Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Diplomová práce 2008 Bc. Aneta Šedrlová
Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů Hmyzí biopesticidy Diplomová práce Autor: Bc. Aneta Šedrlová Vedoucí práce: RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.
Prohlašuji, že jsem pracovala samostatně na základě pokynů a rad vedoucího DP, s využitím zázemí pracoviště a laboratoře a veškeré použité zdroje informací jsou v práci řádně citovány. Obrazové materiály (fotografie) použité v experimentální části, které jsem zhotovila, jsou uvedeny bez citací.
Ráda bych poděkovala vedoucímu DP RNDr. P. Hyršlovi, Ph. D. za ochotnou pomoc a přátelskou radu při zpracování této práce. Dále Mgr. Vladimíru Půžovi a RNDr. Zdeňku Mráčkovi, DrCs z AVČR, v.v.i. v Českých Budějovicích za ochotnou spolupráci při determinaci entomopatogenních hlístovek a všem kolegům, kteří mi ochotně poskytli vzorky půdy.
Obsah 1. SOUHRN... 6 2. ABSTRACT... 7 3. ÚVOD... 8 4. CÍL PRÁCE... 10 5. BIOLOGICKÁ KONTROLA... 11 5.1. VÝHODY BIOLOGICKÉ KONTROLY PRO SPOTŘEBITELE:... 12 5.2. DRUHY BIOLOGICKÉ OCHRANY... 13 5.2.1. Klasická biologická ochrana... 13 5.2.2. Augmentativní biologická ochrana... 14 5.3. HISTORIE BIOLOGICKÉ OCHRANY... 15 5.4. INTEGROVANÁ OCHRANA PROTI ŠKŮDCŮM... 16 5.4.1. Co je IPM? (Integrated Pest Management)... 16 5.4.2. Proč potřebujeme IPM?... 17 5.5. CHYBY A NEDOROZUMNĚNÍ O BIOLOGICKÉ OCHRANĚ... 18 5.6. HMYZÍ REZISTENCE A JEJÍ MANAGEMENT... 20 5.7. HOSTITELSKÁ SPECIFICITA BIOINSEKTICIDŮ KE ŠKŮDCŮM... 22 6. PŘEHLED HMYZÍCH BIOPESTICIDŮ... 23 6.1. ÚVOD... 23 6.2. ENTOMOPATOGENNÍ VIRY... 25 6.2.1. Cíloví škůdci... 26 6.2.2. Mechanismus působení... 26 6.2.3. Symptomy... 26 6.2.4. Relativní účinnost... 27 6.3. ENTOMOPATOGENNÍ BAKTERIE... 31 6.3.1. Cíloví škůdci... 31 6.3.2. Mechanismus působení... 32 6.3.3. Symptomy... 33 6.3.4. Relativní účinnost... 33 6.3.5. Bacillus popilliae a Bacillus lentimorbus... 34 6.3.6. Používání Bt insekticidů... 36 6.4. ENTOMOPATOGENNÍ HOUBY... 37 6.4.1. Cíloví škůdci... 38 6.4.2. Mechanismus působení... 38 6.4.3. Symptomy... 39 6.4.4. Relativní účinnost... 39 6.4.5. Charakteristické rysy některých druhů... 41 6.5. ENTOMOPATOGENNÍ HLÍSTOVKY (EPN)... 44 6.5.1. Cíloví škůdci... 45 6.5.2. Životní cyklus a mechanismus účinku... 45 6.5.3. Relativní účinnost... 47 4
6.5.4. Charakteristické rysy jednotlivých druhů... 48 6.5.5. Citlivost na pesticidy... 49 6.6. PRVOCI A MICROSPORIDIA... 50 6.6.1. Mechanismus působení... 50 6.6.2. Symptomy... 50 6.6.3. Charakteristické rysy jednotlivých druhů... 50 6.7. KOMBINOVANÉ ALTERNATIVNÍ PROSTŘEDKY... 51 7. FIRMY A JEJICH PRODUKTY NA DNEŠNÍM TRHU... 52 7.1. ÚVOD... 52 7.2. ANDERMATT BIOCONTROL AG... 54 7.3. E-NEMA... 55 7.3.1. Okrasné a užitkové rostliny na poli... 55 7.3.2. Okrasné a užitkové rostliny ve sklenících... 55 7.3.3. Houbová kultivace... 56 7.4. BECKER UNDERWOOD... 57 7.5. KOPPERT... 58 8. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST:... 60 8.1. ÚVOD... 61 8.2. MATERIÁL A METODY... 62 8.2.1. Živočišný materiál... 62 8.2.2. Stručná charakteristika... 62 8.2.3. Význam EPN... 62 8.2.4. Způsob nákazy... 63 8.2.5. Odběry půdních vzorků... 65 8.2.6. Laboratorní zpracování... 66 8.2.7. Determinace invazních larev... 67 9. VYHODNOCENÍ... 68 9.1. DISKUSE A ZÁVĚR... 70 10. FOTODOKUMENTACE K EXPERIMENTÁLNÍ ČÁSTI... 74 11. ZÁVĚR PRÁCE... 84 12. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY A ELEKTRONICKÝCH ZDROJŮ... 85 5
1. Souhrn Hmyzí biopesticidy jsou velmi aktuální a komerční záležitostí v oblasti ochrany plodin proti hmyzím škůdcům na celém světě. Mezi hmyzí insekticidy zahrnujeme biologické kontrolní činitele jako jsou např. entomopatogenní bakterie (Bacillus thuringiensis), viry (polyhedroviry, bakuloviry), houby (Bauwessia spp., Metarhysium spp.), entomopatogenní hlístovky (Steinernematidae, Heterorhabditidae) a prvoky (Microsporidia, Nosema locustae). Biologické insekticidy jsou výjimečné některými svými vlastnostmi, kterými nezatěžují životní prostředí, ve srovnání s chemickými dosud hojně používanými preparáty, protože se v prostředí vyskytují přirozeně. Mezi výhody spojené s jejich používáním patří: jsou šetrné k životnímu prostředí (nezanechávají rezidua jako chemické insekticidy), jsou bezpečné k necílovým organismům a pro člověka, jejich aplikace je jednoduchá, cena je srovnatelná s chemickými preparáty, jsou v prostředí stálé a nezpůsobují rezistenci škůdců. Velkého významu nabyly výjimečným mechanismem účinku, který je pro každou kategorii bioinsekticidů odlišný. Entomopatogenní bakterie a viry produkují po proniknutí do hostitele toxiny, které způsobují septicaemii. Entomopatogenní houby produkují spory, které klíčí a prorůstají tělem hostitele, čímž ho usmrtí a entomopatogenní hlístovky společně se svými symbiotickými bakteriemi (Xenorhabdus, Photorhabdus) rozkládají vnitřnosti hostitele a množí se v něm. Význam hmyzích biopesticidů je obrovský, ale jejich využívání v praxi potřebuje ještě některá zdokonalení. Důležité je získat si také důvěru spotřebitelů a pěstitelů, aby stále více docházelo k omezování používání jedovatých chemických preparátů. Na teoretickou část navazuje část experimentální, ve které jsem si vyzkoušela metodiku izolace entomopatogenních hlístovek z náhodně odebraných vzorků půdy. 6
2. Abstract Biopesticides are very actual and commercial matter in save area products against insect pest in the whole world. Among insecticides include biological control agent's as are e.g. entomopathogenic bacteria (Bacillus thuringiensis), viruses (polyhedroviruses, baculoviruses), fungi (Bauwessia spp., Metarhysium spp.), entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae) and protozoans (Microsporidia, Nosema locustae). Biological insecticides are rare some by features that the no burden environment, in comparison with chemical preparations till this time plentifully used, because it occur in environment naturally. Among benefits pair with their using belongs to: they are thrifty to environment (don't leave residue like chemical insecticides), be safe to non targed organisms and to humans, their application is simple, price is comparable with chemical preparations, they are in environment stable and don't cause resistance of insect. Big importance obtain rare mechanism effect, that is for any caregory of bioinsecticides different. Entomopathogenic bacteria and viruses produce toxins after penetration into host, that the induce septicaemia. Entomopathogenic fungi produce spats that the conidias and intergrow body host, whereby kills him and entomopathogenic nematodes together with symbiotic bacteria (Xenorhabdus, Photorhabdus) gesticulate guts host and multiply there. Meaning of biobiocides is enormous, but their exploitation practically needs yet some improvement. Important is also gain confidence consumers and growers, to more and more happened to restraint using poisonous chemical preparations. On theoretic part tie together experimental part, in which I auditioned methods of isolation entomopathogenic nematodes from accidentally sample soil. 7
