hodiny (v ideálním případě i tři hodiny) Na konci mineralizace můžeme vidět projasnění vzorku. - zmineralizovaný vzorek po ochlazení přeneste kvantitativně do destilačního přístroje - mineralizační baňku vypláchněte 2 x cca 3 ml deionizované vody 1
- nalejte do přístroje 20 ml NaOH a to velmi opatrně z válečku. Oči chráníme při této manipulaci brýlemi! Opatrně na přestříknutí louhu dolů do výpustní baňky. - vypláchněte nálevku malým množstvím deionizované vody - zapalte kahan - uzavřete ventily a nechte destilovat - konec destilace si ověříte ph papírkem (reakce nesmí být alkalická) Obrázek č. 1: Parnas-Wagner schéma zařízení: D A B C E Vlastní destilační Parnas-Wagnerův přístroj se skládá z baňky A, ve které se vytváří vodní pára, která přes kondenzační baňku B prochází do baňky C. Do této baňky se nálevkou D vleje vzorek i hydroxid sodný. Vytěsněný amoniak je destilován a kondenzuje v chladiči, pod kterým je jímán do 10 ml kyseliny borité s indikátorem (E). Ústí chladiče musí být do kyseliny ponořeno a je třeba dbát na to, aby kyselina nebyla do chladiče nasávána (baňku A je třeba zahřívat nejdříve velmi malým plamenem, aby bylo možné var zvýšit). Destilujeme tak dlouho, dokud jímaný destilát vykazuje alkalickou reakci (kontrolujeme pomocí indikátorového papírku). Poté opláchneme trubici chladiče deionizovanou vodou a obsah jímací baňky titrujeme 0,00715 mol/l kyselinou sírovou do slabě růžového zbarvení, jejíž 1 ml odpovídá 0,2 mg dusíku. Výsledek titrace slepého vzorku odečteme od vlastního pokusu a vypočítáme obsah celkového dusíku a proteinů v analyzovaném vzorku krevního séra. 2
Výpočet : Při výpočtu celkového dusíku a proteinů ve vzorku krevního séra vycházíme z následujícího vztahu : 1 ml 0,00715 mol/l kys.sírové odpovídá 0,2 mg dusíku Při vyjadřování celkového dusíku ve vzorku nezapomeneme na počáteční ředění krevního séra před začátkem pokusu. Obsah proteinů ve vzorku vyjádříme přepočtením hodnoty celkového dusíku empirickým faktorem 6,25 (vychází z toho, že proteiny obsahují průměrně 16 % dusíku). Tímto výpočtem získáme přibližný obsah proteinů ve vzorcích séra. 2. STANOVENÍ CELKOVÝCH PROTEINŮ KREVNÍHO SÉRA BIURETOVOU REAKCÍ Princip : Látky obsahující peptidovou vazbu reagují s ionty Cu 2+ v alkalickém prostředí za vzniku červenofialového komplexu vhodnému k fotometrickému stanovení. Činidla : Diagnostická souprava BIO-LA-TEST Celkové bílkoviny (TP 300) fy PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o.: roztok 1: standard bílkoviny v g/l biuretovo činidlo (roztok měďnaté soli) : síran měďnatý 0,15 mmol/l, Chelaton 3 0,18 mol/l, hydroxid sodný 0,2 mol/l!pozor! ŽÍRAVINA! Postup : Pomocí připravených roztoků analyzujeme krevní sérum podle následující tabulky : Odměřit ( ml ) Vzorek 2x Standard 2x Slepý vzorek 1x Biuretovo činidlo 1,50 1,50 1,50 Krevní sérum 0,02 - - Standard bílkoviny - 0,02 - Deionizovaná voda - - 0,02 Obsah zkumavek se promíchá a nechá stát přesně 12 minut! Pak znovu promícháme a ihned změříme absorbance vzorku (A VZ ), standardu (A ST ) a slepého vzorku (A SV ) při vlnové délce 550 nm proti deionizované vodě. 3
Výpočet : Celková bílkovina v g/l = A VZ - A SV A ST - A SV c ST c ST koncentrace standardu bílkoviny - uvedená na lahvičce (roztoku 1) STANOVENÍ SÉROVÉHO ALBUMINU REAKCÍ BROMKRESOLOVOU ZELENÍ Princip: Albumin se váže na bromkresolovou zeleň (BCG) za nárůstu absorbance při 630 nm. Nárůst je úměrný množství albuminu v analyzovaném vzorku. Albumin představuje významný marker syntetických jaterních funkcí i nutričního stavu. Činidla: Diagnostická souprava L ALBUMIN fy BioVendor činidlo BCG: bromkresolová zeleň + citrátový pufr (ph 4,2 ± 0,1 při 22 ºC). Činidlo ze soupravy je už připraveno k přímému použití. Činidlo musí být čiré, žlutozelené barvy a pění. standard - LYONORM U nebo P koncentrace albuminu uvedena na atestu pro Lyonorm Postup: Činidla [ml] Vzorek (2x) Standard (1x) Slepý vzorek (1x) Sérum 0,01 - - Deionizovaná voda - - 0,01 Standard (Lyonorm U nebo P) - 0,01 - Činidlo BCG 1,00 1,00 1,00 Obsah každé zkumavky dobře promíchejte a nechte stát 10 minut při laboratorní teplotě. Poté změřte absorbanci vzorku (A VZ ), slepého vzorku (A SV ) a standardu (A ST ) při vlnové délce 570 nm proti deionizované vodě. Zbarvení je stabilní 60 min. 4
