Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) Kat. číslo 103.7266

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) Kat. číslo 103.7266 Strana 1 z 46

OBSAH Úvod... 3 Obsah sad... 5 Sady pro chromatografii na tenké vrstvě... 5 Mikrosada A pro začátečníky (kat. č. 814 000)... 5 Mikrosada M (kat. č. 814 100)... 6 Mikrosada F1 (kat. č. 814 200)... 7 Mikrosada F2 (kat. č. 814 300)... 8 Mikrosada F3 (kat. č. 814 400)... 9 Princip chromatografie na tenké vrstvě... 11 Postup při oddělování pomocí chromatografie na tenké vrstvě... 12 Příprava vzorku... 12 Nanášení vzorku... 12 Vyvíjení chromatogramu... 13 Vyvolání chromatogramu... 14 Vyhodnocení chromatogramu... 16 Pokusy s mikrosadou A pro začátečníky... 17 Oddělování lipofilních (rozpustných v tucích) směsí barviv... 17 Oddělování směsí antrachinonových barviv... 19 Oddělování směsí potravinářských barviv... 21 Oddělování barev do popisovačů... 23 Pokusy s mikrosadou pro chromatografii F1... 25 Oddělování aminokyselin (modelová směs a urin)... 25 Oddělování kationtů těžkých kovů... 28 Pokusy s mikrosadou pro chromatografii F2... 32 Analýza pokrmových tuků... 32 Analýza tuků a cholesterolu v krvi... 35 Pokusy s mikrosadou pro chromatografii F3... 39 Oddělování analgetik (prostředků na tišení bolesti)... 39 Analýza drog na příkladu chinarindu... 43 Seznam doplňující a rozšiřující literatury pro teorii i praxi chromatografie na tenké vrstvě... 46 Strana 2 z 46

ÚVOD Chemická analýza surovin, kontrola výroby, kontrola čistoty vyrobených produktů a analýza prostředí nabývají stále na významu. Své pevné místo mezi prostředky, které tento problém mohou řešit, zaujala chromatografie na tenké vrstvě (Thin Layer Chromatography, TLC). Je to elegantní analytická a preparativní oddělovací metoda, která plně vystřídala klasickou chromatografii na papíře. V mnoha oblastech se používá jako standardní metoda při rutinní analýze. Přitom se ukazuje, že je nejen rychlá, přesná a vysoce citlivá, ale především také hospodárná. Používá se již asi 40 let. Pro její provádění jsme postupně nabídli radu sorpčních prostředků, zejména silikagel, celulózu, oxid hlinitý a polyamid, popřípadě příslušně modifikované látky pro speciální příležitosti. Tyto v praxi osvědčené sorpční prostředky se u nás nejen strojově nanáší na skleněné desky a vytváří tak hotové desky pro chromatografii, nýbrž i na polyesterové fólie a alufólie, čímž vznikají hotové fólie pro chromatografii. Tím šetříme analytikům časově náročnou a drahou ruční přípravu chromatografických desek a fólií a současně díky strojovému zhotovení garantujeme velkou rovnoměrnost vrstev. S tím, jak si nová metoda našla cestu do stále většího počtu laboratoří a vzdělávacích ústavů, jsme pro její výuku sestavili mikrosadu, která je postavena jak na rychlosti postupů, tak na výkonnosti našich hotových fólií POLYGRAM. Pro to a pro rychlou kontrolu produktů ještě během fáze výroby slouží hotové chromatografické fólie. Současně chceme dávat podněty k řešení dalších problémů a k vlastnímu bádání. Nabízíme: 1. Sadu pro začátečníky, která se vyznačuje především tím, že odděluje pomocí jednoduchých mobilních fází vzorky, které mají vlastní barvu, takže jejich zviditelňování odpadá. Všechny potřebné pomůcky jsou obsaženy v sadě. 2. Sadu pro pokročilé, ve které se od již zkušenějších žáků očekávají trochu zručnější prsty. Musí zde sami připravit část vzorků a k identifikaci látek je třeba používat detekční činidla. Tato sada umožňuje provádět samostatné pokusy. Vedle pomůcek obsažených v sadě se k pokusům používají i další pomůcky, které bývají běžně k dispozici v chemické laboratoři (jako například fén, digestoř, rozpouštědla, zkumavky, sušička atd.). V obou mikrosadách se oddělování provádí na hotových fóliích formátu 4 cm x 8 cm. Strana 3 z 46