3. Úvod Bezpečnostní zájmy o zdraví veřejnosti a o dopadu chemických pesticidů na životní prostředí vedly k uznání biologického boje jako přirozeného přístupu k udržení zdravotní nezávadnosti plodin. Navzdory těmto bezpečnostním zájmům a velkému výzkumnému úsilí o komercializaci biokontroly byl vývoj velmi pomalý. Hybnost chemického průmyslu je obtížné změnit a fermentační procesy pro výrobu biopesticidů jsou dražší než syntetické chemické procesy. Nicméně existuje požadavek na produkty biologické kontroly, zvláště ve specializovaných oblastech zemědělského trhu, kde neexistuje žádný chemický konkurent. Nicméně, tato poptávka na trhu postrádá základní metody úsporné (ekonomické) velkovýroby a aplikace biologických regulačních médií. Komerční biopesticidy musí být ekonomicky produktivní, mít trvalou stabilitu při skladování, musí mít adekvátní trvanlivost při polní aplikaci, musí být snadno ovladatelné, musí se snadno namíchat, použít a poskytnout konzistentně efektivní kontrolu nad cílovým škůdcem nebo skupinami škodlivého hmyzu. Koneční cíl výzkumu a vývoje prostředků biologické kontroly je dosažení biotechnologií potřebných k produkci biologických prostředků, které budou efektivně konkurovat chemikáliím. Prozatím je tržní úspěch nejpravděpodobnější v případě kdy je biologický prostředek vyvinutý pro boj proti problémovým škůdcům, který neměl žádné řešení pomocí chemických pesticidů nebo v situacích, kde je aplikace pesticidů zakázaná. Úspěšná komercializace záleží na výsledku výzkumného procesu a je často omezená nedostatkem znalostí a zkušeností s produkcí prostředku biologické kontroly a formulací technik. Ve výzkumné fázi jsou první kroky vedeny k extrakci a identifikaci mikroorganismů, které jsou hospodářsky vyprodukovatelné, ty, kteří agresivně potlačují cílové populace škůdců a ty co nepoškozují plodiny nebo necílové organismy. V dalších krocích musí být vyvinuty mikrobiální kultivace a formulace techniky tak, aby minimalizovaly cenu produktu a maximalizovaly výnos a kvalitu. Faktory kvality zahrnují účinnost kontroly škodlivého hmyzu, stabilitu při sušení a skladování, hostitelskou kompatibilitu a adekvátní trvalost při aplikaci na pole. Jakmile jsou technologie ve fázi ekonomicky efektivní produkce mikrobiálních hubících prostředků, pak následují finální kroky jako je aplikace a registrace. A poté již můžeme sledovat povolení prodeje nového mikrobiálního hubícího prostředku. Budoucnost mikrobiálních biologických regulačních médií je jasně závislá na technologickém vzestupu a tržních příležitostech. Komerční zájem a přijetí uživatelů 8
biologických kontrolních médií jako nástroje pro kontrolu škůdců jsou závislé na vývoji levných, stabilních produktů, které poskytnou shodnou účinnost. Řešení klíčových technických problémů a implementace optimalizačních a návrhových strategií budou vyžadovat výzkumné příspěvky různorodých disciplín včetně rostlinné patologie, fytopatologie, entomologie, hmyzí patologie, mikrobiologie, biochemického inženýrství a biochemie. Biologická kontrola byla jako jedna z metod pest managementu zařazena do systémových metod působících proti prevenci a redukci škůdců, nemocí a plevelů. Rolníci před každoročním sázení plodin promýšlí jaké plodiny a kam vysází a pro ochranu těchto plodin volí často tři základní formy kontroly škůdců: střídání plodin, sadbu plodin vůči škůdcům rezistentních a biologickou kontrolu. Po roce 1945 byly všechny tyto tři typy základní kontroly zahrnuty do chemické kontroly, která byla v té době na svém vrcholu. Následkem toho došlo ke značné redukci experimentálního vývoje biologické kontroly a k úplné změně myšlení o prevenci škůdců v zemědělství. Dále nebyly rostliny vybírány podle odolnosti, ale podle masové produkce nebo podle okrasných vlastností a jejich kontrola tedy probíhala pouze pomocí pesticidů. To celosvětově vedlo k vytvoření rostlin, které nebyly schopné se ujmout bez pravidelné aplikace pesticidů a vznikaly tak agro-systémů s velmi zdevastovanými populacemi přirozeně se vyskytujících nepřátel. Abychom se jakoby vrátili do doby před používáním chemických pesticidů, kdy se přirozeně vyskytovali nepřátelé škůdců a kdy se pěstovaly rostliny s vyšší odolností vůči hmyzu a to bez podpory růstu chemickými pesticidy, potřebujeme značně investovat do vývoje nových kultivarů s rezistencí nebo odolností vůči škůdcům a nemocem. Podobně jako to udělali v jiných zemích. Aplikace těchto nových systémových metod není zcela jednoduchá pokud se jedná o pozemek, na kterém již dříve byla použitá jakákoli forma chemické kontroly. Není možné prostě vyměnit jeden hubící prostředek za jiný alternativní prostředek. Cílem je vytvořit systém, který je jednoznačně odolný vůči škůdcům, a proto není možné dále používat jiné konvenční metody kontroly. V zemědělských systémech pak může být minimalizováno znečištění životního prostředí jako je znečištění půdy a vody. Zároveň bude mít integrované zemědělství vliv na různé dopady ekosystémů (ochrana flóry a fauny, kvalitu a diverzitu krajiny a udržování energií a neobnovitelných zdrojů) stejně jako sociální ohledy (zaměstnání, veřejné zdraví) na rozdíl od současného zemědělství (Vereijken et al., 1986; Wijnands & Kroonen-Backbier, 1993). 9
