Molekulární základ dědičnosti Dědičná informace je zakódována v deoxyribonukleové kyselině, která je uložena v jádře buňky v chromozómech. Zlomovým objevem pro další rozvoj molekulární genetiky bylo odhalení genetického kódu Watsonem a Crickem v roce 1953. V posledních desetiletích prožívá molekulární genetika bouřlivý rozvoj, široce je přitom využívána i mezinárodní spolupráce, protože výzkum v této oblasti je finančně velmi náročný. Jako příklad lze uvést projekt HUGO (Human Genome) pro mapování lidského genomu, projekty sekvenování lidského genomu aj. Nukleové kyseliny Deoxyribonukleová kyselina (DNA, deoxyribonucleic acid) je nositelem genetické informace, ribonukleové kyseliny (RNA, ribonucleic acid) se podílí na procesech, kterými je tato informace realizována. Některé viry však mají jako nositele genetické informace RNA. Patří k nim např. i medicínsky důležité viry jako je virus chřipky nebo Humane Immunodeficiency Virus (HIV), který vyvolává AIDS. Základním stavebním kamenem nukleových kyselin je nukleotid, který se skládá z cukru, fosforečného zbytku a dusíkaté báze. Cukr je v RNA pětiuhlíkatá ribóza, v DNA deoxyribóza. Na cukr se napojuje dusíkatá báze. V DNA to jsou purinové báze adenin a guanin a pyrimidinové báze tymin a cytosin, v RNA je místo tyminu uracil. Spojení pětiuhlíkatého cukru, fosfátové skupiny a dusíkaté báze tvoří nukleotid, spojení báze a deoxyribózy se nazývá nukleosid. V DNA jsou dva protisměrné nukleotidové řetězce, jeden ve směru 5-3, druhý 3-5, navzájem jsou spojeny do dvoušroubovice prostřednictvím vodíkových můstků mezi komplementárními bázemi adenin - tymin a guanin - cytosin. Obr. č. 1: Dvoušroubovice DNA Strukturu DNA (obr. č. 1) můžeme přirovnat k točitým schodům, jejichž "bočnice" jsou tvořeny spojením cukr - fosfátová skupina, které se monotónně opakují. Poloviny jednotlivých stupňů jsou tvořeny dusíkatou bází, která se napojuje na druhou polovinu - komplementárního partnera ze druhého vlákna. Chromozómy, ve kterých je DNA přítomna v jádře buněk, se skládají z řady makromolekul. Přibližně 60-90 % tvoří zhruba ve stejném poměru DNA a bázické proteiny histony. Dále jsou součástí chromozómů nehistonové proteiny, vyskytují se zde také molekuly RNA.
Replikace DNA Struktura ve formě dvoušroubovice a komplementarita bází umožňují semikonzervativní replikaci DNA. Replikace je zajišťována DNA polymerázami. Místo, kde probíhá syntéza nového vlákna se nazývá replikační vidlička. Dvoušroubovice DNA se rozpojí, každé vlákno je předlohou pro vznik komplementárního vlákna DNA. Postupně jsou na nově vznikající vlákno připojovány nukleotidy, které mají dusíkatou bázi komplementární k bázi na původním vláknu DNA. Z jedné "mateřské" dvoušroubovice DNA tak vznikají dvě "dceřinné", Obr. č. 2: Replikon každá z nich se skládá z jednoho původního a jednoho nově syntetizovaného vlákna DNA. Syntéza probíhá v obou směrech, obě replikační vidličky se od sebe vzdalují a vytvářejí tak útvar, který je možné pozorovat v elektronovém mikroskopu jako replikační bublinu. V prokaryontních buňkách je DNA syntetizována jako jednotka, tj. celý chromozóm je jeden replikon, v eukaryontních je rozčleněna do více částí replikonů (obr. č. 2,3). Replikace zde probíhá v S fázi buněčného cyklu. Obr. č. 3: Znázornění replikace chromozómu
