CHIÁNÍ KAPAINOVÁ CHOMATOGAFIE J. FÄHNICH Obecné základy separace opticky aktivních látek Opticky aktivní látky se při interakci s elektromagnetickým zářením projevují ve dvou směrech. Jednak stáčejí rovinu lineárně polarizovaného světla, jednak rozdílně absorbují pravotočivě a levotočivě kruhově polarizované světlo. První jev studuje polarimetrie a v závislosti na vlnové délce optická rotační disperze, druhý z těchto jevů je označován jako cirkulární dichroismus a pro jeho měření se používá takto označovaná forma absorpční spektrometrie. Oba jevy jsou závislé na vlnové délce (podobně jako index lomu a absorbance) a jsou spolu vzájemně vázány integrální transformací (Kronig-Kramers). Aby tedy látka stáčela rovinu polarizovaného světla v určité spektrální oblasti, musí existovat spektrální oblast, kde se projevuje její cirkulární dichroismus, a naopak. Optická aktivita se může projevit pouze u chirálních látek. Tímto termínem jsou označovány látky, které se vyskytují ve dvou formách, které jsou vzájemně zrcadlově symetrické (podobně jako pravá a levá ruka) a nejsou přitom stejné, tzn. nelze je převést na sebe pouhým přemístěním v prostoru. Tyto stereoisomerní formy jsou označovány jako enantiomery. Jako racemická směs se označuje směs obsahující oba enantiomery ve stejném množství. Tato směs není opticky aktivní, protože se účinky obou forem kompenzují. Mezi opticky aktivní patří například ty látky, které obsahují čtyřvazný uhlíkový atom s různými substituenty nebo jiné tzv. (asymetrické) chirální centrum. Chiralita může být ale spojena i se sekundární strukturou molekuly, jak je tomu u biopolymerů tvořících pravotočivou či levotočivou šroubovici. Pokud molekula obsahuje n chirálních center, je počet možných stereoisomerů dán vztahem 2 n. Některé z nich tvoří zrcadlově symetrické dvojice enantiomerů, které mají stejné fyzikálně chemické vlastnosti, pouze jejich optická aktivita se liší znaménkem. Stereoisomery, které nejsou ve vztahu zrcadlové symetrie, jsou označovány jako diastereoizomery a mají obecně odlišné fyzikálně chemické vlastnosti. Materiál obsahující oba enantiomery určité opticky aktivní látky bývá charakterizován veličinou označovanou jako enantiomerní přebytek ee (enantiomeric excess) neboli enantiomerní či optická čistota. Je dán vztahem n1 n2 ee= n + n 1 2 kde n 1 a n 2 jsou látková množství obou enantiomerů. Jako míra cirkulárního dichroismu se měří rozdíl absorbance levotočivého a pravotočivého cirkulárně polarizovaného záření A A= A A Často se ale výsledky měření vyjadřují jako tzv. elipticita θ. To souvisí s tím, jak se cirkulární dichroismus projeví u lineárně polarizovaného světelného paprsku. Ten je možno rozložit na dva opačně kruhově polarizované paprsky o stejné amplitudě a fázi. Po průchodu prostředím vykazujícím

cirkulární dichroismus se ale jeden z těchto paprsků zeslabí více než druhý. Když se pak opět složí dohromady, výsledkem není lineárně polarizované světlo, ale světlo elipticky polarizované. (srv. http://www.photophysics.com/tutorials/circular-dichroism-cd-spectroscopy/7-cd-units-conversions). Jako elipticita je označován úhel, který svírá přepona pravoúhlého trojúhelníku tvořeného poloosami elipsy, kterou opisuje vektor elektrického pole v rovině kolmé na směr šíření paprsku, s hlavní osou elipsy (Obr.1). Obr. 1 Průchod lineárně polarizovaného světla opticky aktivním prostředím. Vlevo lineárně polarizované světlo vstupující do prostředí a jeho rozklad na pravotočivou a levotočivou komponentu, vpravo superposice obou paprsků po průchodu prostředím, je-li pravotočivý paprsek zeslaben více než levotočivý. (http://iupac.org/polyedu/page36/page19/page25/files/5_circular%20dicroism_a.doc) E θ = arctg E E + E 1 E = arctg 1+ E / E / E 1 10 = arctg 1+ 10 ( A A ) / 2 1 10 = arctg 1+ 10 A / 2 ( A A )/ 2 A / 2 Pro nízké hodnoty A zanedbáním vyšších členů rozvoje dostaneme ln(10) θ = 4 A