4. Cíl práce Cílem této Diplomové práce je zpracování literární rešerše na zadané téma: Hmyzí bioinsekticidy. Zmínit některé problémy, které jsou spojené s používáním biopesticidů a přispět k lepší informovanosti veřejnosti v oblasti použití biologických alternativních metod, prosazovat výhody spojené s jejich použitím, pomoci lépe pochopit, jak tyto bioinsekticidy pracují a proti kterým škůdcům je vhodné je použít a seznámit se současnou nabídkou produktů, obsahujících mikrobiální činitele, na trhu. Základní rozdělení je na dvě části: teoretickou část poskytující souhrn informací o hmyzích bioinsekticidech a praktickou část, ve které jsem si vyzkoušela metodiku izolace entomopatogenních hlístovek z půdních vzorků. Teoretická část : je složena z kapitol pojednávajících o jednotlivých skupinách biopesticidů viry, bakterie, houby, entomopatogenní hlístovky (EPN) aj.- součástí je stručný přehled firem a jejich produktů, obsahujících tyto insekticidní činitele, na trhu. Praktická část: Vyzkoušela jsem metodiku izolace EPN z půdních vzorků sebraných z různých lokalit ČR. Jako hostitelský organismus byly použity larvy Galleria mellonella,které byly po infekci EPN umístěny dále z tzv. galleriové pasti na tzv. vodní past, kde došlo k uvolnění izolovaných infekčních juvenilních stadií (IJ). Jejich druhová determinace byla prováděna ve spolupráci s Etomologickým ústavem AVČR, v.v.i. 10
5. Biologická kontrola Použití určitého druhu organismu k redukci hustoty populace jiného cílového organismu, je nejúspěšnější, cenově nejpříznivější a environmentálně nejbezpečnější způsob likvidace škodlivého hmyzu. Je to nejpřirozenější způsob jak udržet množství škodlivých organismů na co nejnižší úrovni. Určitá forma biologické kontroly je přítomná ve všech ekosystémech, přirozených i uměle vytvořených, a je vždy aktivní. Přirozená biologická kontrola snižující hustotu populací škodlivých organismů byla přítomna již u evolučně prvních ekosystémů (asi před 500mil. let se uskutečňovala bez jakýchkoli zásahů člověka). K přirozeným formám biologické kontroly člověk přispěl až kolem roku 300, tím, že použil dravé mravence (Arthropoda) pro kontrolu nad škodlivým hmyzem citrusů. K rozsáhlému využívání biologické kontroly došlo kolem roku 1888 a to použitím rodu Rodolia, Slunéčkovití (Coccinellidae, Coleoptera) pro kontrolu červců škodících opět na citrusech. Využití biologické kontroly přináší velké finanční zisky, díky tomu, že biologická ochrana je perzistentní na rozdíl od chemických preparátů, kde se může vyvinout rezistence hmyzu vůči těmto chemickým látkám. S ohledem na fakta blízké budoucnosti: 1. Země bude v blízké budoucnosti živit asi 11 miliard lidí, 2. dojde k vyčerpání fosilních zdrojů a 3. další používání tradičních syntetických pesticidů povede ke znečištění okolního prostředí. Již z těchto důvodů není dále možné stejným způsobem, jak tomu bylo v uplynulých 100 letech, znečišťovat životní prostředí a tím i redukovat přirozenou biodiverzitu. A je tedy nutné přesměrovat další výzkum kontroly na jiné systémové metody. Již z těchto důvodů se téma biologické kontroly stane hlavním a ne okrajovou záležitostí jak tomu bylo posledních 60. letech. Moderní pest management bude naprosto závislý na použití vhodné biologické kontroly, protože je nejtrvalejší, nejlevnější a nejbezpečnější metodou pro životní prostředí. Dále má důležité výhody pro spotřebitele. Předpokládá se, že biologická kontrola bude kolem roku 2050 tvořit 35 40% metod ochrany plodin. Definice škůdce: (podle Mezinárodního biologického programu) Biologický škůdce je organismus (rostlina, živočich nebo prvok) vyskytující se v takových množstvích, která způsobují poškození plodin. 11
Fakta: Biologická ochrana je stálá ve všech světových ekosystémech a to na 55,5 miliardách hektarů. Většina potenciálních hmyzích škůdců (95%, což činní 100 000 druhů členovců) jsou dnes již ošetřeny metodami biokontroly. Klasické metody biokontroly jsou již aplikovány na 350 milionech hektarů, což činní 10% plochy Země, která je osázená plodinami. A poskytuje velmi vysoké procento ušetřených financí oproti použití chemické varianty. 5.1. Výhody biologické kontroly pro spotřebitele: Proč spotřebitelé využívají biologickou kontrolu? Nulové vystavení spotřebitelů škodlivým účinkům chemických pesticidů. Žádná rezidua produktů v prostředí. Žádný fytotoxický účinek na mladé sazenice, a žádný předčasný úhyn rostlin nebo plodů ovoce. Díky aplikaci biologické kontroly dochází často ke zvýšení výnosu. Likvidace škůdců ve vlhkých a teplých sklenících je mnohem rychlejší. Použití biologických postřiků ve skleníku je bezpečnější než aplikace chemických látek. Biologická kontrola je spolehlivá po dobu několika měsíců a jsou nutné pouze občasné kontroly případného nového výskytu škůdců, kdežto chemická kontrola vyžaduje permanentní kontroly. Chemická kontrola některých druhů škůdců polních plodin je obtížná nebo nemožná, protože se vytváří rezistence škůdců na chemickou látku. U biologické kontroly není nutná bezpečnostní perioda mezi aplikací a sklizní plodin, proto je sklizeň možná kdykoli je vhodná pro pěstitele. Biologická ochrana je permanentní. Biologická kontrola je hodnocena širokou veřejností a to z důvodů rychlejšího prodeje úrody vyprodukované pod biologickou ochranou a nižší cenou plodin na trhu (ušetření za chemické pesticidy). 12
Výrobci dále dodávají další důležité výhody: Nízké riziko zamoření potravin, vody a životního prostředí chemikáliemi. Příspěvek k vhodné produkci potravin. Příspěvek k ochraně nebo dokonce zlepšení biologické diverzity. Žádná rezidua pesticidů v potravě. 5.2. Druhy biologické ochrany Z různých zdrojů je možné najít mnoho definic druhů biologické ochrany. Rozlišujeme: - klasickou biologickou ochranu. - augmentativní biologickou ochranu. 5.2.1. Klasická biologická ochrana Klasická biologická ochrana používá přirozených nepřátel, kdy obvykle oba škůdce i přirozený nepřítel pochází z nepůvodních zemí. Klasická biologická ochrana může často být sumarizována tímto způsobem: 1. Jakmile škodlivý organismus napadne novou oblast, bude jeho populace růst do té doby než obsadí všechny zdroje škůdců. 2. Jakmile jsou uvolněni přirození nepřátelé, trvá asi 10 15 generací než začne docházet k redukci populací škůdců. 3. Populace škůdců jsou poté redukovány na velmi nízké úrovně, obvykle o 4 8 řádů nižší než před uvolněním nepřítele. Úroveň této kontroly zatím nebyla jinou metodou překonána. 4. Kontrola je permanentní, škůdce i nepřítel stále společně přežívají ve velmi nízkých hustotách, aniž by došlo k jejich vymizení nebo naopak přemnožení. 13