Transkripce RNA Při transkripci je podle předlohy v DNA syntetizována RNA (obr. č. 4). Základními typy ribonukleové kyseliny jsou transferová trna, ribosomální rrna a messenger mrna. Funkcí transferové RNA je přenos aminokyselin k proteosyntetickému aparátu. Ribosomální RNA je strukturní a funkční součástí ribosomů. Messenger RNA (messenger = poslíček) může mít velmi různou délku od několika set po několik tisíc nukleotidů, přenáší z jaderné DNA do cytoplazmy na ribosom ve formě specifické sekvence nukleotidů informaci o specifické sekvenci aminokyselin v genovém produktu - proteinu. Obr. č. 4: Schéma transkripce DNA DNA RNA RNApolymeráza Všechny typy RNA jsou syntetizovány podle jednoho mechanismu, kterým je přepis příslušného genového úseku z DNA. Přepisována, transkribována je sekvence nukleotidů v DNA, podle které vzniká komplementární sekvence nukleotidů v RNA. Tento proces je enzymaticky zajišťován RNA polymerázami. Signální sekvence DNA před genem, na které se váže RNA polymeráza se nazývá promotor. Na promotor se naváží transkripční faktory (proteiny), dále RNA polymeráza a za přítomnosti volných ribonukleotidů probíhá syntéza nového řetězce mrna. Produktem transkripce je prekurzorová pre-mrna. Kromě vlastního genu obsahuje také introny a okrajové části genu. Po proběhlé transkripci proto musí následovat maturace, dozrávání mrna. Během maturace dojde k enzymatickému rozštěpení pre-mrna a spojení exonů, kódujících částí. Introny, nekódující části pre-mrna zůstávají v jádře. Tento proces se nazývá splicing (obr. č. 5).
Obr. č. 5: Schéma splicingu Translace Proces translace, přepis informace o sekvenci nukleotidů v mrna do sekvence aminokyselin ve vznikajícím proteinu, probíhá na ribosomech, které jsou komplexem několika typů ribosomální RNA a proteinů (obr. č. 6). Volné aminokyseliny jsou vázány na trna, transportovány do ribosomu, kde trna nasedá svým antikodonem, specifickou trojicí bází na kodon na mrna. Pořadím tří bází na kodonu je dána aminokyselina, která bude na příslušném místě v syntetizovaném proteinu. Na sousední kodon nasedá další trna s aminokyselinou, mezi aminokyselinami vzniká peptidová vazba. Dále ve směru 5-3 nasedají další trna a navazují se další aminokyseliny. Transferová RNA má tvar připomínající trojlístek. Obr. č. 6: Schéma translace
Genetický kód Kód je tripletový, pořadí tří nukleotidů určuje aminokyselinu. Trojice nukleotidů se nazývá kodon, ze tří různých bází v kodonu je možné sestavit celkem 64 kombinací. Kód je univerzální, tzn. že jeden kodon kóduje stejnou aminokyselinu u všech organismů. Toto pravidlo platí pro velkou většinu kodonů, u některých organismů mají některé kodony odlišný smysl. Kód je degenerovaný (redundantní, nadbytečný), jedna aminokyselina může být determinována více kodony. Protože jednotlivé kodony v molekule nukleové kyseliny následují bezprostředně za sebou, je kód bez mezer a nepřekrývající se. 1. báze 2. báze U C A G 3. báze U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser term. term A Leu Ser term. Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met, inic. Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Gen Gen je definován jako úsek DNA, která má specifickou funkci v buňce a v celém organismu, tzn. že musí být schopen utvářet dědičný znak nebo spolupracovat při utváření několika takovýchto dědičných znaků. Dále, musí být schopen vytvářet přesné vlastní kopie - přenášet svou funkci z generace na generaci. Třetí charakteristickou vlastností genu je schopnost náhle změnit svou strukturu a tím i funkci, tj. podléhat mutacím. Zmutovaný gen replikuje svou změněnou podobu. Tato vlastnost je nutnou podmínkou vzniku genetické variability a evoluce. Místo na chromozomu, na kterém je gen umístěn, se nazývá lokus. Odlišné formy téhož genu, které u různých jedinců téhož druhu alterují na jednom lokusu se nazývají alely. Uspořádání lokusů je pro druh konstantní. Geny lze v zásadě rozlišit na geny strukturní, geny pro funkční RNA a na regulační oblasti.