Strana 4 z 46

OBSAH SAD SADY PRO CHROMATOGRAFII NA TENKÉ VRSTVĚ Obě sady pro chromatografii na tenké vrstvě obsahují pomůcky a chemikálie potřebné k provedení jednoduchých oddělování. Obzvláště dobře poslouží tyto sady pro uvedení žáků, studentů a učňů do problematiky chromatografie na tenké vrstvě. Každá sada obsahuje podrobná vysvětlení a návody k jednotlivým pokusům. MIKROSADA A PRO ZAČÁTEČNÍKY (KAT. Č. 814 000) Tato sada obsahuje chemikálie a pomůcky potřebné pro provedení následujících pokusů: a) oddělování lipofilních (rozpustných v tucích) směsí barviv b) oddělování směsí antrachinonových barviv c) oddělování směsí potravinářských barviv d) oddělování barev do popisovačů Obsah 1 návod 3 vyvíjecí komory 50 skleněných kapilár 1 l 1 šablona 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM ALOX N/UV 254 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM CEL 300 1 odměrný válec 10 ml 8 ml testovací směsi barviv 1 (4 lipofilní barvy) 8 ml testovacího červeného barviva Sudan G 8 ml testovacího modrého barviva Sudan II 8 ml testovací směsi barviv 2 (7 antrachinonových barev) 8 ml testovacího modrého barviva 1 8 ml testovacího fialového barviva 2 8 ml testovací směsi barev 3 (7 potravinářských barviv) 8 ml testovacího žlutooranžového barviva 5 8 ml testovacího barviva brilantní čerň BN 100 ml toluolu 100 ml toluol-cyklohexan (2 : 1, v/v) Strana 5 z 46

100 ml chloroform-aceton (1 : 1, v/v) 100 ml 2,5% roztoku citrátu sodného 100 ml 25% roztoku amoniak-2-propanol (5 : 3, v/v) 2 filcové popisovače Doplňky k mikrosadě A pro chromatografii Kat. č. 814001 814011 814002 814012 814003 814013 814021 814022 814023 814024 814025 814026 814027 814028 814029 814030 Pomůcka Testovací směs barviv 1, roztok 4 barviv v toluolu, 8 ml Sada 4 jednotlivých složek testovací směsi barviv 1, 4 x 8 ml Testovací směs barviv 2, roztok 7 antrachinonových barviv ve chloroformu, 8 ml Sada 7 jednotlivých složek testovací směsi barviv 2, 7 x 8 ml Testovací směs barviv 3, vodný roztok 7 potravinářských barviv, 8 ml Sada 7 jednotlivých složek testovací směsi barviv 3, 7 x 8 ml Vyvíjecí komora, balení po 4 ks Skleněné kapiláry o objemu 1 l, balení 3 x 50 ks Šablony, balení po 2 ks Skleněný odměrný válec 10 ml, balení po 2 ks Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254, 4 x 50 ks v balení Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM ALOX N/UV 254, 4 x 50 ks v balení Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM CEL 300, 4 x 50 ks v balení Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254 2 x 50 ks, POLYGRAM ALOX N/UV 254 1 x 50 ks, POLYGRAM CEL 300 1 x 50 ks Citrát sodný 2,5 g v láhvi a 100 ml k přidání do dest. vody, 2 láhve v balení Papír na chromatografii MN 260, 100 listů 7,5 x 17 cm Balení 1 sada 1 sada 1 sada MIKROSADA M (KAT. Č. 814 100) Tato sada je předpokladem pro provedení pokusů podle sad F1 až F3. Je zároveň pomůckou pro samostatné provádění dalších pokusů s chromatografií na tenké vrstvě. Obsah 2 x 50 skleněných kapilár 1 l 1 šablona 1 odměrný válec 10 ml 1 skleněná střička s gumovým balónkem 2 vyvíjecí komory 1 gumový klobouček pro kapiláru na nanášení 1 plastová stříkačka 1 ml Strana 6 z 46

1 skleněná kádinka 25 ml 20 archů filtračního papíru MN 713, DIN A5 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM ALOX N/UV 254 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM CEL 300 Doplňky k mikrosadě M pro chromatografii Kat. č. 814021 814022 814023 814024 814025 814026 814027 814028 814030 814101 814102 814103 814104 Pomůcka Vyvíjecí komora, balení po 4 ks Skleněné kapiláry o objemu 1 l, balení 3 x 50 ks Šablony, balení po 2 ks Skleněný odměrný válec 10 ml, balení po 2 ks Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254, 4 x 50 ks v balení Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM ALOX N/UV 254, 4 x 50 ks v balení Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM CEL 300, 4 x 50 ks v balení Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254 2 x 50 ks, POLYGRAM ALOX N/UV 254 1 x 50 ks, POLYGRAM CEL 300 1 x 50 ks Papír na chromatografii MN 260, 100 listů 7,5 x 17 cm Skleněná laboratorní střička s gumovým balónkem Gumové kloboučky pro kapiláry na nanášení Filtrační papír MN 713, 100 listů DIN A5 Plastová stříkačka se stupnicí, objem 1 ml Balení 1 kus 2 kusy 100 listů 1 kus MIKROSADA F1 (KAT. Č. 814 200) Tato sada obsahuje všechny chemikálie potřebné pro provedení následujících pokusů: a) oddělování aminokyselin (modelová směs) b) oddělování aminokyselin v urinu c) oddělování kationtů těžkých kovů Obsah 1 návod 50 skleněných kapilár 1 l 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM CEL 300 100 ml n-butanolu 100 ml detekčního činidla ninhydrinu 100 ml acetonu Strana 7 z 46