5.2.2. Augmentativní biologická ochrana Augmentativní biologická ochrana používá přirozených nepřátel v sezónních dávkách. Augmentativní biologická ochrana využívá k potlačení škůdců během sezóny nebo během růstového cyklu plodin jednu nebo několik aplikací přirozených nepřátel do prostředí (Obr. 1). Často jsou augmentativní (zvýšené) aplikace výsledkem neúspěšného nebo jen částečně úspěšného úsilí o permanentní ujmutí přirozených nepřátel, což je náplní biologických kontrolních programů (Smith a Armitage, 1931; Flandry, 1949). Jedná se o situace, kdy augmentativní uvolnění nepřátel doplňuje již ustavený komplex nepřátel, a to v kritických obdobích, kdy místní populace nepřátel nejsou schopné populace škůdců zlikvidovat sami. Augmentativní biologická ochrana tady zavádí jakýsi podpůrný systém pro již zavedené kontrolní systémy, tím, že periodicky uvolňuje nepřátele škůdců. Augmentativní biologická kontrola je strategie, která zajišťuje trvalost kontrolních metod proti škůdcům (Rabb et al., 1976; Flint a van den Bosch, 1981; Haney et al., 1992; Trumble a Morse, 1993; Luck et al., 1997; van Lenteren, 2000). Obr. 1: Možný způsob aplikace. Zdroj: URL 1 14
5.3. Historie biologické ochrany Historie biologické ochrany v Evropě (Greathead, 1976). První praktická demonstrace biologické ochrany byla provedena ve Francii v roce 1840: M. Boisgiraud použil střevlíka (Calosoma sycophanta) proti škůdci bekyni velkohlavé (Lymantria dispar (L.)) škodících na topolech. První neúspěšným pokusem o kolonizaci přirozeného nepřítele v Evropě byl import roztoče Rhizoglyphus phylloxerae (Riley & Planchon) v roce 1873 pro kontrolu nad révokazem Viteus vitifolii (Fitch). K rozsáhlému využívání biologické kontroly došlo kolem roku 1888 a to použitím rodu Rodolia, Slunéčkovití (Coccinellidae, Coleoptera) pro kontrolu červců škodících na citrusech. První úspěch v použití nepůvodních organismů se datuje od 1897, kdy byl z Portugalska importován brouk Rodolia cardinalis (Mulsant) působící proti Icerya purchasi (Mask) škodící na bavlně. Tento úspěch v Evropě silně stimuloval zájem o klasickou biologickou ochranu. Neúspěch programu na ochranu brambor proti mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata) probíhající v letech 1926 1944 snížil opět zájem o biologickou kontrolu na nižší úroveň. Klasická biologická ochrana byla v Evropě poměrně neúspěšná. V té době byl důvodem nedostatečný import vhodných druhů parazitů. Výjimkou z mnohých selhání při používání nepůvodních nepřátel proti nepůvodním škůdcům bylo použití parazita Encarsia formosa (Gahan) pro kontrolu nad Trialeurodes vaporariorum (Westwood) ve sklenících (Speyer, 1927). Tento parazit je komerčně užíván ve velkém měřítku a tvoří hlavní téma v integrované ochraně proti hmyzím škůdcům (IPM), v programech pro biokontrolu ve sklenících (van Lenteren & Woets, 1988). Použití přirozených nepřátel pro biologickou ochranu během první poloviny 20. století shrnul Sachtleben (1941). Greathead (1976) aktualizoval. Po této aktualizaci bylo vybráno několik přirozených, domorodých druhů pro biologickou ochranu a ty jsou dodnes komerčně používány (van Lenteren et al., 1987; van Lenteren, 2003). Zájem o biologickou ochranu se kolem roku 1940 s objevením chemických pesticidů snížil. Ale pozdější rozvoj perzistence škůdců a projevy nechtěných účinků chemických látek znovu oživily zájem o biologickou ochranu, což vedlo ke vzniku Mezinárodní organizace pro biologickou ochranu (IOBC) v roce 1955. Evropská sekce této společnosti se stala hnací silou za změnu myšlení v problematice ochrany rostlin (van Lenteren et al., 1992; www.iobc- WPRS.org). 15
5.4. Integrovaná ochrana proti škůdcům Ačkoli je biologická ochrana první preferovaná metoda v hubení škůdců, často není možné udržet všechny druhy škodlivého hmyzu, nemoci a plevele pod únosnou hranicí pouze pomocí biologické kontroly. Z tohoto důvodu je potřeba používat společně i jiné typy metod redukujících výskyt škůdců. Dnes existuje mnoho možností jak integrovat další vhodné redukující metody společně s biologickou kontrolou. 5.4.1. Co je IPM? (Integrated Pest Management) Integrovaná ochrana proti škůdcům je trvalý, environmentálně a ekonomicky vhodný systém, který předchází poškozením způsobeným škodlivým hmyzem, nemocemi a plevely, použitím přirozených faktorů, které omezují přírůstek populací škodlivých organismů. Pokud je potřeba, pak je kombinována s jinými vhodnými opatřeními (van Lenteren, 1993) (Obr. 2, 3). Potravinová a zemědělská organizace (FAO- The Food and Agricultural Organization) vytvořila následující definici: Systém ochrany proti škůdcům, který využívá všechny metody schopné vhodným způsobem redukovat populace škůdců a udržovat hustotu jejich populací na nízkých úrovních, které nezpůsobují ekonomické problémy (Smith a Reynolds, 1966). Program IPM dosáhl největších úspěchů v roce 1950 jako rozumný přístup poskytující dlouhodobé řešení problémů se škůdci (Wearing, 1988), ale přijetí nové metody mezi spotřebiteli bylo v té době velmi nízké. Obr. 2, 3: Aplikace pomocných opatření lepkavá tabulka Zdroj: URL 2 Zdroj: URL 3 16
5.4.2. Proč potřebujeme IPM? Pro boj proti hmyzím škůdcům, nemocem a plevelům se používá asi 800 různých chemických přípravků. Insekticidy tvoří nejnebezpečnější kategorii pesticidů, protože na rozdíl od fungicidů nebo herbicidů, zabíjí všechny živé organismy. Většina insekticidů je charakteristická tím, že má široké spektrum aktivity s velmi dobře známými riziky pro výrobce, spotřebitele a hlavně pro okolní prostředí. Některé herbicidy i fungicidy mají stejně stinné stránky. Hlavním problémem současného chemického průmyslu je vývoj perzistence škůdců na chemické pesticidy. Exponenciální vzrůst rezistence hmyzu vede k závažným problémům působícím na lidi (př.: malárie, nelze vyhubit hmyzího přenašeče tohoto onemocnění) nebo dochází ke snižování výnosů plodin. Mimo to je vývoj nových pesticidů stále více obtížnější. Nové pesticidy musí uspět ve velmi přísných testech než budou legislativně povoleny, což zvyšuje celkové výrobní náklady. Chemické hubení škůdců mělo za následek vývoj perzistence u více než 500 druhů hmyzu. Téměř bez výjimky pokusy o vyhubení škůdců selhaly. Škodlivý hmyz přežil veškeré chemické taktiky, které byly nově vymyšleny. Tabulka1. Metody jak předejít nebo redukovat vývoj škodlivého hmyzu (van Lenteren, 1993) Prevence: * předejít zavlečení nových druhů škodlivého hmyzu (kontroly a karantény) * pracovat s čistým semenem a rostlinným materiálem (tepelná dezinfekce) * pracovat s půdou neobsahující škůdce (parní sterilizace a solarizace) * předejít introdukci ze sousedních plodin Redukce: * použít ochranu kultur (střídání plodin) * použit sazenice, které jsou (částečně) odolné proti škodlivému hmyzu * použít jednu z následujících kontrolních metod: - mechanická ochrana (mechanické ničení škodlivých organismů) - fyzikální ochrana (teplo) - ochrana atraktanty, repelenty - ochrana feromony - ochrana hormony - genová ochrana - biologická ochrana (přirození nepřátelé a antagonisté) - (výběrový) chemický boj Ochrana založený na sběru a postřiku. Ochrana založený na integraci metod, které způsobí nejmenší porušení ekosystémů: integrovaná ochrana Technicky není realizace IPM příliš odlišná od chemické kontroly. Při první aplikaci by měla být pozornost zaměřená hlavně na důkladné rozšíření po ploše. IPM metody jsou 17