pro elipticitu vyjádřenou v radiánech a 180 ln(10) θ = A= 32, 9821 A 4π pro elipticitu vyjádřenou ve stupních. Pro separaci enantiomerů bývá používáno několik přístupů, které využívají biotransformace, membránové děje, krystalizaci, extrakci kapalina-kapalina, elektroforézu a v neposlední řadě chromatografii. Aby bylo možno chromatograficky dělit enantiomery, musí být v separačním systému přítomna v nějaké formě opticky aktivní složka. V jednom přístupu se složky vzorku derivatizují chirálním derivatizačním činidlem. Z enantiomerních složek vzorku se tím vytvoří diastereoizomerní deriváty, které jsou v principu již separovatelné i v systémech s achirální stacionární a mobilní fází. Druhou, častější možnost separace přinášejí chirální stacionární fáze. Dnes je komerčně dostupná celá řada chirálních sorbentů, které jsou použitelné pro separace v normálním nebo reversním modu. Některé fáze jsou použitelné pro oba typy separací. V této práci je pro chirální separace použita kolona plněná sorbentem ux 3µm Cellulose-3 (Phenomenex Inc.). Tento sorbent patří do skupiny chirálních stacionárních fází na bázi polysacharidů. Jedná se o p-methylbenzoátový derivát celulózy (Obr. 2 ). Sorbent je použitelný pro separace v normálním i reversním modu. Výrobce uvádí vysokou účinnost a stabilitu až do tlaků 300 bar. Obr. 2 Struktura chirálního sorbentu ux Cellulose-3 (http://www.sepscienceasia.com/getmethod/50c0e9eb-ddce-49f0-b0a6-1c08c65ad512) Návod laboratorní práce SEPAACE DEIVÁTŮ POPANOVÉ KYSEINY Úkolem práce je nalezení vhodných podmínek pro separaci zadané neznámé směsi derivátů propanové kyseliny na běžné koloně pro chromatografii s obrácenými fázemi a rovněž na chirální koloně. Za těchto podmínek budou izolovány jednotlivé komponenty. Pro izolované frakce budou změřena absorpční spektra jednak na konvenčním spektrofotometru CAY 50, jednak s využitím CD detektoru JASCO CD-2095. Deriváty propanové kyseliny tvoří významnou skupin farmaceuticky aktivních látek. Mezi deset ve světě nejprodávanějších léčiv patří Ibuprofen (Obr. 3) ((S)-2-(isobutylfenyl)-propanová kyselina). Je používán v přípravcích proti zánětu, bolesti a horečce ve formě racemické směsi, i když farmakologicky aktivní je pouze jeho (S)-forma. I ()-enantiomer je nicméně v organismu postupně racemizován na aktivní (S) formu. Disociační konstanta ibuprofenu má hodnotu pka=4.43±0.03,

distribuční koeficient n-oktanol/voda je 11.7 při ph=7.4 a racemická směs má bod tání 74-77 C. (http://www.druglib.com/druginfo/motrin/). Bod tání čistých enantiomerů je pouze okolo 51 C. Obr. 3 Struktura Ibuprofenu I další deriváty propanové kyseliny mají podobné farmakologické využití. Jako příklad (Obr. 4) uveďme Ketoprofen ((S)-2-(3-Benzoylfenyl)propanová kyselina), Naproxen ((S)-2-(6-Methoxy-2- naftyl)propanová kyselina, Carprofen ((S)-2-(6-chloro-9H-carbazol-2-yl)propanová kyselina), Fenoprofen ((S)-2-(3-fenoxyfenyl)propanová kyselina) nebo oxoprofen ((S)-2-{4-[(2- oxocyklopentyl)methyl]fenyl}propanová kyselina). Ketoprofen Naproxen Fenoprofen Carprofen oxoprofen Obr. 4 Struktura některých farmakologicky významných derivátů propanové kyseliny Úkoly: 1. Ověřte činnost kapalinového chromatografu 2. Separujte isokraticky zadanou směs derivátů propanové kyseliny na koloně pro separaci s obrácenými fázemi pro tři složení mobilní fáze