100 ml 25% amoniaku 100 ml detekčního činidla kyseliny rubeanové 50 ml 50% kyseliny octové 50 ml 18% kyseliny solné 8 ml testovací směsi aminokyselin 8 ml srovnávacího roztoku tryptofanu 8 ml srovnávacího roztoku argininu 8 ml testovací směsi kationtů těžkých kovů 8 ml srovnávacího roztoku Co 2+ 8 ml srovnávacího roztoku Mn 2+ 8 ml srovnávacího roztoku Ni 2+ Doplňky k mikrosadě F1 pro chromatografii Kat. č. 814022 814025 814027 814103 814201 814202 814203 814204 814205 814206 Pomůcka Skleněné kapiláry o objemu 1 l, balení 3 x 50 ks Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254, 4 x 50 ks v balení Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM CEL 300, 4 x 50 ks v balení Filtrační papír MN713, 100 listů DIN A5 Testovací směs aminokyselin, 8 ml Sada 4 jednotlivých složek testovacího směsi aminokyselin, 4 x 8 ml Ninhydrin detekční činidlo, 100 ml Testovací směs kationtů, 8 ml Sada 4 jednotlivých složek testovací směsi kationtů, 4 x 8 ml Kyselina rubeanová - detekční činidlo, 100 ml Balení 100 listů 1 sada 1 sada MIKROSADA F2 (KAT. Č. 814 300) Tato sada obsahuje všechny chemikálie potřebné pro analýzu pokrmových tuků a analýzu tuků a cholesterolu v krvi. Obsah 1 návod 50 skleněných kapilár 1 l 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254 5 krevních lancet 5 jednorázových pipet 25 l 5 alkoholových tampónů 5 lahviček s víčkem 2 ml Strana 8 z 46

3 prázdné lahvičky 30 ml (máslo, margarín, jedlý olej) 100 ml chloroformu 100 ml metylenchloridu 100 ml toluolu 100 ml detekčního činidla - kyseliny molybdatofosforečné 50 ml acetonu s kalibrovanou pipetou 8 ml cholesterinu srovnávací roztok Doplňky k mikrosadě F2 pro chromatografii Kat. č. 814022 814025 814103 814301 814302 Pomůcka Skleněné kapiláry o objemu 1 l, balení 3 x 50 ks Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254, 4 x 50 ks v balení Filtrační papír MN713, 100 listů DIN A5 Cholesterin srovnávací roztok, 8 ml Kyselina molybdatofosforečná detekční činidlo, 100 ml Balení 100 listů MIKROSADA F3 (KAT. Č. 814 400) Tato sada obsahuje všechny chemikálie potřebné pro oddělování analgetik (prostředků na tišení bolesti) a analýzu drog na příkladu chinarindu. Obsah 1 návod 50 skleněných kapilár 1 l 50 hotových fólií 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254 5 tablet Aspirin 5 tablet Thomapyrin 20 složených filtrů MN 615 114,11 cm ø 3 prázdné lahvičky 8 ml (vzorek aspirinu, vzorek thomapyrinu, extrakt chinarindu) 5 g chinarindu 100 ml 2-propanolu 100 ml detekčního prostředku na kofein 100 ml Dragendorffova činidla podle Muniera (detekční činidlo) 100 ml toluol-dietylether (55/35, v/v) 50 ml roztoku FeCl 3 50 ml roztoku K 3 [Fe(CN) 6 ] 30 ml kyselina octová-etylester kyseliny octové (6/2,5, v/v) 25 ml 12,5% amoniaku Strana 9 z 46