metody nové a požadují také nový přístup ze strany spotřebitelů. Princip: vnášet přirozené nepřátele do prostředí s výskytem škůdců pouze pokud je tento škůdce přítomen. Velkým omylem je názor, že je lepší aplikovat prostředky vždy a v nadbytečných množstvích. A pouze jestli se bude tato metoda zdát lepší než konvenční metody, pak bude i snáze přijata mezi uživateli. Kombinace nejrůznějších taktik v metodách IPM s cílem redukovat nebo odstranit negativní vedlejší účinky chemické kontroly je nerealističtější formou řešení těchto problémů. Za účelem zlepšit stav životního prostředí začínají vědci vyvíjet empirické programy integrované ochrany plodin, které později bude možné používat v integrovaném zemědělství. Takový postup povede ke snížení obsahu pesticidů v prostředí (Wijnands et al., 1993). 5.5. Chyby a nedorozumnění o biologické ochraně (van Lenteren, 1992) 1. Biologická ochrana vytváří nové druhy škodlivého hmyzu Použití biologické ochrany proti jednomu specifickému druhu škůdce vede ke vzniku nových druhů škůdců, a to z důvodu omezení postřikování pesticidy se širokým spektrem. Tato kritika je většinou nesprávná a skutečnost je pravým opakem: aplikace chemické kontroly má za následek vývoj nových druhů škodlivého hmyzu. Výzkum biologické ochrany začal za účelem kontroly druhů škodlivého hmyzu, které byly odolné vůči chemickým pesticidům. Některé druhy již není možné ovládat chemickou kontrolou, a proto je jediným řešením biologická kontrola. 2. Biologická ochrana je nespolehlivá Názor, že biologická kontrola je méně účinná než chemická vznikl následkem silného tlaku trhu, který prosazoval, že druhy se kterým je v produktech biologické ochrany obchodováno nejsou plně testovány na účinnost. Tato kritika také vznikla díky některým amatérským výrobcům, kteří nekontrolovali, zda jsou agens obsažené v jejich výrobcích účinné pouze k cílovým organismům. Nicméně, filozofií dnešních odborníků je stále obhajovat používání jen těch přirozených činitelů, kteří prokázali svou účinnost v přirozených podmínkách a v programech zaměřených na likvidaci škůdců na určitých plodinách. Některé produkty prokázaly srovnatelnou nebo dokonce lepší účinnost než chemické pesticidy. 18
3. Výzkum biologické kontroly je drahý Rozbory nákladů ukázaly, že náklady na výzkum biologické kontroly je cenově příznivější než náklady na chemický výzkum (Tisdell, 1990; van Driesche a Bellows, 1995; Neuenschwander, 2001). Důvod, proč i navzdory této cenové výhodnosti biologické kontroly není používána v jednoznačné převaze je ten, že existuje produkční a distribuční problémy s parazity a jejich nepřáteli: celá metodologie produkce přirozených nepřátel je velmi odlišná od chemické výroby pesticidů a skladovatelnost produktů obsahujících živou složku je velmi omezená na dny nebo týdny. Tím se možná myslí, že hledání přirozených nepřátel je dražší a zabere více času než syntéza nových chemikálií. Opak je však obvykle pravdou: náklady na biologickou kontrolu jsou nižší než na chemickou. A kvůli nárokům trhu je délka vývoje a kontroly nových produktů srovnatelná pro obě varianty (10 let). 4. Aplikace komerční biologické ochrany je pro uživatele drahá Důležitým podnětem používání přirozených nepřátel ve sklenících byly nižší náklady než v případě chemických pesticidů. Chemická kontrola nad molicemi byla dvakrát dražší než biologická kontrola pomocí druhu E. formosa. V dnešní době vychází analýzy finanční náročnosti velmi podobně. Biologická kontrola není rozhodně dražší než chemická. A navíc biologická kontrola je v dnešní době tak rozšířená pro běžné plodiny, že je již velmi obtížné udělat analýzu nákladů chemických pesticidů, neboť se v těchto případech používají sporadicky (Obr. 4). Měli bychom si uvědomit, že většina biologických agens je zdarma. Mnoho prospěšných druhů se vyskytuje v prostředí přirozeně a udržují populace škůdců pod ekonomickou hranicí ve všech místních a zemědělských ekosystémech celosvětově. 19
Obr. 4: Kukuřice poškozená housenkami. Zdroj: URL 4 5. Praktické použití biologické ochrany se vyvíjí velmi pomalu Také tato kritika je nesprávná. Během minulých 120 let bylo introdukováno více než 2000 druhů hmyzu pro kontrolu nad hmyzími škůdci ve 196 zemích a ostrovech a více než 150 přirozených druhů se využívá komerčně (van Lenteren et al., 2006). Přiklad rychlého vývoje biologické ochrany: identifikace a masová produkce přirozených nepřátel byla v uplynulých 40 letech tak uspěná, že v Severozápadní Evropě je dostupných více přirozených nepřátel (150 druhů) než je zaregistrováno chemických insekticidů (méně než 100). 5.6. Hmyzí rezistence a její management Vývoj hmyzí rezistence je schopnost určitého druhu hmyzu a jeho populace tolerovat dávky toxických látek, které by pro většinu jedinců populací téhož druhu byly smrtící. Insekticidní rezistence přímo a hluboce ovlivňuje znovu objevení nemocí, které jsou přenášeny hmyzem (Krogstad, 1996). Kontrola vektorů je primární a základní prostředek proti šíření nemocí jako je malárie, filarióza, japonská encefalitida nebo horečka dengue v lidské společnosti. V posledních letech je stále více jasné, že je nutné výrazně omezit používání chemických pesticidů a vyvíjet a zdokonalovat alternativní metody. Nicméně pečlivé 20
zkoumání aktuálních informací o rezistenci přenašečů nemocí ukázalo, že ani plný účinek rezistence nemá vliv na kontrolní úsilí. Základními kroky managementu rezistence je sledování výskytu rezistence. Což vede k poskytnutí základních dat pro programové plánování a výběr insekticidního prostředku před začátkem aplikace kontrolních opatření. Dále je důležitá detekce rezistence již v ranných stadiích, kdy může být aplikován včasný zásah a může být spojitě sledován. Musí být objevovány nové mikrobiální toxiny s různými strukturami a mechanismy účinku, aby došlo k minimalizaci rizik spojených s vývojem rezistence. Studie by měly být vedeny směrem k vývoji efektivní a k životnímu prostředí přátelské tzv. zelené technologii. Obrázky (5,6,7,8) ukazují některé příklady poškození rostlin způsobené hmyzem nebo jejich larvami. Obr. 5, 6: Poškození trávníku krtonožkami, poškození bobulí hroznového vína. Zdroj: URL 5 Zdroj: URL 6 Obr. 7, 8: Housenky krmící se na listech rostlin. Zdroj: URL 7 Zdroj: URL 8 21