Výpočet: Albumin (g/l) = A VZ - A SV A ST - A SV c ST A VZ = absorbance vzorku A SV = absorbance slepého vzorku A ST = absorbance standardu (LYONORM U nebo P) c ST = koncentrace albuminu ve standardu (LYONORM U nebo P) 5
METODICKÉ MOŽNOSTI STANOVENÍ PROTEINŮ V MLÉKU 1. Formolová titrace Princip metody: Stanovení množství proteinů v mléce je založeno na kvantitativním stanovení jejich aminokyselin alkalimetrickou titrací hydroxidem sodným. Aminokyseliny se nedají vzhledem k amfoternímu charakteru titrovat přímo, ale až po zablokování zásaditých aminoskupin formaldehydem tzv. formolová titrace. Jejich stanovení v mléce, které obsahuje i jiné látky reagující s hydroxidem sodným vyžaduje vyloučení těchto látek. Šťavelanem draselným se z bílkovin odstraní vápník vázaný na karboxylové skupiny. Vznikne velmi málo rozpustný šťavelan vápenatý. První titrací se eliminují nebílkovinné látky reagující s hydroxidem sodným (slepý vzorek) dochází k neutralizaci kyseliny mléčné, citronové a dalších kyselin. Po přídavku formaldehydu se druhou titrací neutralizují aminoskupiny aminokyselin. Činidla: acidobazický indikátor: ethanolový roztok fenolftaleinu 1,9% šťavelan draselný: 0,137 mol/l formaldehyd: 36-38% roztok hydroxid sodný: 0,143 mol/l síran kobaltnatý: 0,323 mol/l Pracovní postup: a) Neutralizace formaldehydu: Do kádinky odeberte ze zásobní lahve cca 11 ml formaldehydu, přidejte 3 kapky acidobazického indikátoru a velmi opatrně po kapkách titrujte NaOH 0,143 mol/l do vzniku růžového zbarvení. Spotřeba by měla být velmi malá 1 nebo jen několik kapek. (Zneutralizovaný formaldehyd zakryjte např. hodinovým sklem a použijte pak v bodu c). b) Příprava srovnávacího vzorku (1x): Do titrační baňky odpipetujte 25 ml mléka, 1ml šťavelanu draselného a 0,5 ml roztoku síranu kobaltnatého. c) Analýza vzorku mléka (2x): Do titrační baňky odpipetujte 25 ml mléka, 0,25 ml indikátoru a 1 ml šťavelanu draselného. Po 2 min směs titrujte hydroxidem sodným 0,143 mol/l (vznik růžového zbarvení). Do ztitrovaného vzorku mléka přidejte 5 ml zneutralizovaného formaldehydu a po 2 min vzorek opět titrujte (NaOH) do standardního zbarvení srovnávacího vzorku (spotřeba V 2 ). 6
Výpočet: Obsah bílkovin v mléce [%] = spotřeba V 2 [ml NaOH] Další způsoby stanovení proteinů v neznámém vzorku Stanovení proteinů pomocí amidočerně 10B Princip metody: Proteiny vážou z pufrovaného roztoku mléka barvivo, jehož úbytek zjištěný spektrofotometricky je úměrný obsahu proteinů. 7
METODICKÉ MOŽNOSTI STANOVENÍ PROTEINŮ V MASE Příprava vzorku 1g vzorku masa se zhomogenizuje s vodou v poměru 1 : 3 pomocí tyčového homogenizátoru. Homogenát odstřeďte na odstředivce při otáčkách 5000 10 000 ot/min. po dobu 10 min. Odstředěný homogenát přefiltrujte přes filtrační papír do kádinky (získán výluh masa). Do centrálního prostoru Conwayovy nádobky nepipetujte 1 ml roztoku kyseliny borité s indikátorem (po přídavku 10 µl se zelená barva kyseliny změnila na červenou). Na jednu stranu vnějšího prostoru nádobky nepipetujte dle obrázku 1 ml masového výluhu a na protější stranu 1 ml nasycený roztoku uhličitanu draselného. 6 NH 3 + 2 H 3 BO 3 2 (NH 4 ) 3 BO 3 2 (NH 4 ) 3 BO 3 + 3 H 2 SO 4 3 (NH 4 ) 2 SO 4 + 2 H 3 BO 3 nasycený uhličitan draselný analyzovaný vzorek kyselina boritá s indikátorem Obrázek č. 2: Schéma přípravy metody dle Conwaye Po přikrytí nádobky krycím sklem natřeném na styčných plochách Ramsay tukem, vzorek promíchejte s roztokem uhličitanu draselného mírným krouživým pohybem a ponechte stát nejméně 2 hodiny při laboratorní teplotě. Po proběhnutí reakce nádobku odkryjte ( amoniak, který se absorboval v kyselině borité a ji zeleně zbarvil) a amoniak ztitrujte 8
kyselinou sírovou do slabě červeného zbarvení. Odečtěte spotřebu odměrného roztoku v ml na desetiny a využijte pro výpočet. Výpočet volného amoniaku ve vzorku masa [ ] kde: a = spotřeba odměrného roztoku kyseliny sírové (v ml) n = hmotnost podílu vzorku v gramech v 1 ml filtrátu f = faktor kyseliny sírové (=1000) Hygienické posouzeni zdravotní nezávadnosti masa podle výsledku analýzy obsahu amoniaku jsou uvedeny v tabulce č. 1. Tabulka č. 1 Posouzení zdravotní nezávadnosti masa dle obsahu amoniaku Maso Obsah amoniaku [mg.kg -1 ] čerstvé 120 170 dosud nezávadné 170 250 podezřelé 260 300 začínající rozklad 310 350 zkažené nad 360 9