1) Strukturní gen je úsek DNA, který je přepisován do primární struktury polypeptidu: Strukturní gen - transkripce - mrna - translace - polypeptid. 2) Gen pro funkční RNA je úsek DNA, který je přepisován do trna, rrna nebo jiného typu RNA, avšak neprobíhá podle něj translace. 3) Gen jako regulační oblast je úsek DNA, identifikovaný specifickým proteinem, který zahajuje nebo zastavuje transkripci. Podle regulační oblasti se tedy netvoří žádný produkt, ani RNA, ani polypeptid. Struktura genomu U eukaryot je DNA přítomna v jádře buňky v chromozomech, v mitochondriích v živočišných buňkách a v chloroplastech v buňkách rostlinných. Mimojaderné geny však hrají v eukaryontní buňce významnou roli, u rostlin probíhá v chloroplastech fotosyntéza, u živočichů v mitochondriích oxidázový cyklus. Jadernou DNA eukaryot členíme následovně: Jaderná DNA DNA kódující proteiny DNA kódující trna nekódující DNA rrna a některé histony DNA v jedné kopii repetitivní DNA Tandemová opakování rozptýlené repetice SINE LINE mikrosatelity minisatelity telomerové satelitní repetice repetice
Haploidní savčí genom má délku přibližně 3 x 10 9 bází. Z toho DNA kódující proteiny představuje 5-10 %. Celkový počet všech genů u člověka se odhaduje na cca 30 000. Repetitivní sekvence tvoří přibližně 30% nekódující DNA, jsou v genomu přítomné ve velkém počtu kopií. Genové manipulace Oblast molekukární biologie označovaná jako genové manipulace, genetické inženýrství nebo genové technologie zahrnuje techniky, které umožňují pomocí záměrného zavedení sekvencí nukleotidů a laboratorní manipulace přípravu nových kombinací genetického materiálu. Stejně jako celá molekulární genetika prodělává genové inženýrství rychlý rozvoj. Restrikční endonukleázy, nazývané stručně restriktázy, jsou enzymy štěpící nukleové kyseliny mezi dvěma sousedícími nukleotidy. Bakterie je produkují jako obranu proti cizí DNA. Endonukleázy rozeznávají cílové místo většinou 4-6 nukleotidů. Při manipulacích se používají restrikční endonukleázy třídy II, zejména ty, které štěpí fosfodiesterovou vazbu v místě, kde je sekvence nukleotidů palindromická: HpaI: 5 - G T T A A C - 3 3 - C A A T T G - 5 5 - G T T - 3 5 - A A C - 3 3 - C A A - 5 3 - T T G - 5 Název enzymu je odvozen od bakterie, která jej produkuje, římská číslice označuje pořadí. V tomto případě restriktáza HpaI byla izolována z Haemophilus parainfluenzae. Technologie rekombinantní DNA: jedná se vlastně o záměrné spojení fragmentů DNA různého původu prováděné in vitro (obr. č. 7). Enzymaticky vystřižený úsek genomové DNA má komplementární konce k vektoru, který byl rozpojen působením stejné restrikční endonukleázy: BamHI BamHI 5 - ATGCAG GATCCAATCGTACG GATCCAAT - 3 3 - TACGTCCTAG GTTAGCATGCCTAG GTTA - 5 vektor genomová DNA