5.7. Hostitelská specificita bioinsekticidů ke škůdcům Patogeny jsou důležitými přirozenými nepřáteli hmyzu a většina z tisíců druhů bakterií, virů, hub, hlístovek a prvoků, kteří nakazí hmyz jsou vysoce hostitelsky specifičtí a účinní v redukci populací svých hostitelů. Hostitelská specifika je důležitým aspektem pro patogeny, se kterými je manipulováno pro biologické kontrolní účely. Před tím než je patogen introdukován do nové oblasti jako kontrolní činitel, je nutné znát potenciální hostitelský okruh a možné účinky na jiné organismy. Vnímavost specifických druhů hmyzu k patogenu definuje hostitelský okruh tohoto patogenu. Počet druhů hostitelů, které mohou být infikovány jednotlivými druhy patogenu se mohou měnit. Patogeny, které jsou vysoce hostitelsky specifické mají úzký hostitelský okruh a nakazí jen jeden nebo několik blízce příbuzných druhů hostitele. Druhy se širokým hostitelským okruhem jsou považovány za mnohostranné, a proto nejsou příliš hostitelsky specifičtí. Některé testy však ukázaly zajímavá zjištění. Pokud byl přirozeně infikovaný hostitelský hmyz umístěn do klece s neinfikovanými hostiteli, došlo ke kontaktu mezi larvami a na většinu testovaných druhů byla infekce také přenesena pravděpodobně přes fekálie. Takže v několika případech mohl infikovaný hostitel nakazit i necílový hmyz. V laboratoři provedené další testy ukázaly, že pokud byl necílový hostitel infikován a umístěn k neinfikovanému necílovému hostiteli, pak k žádné další nákaze nedošlo. Jinými slovy mezi necílovými hostiteli k řetězové nákaze nedochází ani za optimálních podmínek pro patogen. Neobvyklé reakce necílových hostitelů k patogenům byly také zjištěny u hub. Ačkoli je velmi obtížné pozorovat neobvyklé reakce u virů, bylo uznáno, že se mohou vyskytovat atypické nebo subletální infekce i u necílových organismů. Na rozdíl od významných skupin patogenů, většina bakterií, které infikují hmyz, včetně přirozeně se vyskytujícího Bacillus thuringiensis, jsou obvykle oportunistickými bakteriemi, které infikují pouze hostitele, kteří jsou stresovaní nebo zranění. 22
6. Přehled hmyzích biopesticidů 6.1. Úvod Mezi činitele biologické ochrany (přirozené nepřátele) řadíme predátory, parazitický hmyz a patogeny. Predátory mohou být jiné druhy hmyzu nebo jiných hmyzožravců, kteří během svého života zkonzumují velká množství hmyzu. Predátoři jsou často větší, aktivní a často nápadní svým chováním a jsou proto snáze rozpoznatelní než parazité a patogeny. Za parazity hmyzu považujeme jiné druhy hmyzu, které požírají vajíčka škůdců nebo usmrcují přímo hostitele. Po vylíhnutí vajíček parazitů vznikají další stadia (larvální), která se živí přímo hostiteli a usmrcují je. Obvykle je pro parazita dostačující tělo jednoho hostitele, aby mu poskytl dostačující potravní zdroj než dozraje v dospělce. Mnoho parazitů je velmi hostitelsky specifických a jsou tedy pro necílové organismy bezpeční. Ačkoli jsou hmyzí patogeny v prostředí zcela běžné, nejsou příliš známí, neboť dosahují pouze malých velikostí a nejsou tedy viditelní. Hmyz, stejně jako jiní živočichové, podléhá nejrůznějším onemocněním. Mezi hmyzí patogeny zahrnujeme entomopatogenní houby (Obr. 9), viry, bakterie (Obr. 10), hlístovky (Obr. 11) a další mikropatogeny, které způsobují onemocnění hmyzu. Chorobné epidemie hmyzu nejsou v přírodě příliš běžné, pouze v případech jedná-li o velmi velké populace nebo pokud podmínky prostředí podporují růst patogenů. Nicméně hmyzí patogeny jsou velmi důležité pro snižování populací škůdců. Některé druhy patogenů byly v případech biokontroly velmi úspěšné. Mnoho hmyzích patogenů napadá pouze jeden druh hmyzu nebo skupinu hmyzu, a proto je nepravděpodobný atak necílových organismů včetně užitečného hmyzu, člověka, divoké zvěře nebo rostlinstva. Biopesticidy jsou určité druhy pesticidů, které obsahují živý organismus, části organismů nebo směs organismů pravidelně aplikovaných pro kontrolu nad škodlivými druhy hmyzu. Chemický průmysl vyvíjí nové aktivní přísady s nízkou toxicitou pro životní prostředí a s účinky zaměřenými pouze na cílové organismy. Tento pozitivní vývoj chemických pesticidů však omezí rozptyl mikrobiálních pesticidů kvůli snížení rozdílů v bezpečnosti obou typů preparátů. Takže výzvou by v dnešní době měl být vývoj levných mikrobiálních insekticidů s aktivitou srovnatelnou s chemickými preparáty a samozřejmě bezpečné pro životní prostředí. 23
Obr. 9: Moucha infikovaná Entomophora muscae. Zdroj: URL 9 Obr. 10: Některé druhy bakterií. B. thuringiensis, Zdroj: URL 10 Pseudomonas spp., Zdroj: URL 11 Micrococcus luteus, Zdroj: URL 12 Obr. 11: Některé druhy EPN. Steinernema carpocapsae, Zdroj: URL 13 EPN, Zdroj: URL 14 EPN v hostiteli, Zdroj: URL 15 24
6.2. Entomopatogenní viry (Obr. 12) Vlevo: Larva Píďalky usmrcená nukleopolahedrovirem. (J.Ogrodnick), Zdroj: URL 16 (Obr. 13) Uprostřed: Dospělec infikovaný nukleopolahedrovirem. (J.Ogrodnick), Zdroj: URL 16 (Obr. 14) Vpravo: Larva infikovaná granuloviry (nahoře) a zdravá (dole) (J.Ogrodnick), Zdroj: URL 16 Primární hostitel: housenky různých druhů škůdců. Klíčové charakteristiky: mrtvé larvy jsou oslabené, černé, rozkládají se napojené na listy jako váček. Hmyzí specifické viry mohou být vysoce efektivní přirozenou kontrolou některých housenek škůdců (Obr. 12, 13, 14). Různé druhy přirozeně se vyskytujících virů Baculoviridae (nukleopolyhedroviry = NPV, bakuloviry a granuloviry = GV) jsou v nízkých dávkách přítomny v mnoha populacích škůdců. Virová infekce může výrazně snížit počty škůdců, zvláště když jsou přemnožené. Virus musí být hostitelem pozřen, aby mohl způsobit infekci, ale může se také šířit při páření nebo během kladení vajíček. Hmyzí viry jsou bezpečné pro člověka i pro divoká zvířata. Virové choroby housenek škůdců mohou způsobit nepřímou úmrtnost larev prospěšných parazitů, jestliže hostitelský hmyz zemře dříve než parazit dokončí svůj vývoj. Predátoři a dospělci parazitů nejsou přímo ohroženi. Pro obnovení infekce v dalším období mohou viry přezimovat v prostředí nebo přímo v hostiteli. Úspěšná komercializace virových produktů je omezená, protože jejich produkce je poměrně drahá. A vývoj virových insekticidů je dále stěžován skutečností, že viry jsou specifické k určitým druhům škůdců a tak jsou vhodné pouze pro omezený trh. 25