25 ml dietylaminu 8 ml srovnávacího roztoku kofeinu 8 ml srovnávacího roztoku paracetamolu 8 ml srovnávacího roztoku chininu Doplňky k mikrosadě F3 pro chromatografii Kat. č. 814022 814025 814103 814401 814402 814403 814404 814405 814406 814407 814408 Pomůcka Skleněné kapiláry o objemu 1 l, balení 3 x 50 ks Hotové fólie 4 cm x 8 cm POLYGRAM SIL G/UV 254, 4 x 50 ks v balení Filtrační papír MN713, 100 listů DIN A5 Detekční činidlo na kofein, 100 ml Dragendorffovo činidlo podle Muniera detekční činidlo china-alkaloidů, 100 ml Roztok chloridu železitého, 100 ml Roztok K 3 [Fe(CN) 6 ], 100 ml Srovnávací roztok chininu, 8 ml Srovnávací roztok paracetamolu, 8 ml Srovnávací roztok kofeinu, 8 ml Skládaný filtr MN 615 ¼, 11 cm ø, 100 ks v balení Balení 100 listů Strana 10 z 46

PRINCIP CHROMATOGRAFIE NA TENKÉ VRSTVĚ V případě chromatografie na tenké vrstvě se jedná o vícestupňový dělící proces. Tohoto procesu se účastní rozpouštěcí prostředky nebo směsi, zkušební molekuly a vhodné sorpční prostředky. Tyto sorpční prostředky tvoří tenkou vrstvu pro analytické účely o tloušťce mezi 0,1 mm a 0,25 mm nanesenou na nosiči (skleněná deska, polyesterová fólie, alufólie). Při pokusech s následujícími sadami se směsi látek k dělení nanášejí na připravenou fólii a umístí se do vyvíjecí komory naplněné mobilní fází. V mnoha případech je chromatografické dělení hotové po několika minutách. Látky s vlastním zbarvením jsou ihned patrné, bezbarvé látky je třeba zviditelnit pomocí vhodné reakce. Máme-li k dispozici UV-lampu a obsahuje-li vrstva sorpčního prostředku vhodný fluorescenční indikátor, mohou být často látky lokalizovány pomocí pozorování chromatogramu v UV-světle. Strana 11 z 46

POSTUP PŘI ODDĚLOVÁNÍ POMOCÍ CHROMATOGRAFIE NA TENKÉ VRSTVĚ Pro lepší porozumění postupu uvedeme pět po sobě následujících kroků. PŘÍPRAVA VZORKU Má-li být výsledek kvalitní, musí vzorek používaný při chromatografickém oddělování splňovat několik požadavků. Na tomto místě však není možné jít do podrobností. Již bylo poukázáno na to, že je žádoucí používat eventuelně více pracovních postupů k obohacení nebo předčištění látek určených k odlučování. V sadě pro začátečníky jsou úlohy vybrány tak, aby nebylo třeba používat komplikované pracovní postupy. Jedná se o cíleně smíchané barevné látky, popřípadě jejich směsi, které se dají použít bez dalších předběžných úprav. V závěru je ukázán ještě jeden příklad z běžné praxe (oddělování barev z popisovače), při kterém se také vzorek dá použít rovnou. V případě sady pro pokročilé je třeba některé z přípravných kroků provést vlastními silami. Mezi tyto kroky patří rozdrcení vzorku, extrakce, filtrace a obohacení. Díky vlastní práci při přípravě vzorků získá uživatel představu o technikách používaných v průmyslu, které jsou předpokladem pro úspěšné provedení chromatografie na tenké vrstvě. Oproti sadě pro začátečníky, jejíž vzorky jsou vytvořeny uměle, řeší pokročilí úlohy podobné praktickým problémům. O podrobnostech bude řeč u jednotlivých úloh. NANÁŠENÍ VZORKU Způsob nanášení vzorku se řídí podle cíle chromatografického oddělování. Pro kvalitativní oddělování nanášíme vzorek jako tečku kapilárou nebo mikropipetou, pro kvantitativní pokusy používáme buď tečku nebo čárku (5 mm až 10 mm). Pro preparační oddělování se doporučuje použít vrstvu ve formě pásů po celé ploše podložky. V následujících úlohách se nanáší směs k oddělování, případně zkušební roztoky, pomocí skleněné kapiláry na připravenou folii. Každou kapiláru lze při nanášení různých vzorků použít jen jednou; v opačném případě by zbytky předchozího vzorku mohly znečistit ten následující. V případě organických vzorků se kapilára rychle plní sama od sebe, jakmile ji ponoříme; u vodných roztoků se naplňuje zřetelně pomaleji, popřípadě je nutné vzít si na pomoc pipetu. Před vyprázdněním odvalujeme kapiláru ve vodorovném směru po filtračním papíře. Je-li ale kapilára naplněna až po horní okraj, postavíme ji nenamočeným koncem na vrstvu. Kapiláru je třeba umístit na vrstvu opatrně a v pravém úhlu. V pravém úhlu proto, aby se sama vyprázdnila, a opatrně proto, abychom vrstvu nepoškodili. Poškození vrstvy vede k nerovnoměrně vytvořeným skvrnám. Aby se při naná- Strana 12 z 46