Působením enzymu ligázy dojde ke spojení komplementárních bazí a k zapojení cizí DNA - inzertu - do vektoru. Jako vektor jsou označovány molekuly nukleových kyselin, které při klonování slouží jako nositelé cizí DNA. Plní při klonování úlohu samostatné jednotky, která může být ve vhodné hostitelské buňce replikována, spolu s ním je replikován i včleněný inzert. Namnožený inzert může být z vektoru vystřižen a izolován k dalšímu studiu. Je-li inzertem celý gen, včlenění inzertu do plazmidu umožňuje dosáhnout jeho přenos do jiného druhu, zapojení do hostitelského genomu a poté exprimaci, tj. transkripci a translaci. Podmínkou je, aby obsahoval celý gen bez intronů, které bakteriální buňka neumí vystřihnout. Proto se do vektoru přenáší komplementární DNA (cdna) získaná zpětným přepisem posttranskripčně upravené (maturované) mrna do DNA. Tímto postupem je v současné době možné připravit řadu tzv. rekombinantních proteinů, např. některé enzymy používané v molekulární biologii, inzulin používaný k léčení cukrovky, chymosin atd. Obr. č. 7: Vznik rekombinantní DNA genomová DNA 5 - ATGCAG GATCC.G GATCCAAT -3 3 - TACGTCCTAG G.CCTAG GTTA - 5 restrikční místo pro Bam HI vektor (plasmid) GATCC G. G.CCTAG
rekombinantní DNA Genové knihovny: schopnost fágových vektorů pojmout velké inzerty umožnila přípravu genových knihoven (genových bank). Jedná se o soubor klonovaných fragmentů DNA, které reprezentují celý genom (obr. č. 8). Obr. č. 8: Příprava genomových knihoven Klony mohou být identifikovány a selektovány s cílem vybrat takový, který obsahuje určitý fragment včleněné genomové DNA, např. úsek určitého genu nebo celý gen. Ten je poté možné namnožit, dále studovat popř. přenést do jiného organismu a tam exprimovat. Kratší úseky genomu do délky cca několik kbp je možné namnožit (amplifikovat) in vitro postupem nazývaným polymerázová řetězová reakce PCR (obr. č. 9).
Obr. č. 9: Schéma PCR Sekvenování je nejpřesnějším, avšak pracovně nejnáročnějším a nejdražším způsobem studia DNA, při kterém se určuje přesné pořadí bází v určitém úseku DNA. Nejčastěji se používá Sangerova metoda. Projekt sekvenování lidského genomu, dokončený před několika lety, umožňuje další detailnější studium lidského genomu, identifikaci a lokalizaci důležitých genů a aplikaci nových poznatků v diagnostice a terapii závažných dědičně podmíněných onemocnění. Mapování genomu: Cílem při mapování je rozšíření základních poznatků o organizaci a regulaci genů. Významným objektem zájmu jsou lokusy zodpovědné za vznik dědičně podmíněných chorob. Genetická mapa je znázorněním distribuce genetických markerů v genomu. Markerové lokusy slouží jako kotevní místa, pomocí nichž je možné jednotlivé chromozomy popsat a lokalizovat přesněji jiné např. kódující lokusy. Takto připravené mapy se označují jako fyzické. Vazbové mapy vycházejí z frekvence proběhlých crossing-owerů mezi geny, vzdálenosti mezi nimi jsou udávány v centimorganech, 1 cm = 1 % rekombinací. V genetické literatuře jsou publikovány stále podrobnější, více vysycené genetické mapy, kde jsou lokalizovány jednotlivé kódující a nekódující lokusy.
Kontrolní otázky: 1/ Popište stručně DNA a RNA 2/ Jaké znáte purinové a pyrimidinové báze, jaká je jejich vzájemná komplementarita 3/ Popište replikaci DNA 4/ Popište transkripci RNA 5/ Co je splicing 6/ Popište translaci 7/ Jaké jsou základní vlastnosti genetického kódu? 8/ Uveďte základní charakteristiku genu a typy genů 10/ Popište strukturu genomu