6.2.1. Cíloví škůdci Přirozeně se vyskytující viry napadají housenky většiny nejzávažnějších škůdců. NPV napadají housenky píďalek, kukuřičné housenky, housenky napadající hlávkovou zeleninu, bavlnu, tabák, housenky zavíječe kukuřičného, housenky škodící na jehličnanech. Granuloviry byly izolovány z několika druhů housenek snovačů, komárů, housenek hlávkové zeleniny a mnoho dalších. 6.2.2. Mechanismus působení Viry vstupují do těla škůdce přes střevo. Je tedy nutné, aby byly cílovým hmyzem pozřeny. V mnoha tkáních se množí a narušují běžné fyziologické procesy hmyzu: přestanou se krmit, pohybovat a klást vajíčka. Virové partikule jsou sbalené do nukleokapsidu prutovitého tvaru, který obsahuje cirkulární nadšroubovicové vinutí dvouřetězcové DNA. Virové partikule (viriony) GV jsou jednotlivě uzavřené v bílkovinném obalu. U NPV jsou viriony sbaleny buď jednotlivě nebo po větších počtech. Po vstupu do hostitele jsou bílkovinné obaly virionů rozpuštěny v zásaditém prostředí střeva hostitele. Uvolněné virové částice vstupují do epiteliálních buněk a v jejich jádrech se množí. Již neobalené virové částice mohou ze střeva napadat ostatní tkáně hostitelského těla (tukovou tkáň, tracheální výstelku nebo hypodermis, apod.). Viry obalené v mnohostěnném bílkovinném obalu (polyhedra) jsou všeobecně infekční pro většinu hmyzích hostitelů. Přenos virionů bacolovirů může být usnadněn pomocí predátorů nebo při kladení vajíček (Evans, 1986; Gröner, 1990). Stejně jako u jiných biokontrolních medií existují i u virů tři základní pravidla: infekce, pomnožení a zachování. 6.2.3. Symptomy Různé druhy virů mají různé symptomy. Larvy infikované NPV se většinou zbarví bíle a mohou být i tmavě skvrnité. Některé housenky začnou šplhat na vrcholek rostliny, přestanou se krmit, zeslábnou a visí na horních listech nebo stoncích, jedná se o charakteristické vadnutí rostlin. Larvy napadené bakuloviry jsou mléčně zbarvené a přestávají se krmit. V obou případech se obsah těla larvy přemění na tekutinu, snadno dojde k ruptuře 26
kutikuly a virové částice jsou uvolněny do okolí. Smrt po virové nákaze nastává obvykle po 3 8 dnech. 6.2.4. Relativní účinnost Přirozeně se vyskytující virová onemocnění mohou zásadně zredukovat populace škůdců. Přenos virů mezi populacemi může trvat dny nebo týdny, a pokud jsou vhodné podmínky může se být zlikvidována i celá populace škůdců. Některé příklady jsou důkazem, že kombinace přirozeně se vyskytujících virů a jiných nepřátel bude udržovat populace škůdců v přijatelných úrovních. Například: viry zničí 28% populace housenek škodících na hlávkové zelenině a zbývajících 55% populace je infikováno parazitoidy. U píďalek ve stejné studii byla 40% infekčnost. Aplikace virů jako mikrobiálního insekticidu je úspěšná hlavně v oblastech, které jsou nějak omezeny. Bakuloviry prokázaly v některých testech srovnatelnou účinnost s Bacillus thuringiensis (Bt) a jsou svou účinností srovnatelné i s některými chemickými prostředky. Pomocí feromonů (hmyzích atraktantů) byli hmyzí škůdci nalákáni na virové pasti, pomocí, kterých se viry šíří a roznáší mezi škůdci a po okolí. Infikované housenky jsou rozmačkány a rozmíchány ve vodném roztoku a aplikovány jako postřik proti škůdcům. Viry nepříznivě ovlivňuje UV záření, a proto je jejich aplikace nejvhodnější později odpoledne. Hustot populace škůdců a její obecné fitness ovlivňuje citlivost vůči ataku virem a tím se efektivita různých druhů virů může měnit. Viry mohou být skladovány zamrazením několik let. Výzkumy zaměřené na zkrácení doby usmrcení viry jsou stále aktuální a pro zlepšení výkonu virových insekticidů je nutné zapojit do těchto výzkumů i genové inženýrství. Jak již bylo zmíněno, entomopatogenní viry jsou velmi citliví na UV záření. Z tohoto důvodu jsou vyvíjeny nejrůznější ochranné metody. Jednou z těchto metod je použití tzv. lekutvorných přísad. Optické leskutvorné přísady jsou chemické látky, které se používají v pracích prostředcích na projasnění tkanin. Hlavním principem je absorpce energie ultrafialového záření a jeho emise jako viditelné světlo. Jsou také používány jako UV ochrana entomopatogenů a jejich účinnosti jako mikrobiálních činitelů. Některé leskutvorné přísady byly demonstrovány nejen jako UV ochrana, ale prokázaly také potenciál zvýšit virovou účinnost. Zvýšení nakažlivosti mikrobiálních činitelů díky optickým leskutvorným přísadám obecně zvýšila mortalitu larev škůdců, ale také urychlily účinky entomopatogenů a urychlily 27
smrt larev. V některých případech byla také pozorována prodloužená účinnost i vůči starším larválním stadiím. V některých případech byly také rozšířeny okruhy hostitelů, tj., viry, které byly za standardních podmínek pro určité škůdce neinfekční, se po dodání leskutvorných přísad staly infekčními i pro dříve odolné škůdce. Leskutvorné přísady je možné využívat ke zvýšení virové produkce a jejich užitečnosti v boji proti hmyzím škůdců. Pokud jsou viry pečlivě aplikovány v obdobích, kdy jsou hladiny výskytu hmyzích škůdců ještě nízké, pak prokazují vynikající výsledky. Jejich nevýhodou je skutečnost, že potřebují delší čas než se projeví jimi způsobená infekce u cílového hmyzu a to může vést ke zničení plodin, kterými se škůdce živí. Dříve než viry dosáhnou komerčních úspěchů je nutné vyřešit ještě některé problémy jako je perzistence při skladování a UV ochrana. Je evidentní, že ještě existují překážky v rozvoji produktů obsahujících viry a budoucnost těchto produktů na komerčním trhu je zatím nejistá. Bylo také zjištěno, že rostlina může dokonce využívat entomopatogeny jako součást obranných strategií. Pokusy byly prováděny na Brassica oleraceae, která byla napadena mšicemi Myzus persicae infikovanými entomopatogenními parvoviry (M. persicae densovirus). Nakažené mšice byly přenašečkami virů na rostlinu. Do těla rostliny byly transportovány přes lýko a rostlina je poté využívala jako obranou metodu proti nenakaženým mšicím, které parazitovaly na listech brukve. Existuje tedy důkaz, že rostliny mohou být vektory hmyzích virů a mohou tento virus využívat jako ochranu proti býložravcům. V dnešní době jsou velmi diskutované problémy spojené s používáním bakulovirů (introdukce, osídlení a hromadné uvolňování a aplikace jako insekticidů) jako klasické biologické kontroly. Charakter a intenzita nákazy způsobené bakuloviry je spojena s kriteriem označovaným jako stupeň nákazy. Toto kriterium bylo zhodnoceno na základě dvou faktorů. Prvním faktorem je virulence a účinky virů na tkáně, druhým faktorem pravděpodobnost kontaktu mezi larvami škůdců a infekčním virem v přirozeném prostředí. Tato pravděpodobnost závisí na bioekologických zvláštnostech každého druhu hmyzu. Kriterium stupeň virové nákazy v ekosystému byl navržen pro výběr nejlepší metody pro použití bakulovirů proti hmyzím škůdcům. Teoretický základ metod pro použití virů pro kontrolu škodlivého hmyzu odpovídá hlavním cílům klasické biologické ochrany ( introdukce, osídlení a hromadné uvolnění). Otázky introdukce, kolonizace a přímého použití mikroorganismů jako insekticidu byly diskutované Hallem (1964). Je známo velmi málo případů o úspěšné introdukci virů. Zvláště významná byla například introdukce virů Pilatek z Evropy do USA a Kanady (Bird, 1953, Bird a Elgee, 1957). Zpočátku byl účinek poměrně 28
dramatický, ale v průběhu času se interakce mezi nukleopolyherdoviry (NPV) a jeho hostiteli vyvážily. Výsledky výzkumu interakce mezi bakuloviry a jejich hostiteli jsou zaneseny do tabulky 1. V tabulce je hmyz rozdělen do skupin podle zvláštností projevujících se při jejich napadení virem v přírodě. Stupeň nákazy je vyjádřen číslem podle charakteru viru a pravděpodobnosti kontaktu s citlivým stadiem hmyzího hostitele v přirozeném prostředí. V posledním sloupci tabulky jsou určité metody vhodné pro použití bakulovirů pro každou skupinu hmyzu a je navržen vhodný pár hostitel-virus. Tabulka 1. Vliv interakce bakulovirů s hmyzem na výskyt virových infekcí v přírodě a na metody jejich použití. (E. V. Orlovskaya, 1998) 29
Virové infekce hmyzích populací byly zkoumány hlavně ve vztahu s aktivními latentními viry za podmínek pro hmyz nevhodných (př.: stres) v období rozmnožování (Gershenson, 1959; Aruga, 1963). Další vývoj virových infekcí hmyzu v přírodě a mezi různými druhy byl spojen s hlavním faktorem odpovědným za virulenci, tedy stupněm nákazy. Výzkumy interakcí mezi baculoviry a jejich hostitelským hmyzem u jedinců a v ekosystémech ukázaly, že specifický NPV (nukleopolyhedrovirus) a GV (granulovirus) měli různé stupně aktivity u různých druhů, a že existují rozdíly mezi sukcesí infikovaných tkání u různých druhů hmyzu. Tento fakt má značný vliv na stupeň nákazy v ekosystému. 30
6.3. Entomopatogenní bakterie (Obr. 15) Larvy zavíječe kukuřičného napadené B. thuringiensis, Zdroj: URL 16 Mezi bakteriální patogeny používané proti larvám škodlivého hmyzu patří také spory tvořící tyčinkovité bakterie rodu Bacillus. Nejčastěji se vyskytují přirozeně v půdách a i druhy s velmi vysokou patogenitou jsou izolovány z půdních vzorků. Bakteriální insekticidy musí být pro cílový hmyz poživatelné a efektivní, neboť nepatří mezi kontaktní jedy. Insekticidní produkty složené z jednotlivých druhů nebo poddruhů Bacillus jsou patogenní pro celé řády hmyzu nebo pro jeden nebo několik druhů hmyzu (Obr. 15). Například, produkty obsahují Bacillus thuringiensis var. kurstaki usmrcují larvální stadia široké škály motýlů, můr a molů. Na rozdíl od tohoto druhu, druh Bacillus popilliae var. popilliae usmrcuje pouze larvy určitých druhů brouků, ale není efektivní proti blízce příbuzným ponravám, které devastují parkové trávníky v různých oblastech celého světa. Nejpoužívanějšími mikrobiálními insekticidy jsou produkty obsahující Bt a požívají se v některých zemích již od roku 1960. Produkty obsahující Bt jsou vyráběny ve velkých průmyslových fermentačních nádobách. 6.3.1. Cíloví škůdci Celá řada můr, molů, druhů brouků a larev much, které jsou vůči infekci citlivé. Bt je dostupný pro kontrolu nad: mnoha housenkami škůdců, včetně importovaných housenek ožírajících listy hlávkové zeleniny, housenkami píďalek (kapusta), housenkami lišaje, zavíječe kukuřičného, předivky polní, larvám brouků, vakonošům, bekyni velkohlavé a jiných lesních housenek. Menší účinky má na zavíječe jablečného a broskvového a na vrtáka révového. Varianta Bt tenebrionis zaznamenala účinky proti larvám mandelinky bramborové 31
a larvám brouka napadajícího listoví jilmů. Varianta izraelensis je prodávaná proti muchničkám a komárům, pakomárům ačkoli není-li použit na celou plochu výskytu je účinnější odstranění vodního zdroje larev a plevelů kolem vodní plochy. Bt varianta aizawai se používá pro kontrolu larev zavíječe voskového ve včelích úlech a jiným housenkám. Některé komerčně dostupné varianty Bt a cíloví hmyzí škůdci: Bacillus thuringiensis var. tenebrionis - mandelinka bramborová a larvy škodící na listoví jilmů. var. kurstaki - housenky. var. israelensis - larvy komárů, muchniček a pakomárů. var. aizawai - larvy zavíječe voskového a různé housenky zvláště předivky polní. 6.3.2. Mechanismus působení Bakteriální buňky obvykle produkují spory a krystalické proteinové toxiny zvané endotoxiny. Komerční produkty obsahují většinou bílkovinné toxiny a spory nebo pouze toxiny. Jakmile je Bt pozřen citlivým hmyzem je bílkovinný toxin aktivován zásaditým prostředím střeva škůdce a aktivními střevními enzymy. Poté se aktivovaný toxin napojí na specifické receptory, ochromí a ničí buňky střevní stěny a obsah střeva se vylije do tělní dutiny hmyzu. Otrávený hmyz vlivem toxinu rychle umírá nebo přestane přijímat potravu a umírá během 2 3 dnů na septicaemii (Obr. 16). Bt se nereprodukuje, ale v prostředí je perzistentní a zůstává v půdě v dostatečných množství pro poskytnutí kontinuální kontroly nad škůdci. Bakterie se mohou množit v infikovaném hostiteli, ale protože by se tvořilo pouze málo spor a proteinových toxinů a bylo by tedy po smrti hostitele uvolňováno pouze malé množství infekčních jednotek. Z tohoto důvodu jsou Bt produkty aplikovány stejným způsobem jako chemické pesticidy. Bt ošetřené plochy jsou během několika dní neaktivní, a proto je nutná opakovaná aplikace. Vlastnosti endotoxinů se mezi jednotlivými druhy a izoláty Bt liší a charakteristické rysy těchto endotoxinů určují proti kterému druhu škůdce bude jejich účinek nejefektivnější. Nestačí však pouze správná fyziologie hmyzu a vnímavé vývojové stadium, ale patogen musí být navíc pozřen v dostatečném množství. 32