3. Separujte isokraticky zadanou směs derivátů propanové kyseliny na chirální koloně pro tři složení mobilní fáze 4. Pro vybrané složení mobilní fáze opakovaně izolujte frakce ze separace na chirální koloně 5. Změřte absorpční spektra zachycených frakcí na spektrometru CAY 50 6. Pro vybrané složení mobilní fáze separujte zadanou směs derivátů propanové kyseliny na chirální koloně s detekcí detektorem JASCO CD-2095 7. Separujte zadanou směs derivátů propanové kyseliny na chirální koloně s detekcí detektorem JASCO CD-2095 se současným záznamem CD a UV spekter 8. Zpracujte výsledky (určete retenční časy jednotlivých složek vzorku pro obě kolony a vyneste do grafu v závislosti na složení mobilní fáze, zobrazte spektra frakcí změřená na spektrometru CAY 50 a odhadněte pravděpodobnou strukturu chromoforu v těchto látkách, porovnáním se separací na chirální koloně určete, která z komponent vzorku má chirální charakter, zobrazte CD a absorpční spektra změřená detektorem JASCO CD-2095) Přístroje a zařízení Kapalinový chromatograf a jeho ovládání Kapalinový chromatograf je zobrazen na Obr. 5. V tomto konkrétním případě bude využívána tzv. kapalinová chromatografie na obrácené/reverzní fázi. Kolona pro separaci s obrácenými fázemi je naplněna sorbentem Eclipse Plus C18, který má formu sférických částic o střední průměrné velikosti 5 µm. Sorbent je vyráběn z porézního silikagelu. Jeho povrch je chemicky modifikován hydrofobními kovalentně navázanými oktadecylovými řetězci. Vlastní analytická kolona má rozměry 50 2,1 mm a je chráněna předkolonou o rozměrech 12,5 x 2,1 mm. Celková délka separačního lože je tedy 62,5mm. Chirální kolona je naplněna sorbentem ux 3µm Celllulose-3 o průměrné velikosti částic 3 µm. Kolona má rozměry 150 2 mm, předkolona 2 x 2 mm, celková délka separačního lože je tedy 152 mm. Obr. 5 Kapalinový chromatograf 1 zásobníky mobilní fáze, 2 degaser mobilní fáze, 3 směšovací ventil mobilní fáze (nízkotlaký gradient), 4 vysokotlaké čerpadlo, 5 nástřikový ventil (smyčkový dávkovač,

injektor), 6 chromatografická kolona s předkolonou, 7 detekční cela UV-VIS detektoru. Mobilní fází je směs 0.1% vodný roztok kyseliny mravenčí methanol. Přítomnost kyseliny mravenčí (pka=3,75) v mobilní fázi potlačí disociaci slabě kyselých separovaných složek. Mobilní fáze je online tvořena mícháním obou komponent ve směšovacím elektronicky řízeném ventilu kapalinového chromatografu. Poměr, ve kterém jsou obě komponenty míchány, je volitelný. Při tzv. isokratické separaci je udržován po celou dobu analýzy na konstantní hodnotě. Čerpadlo ale umožnuje i tvorbu tzv. nízkotlakého gradientu, při kterém se poměr směšovaní mění během analýzy podle předem nastaveného programu. Před vstupem do směšovacího ventilu jsou z obou komponent mobilní fáze odstraňovány rozpuštěné plyny průtočným vakuovým degaserem. Vzorek je do toku mobilní fáze dávkován nástřikovým ventilem (smyčkovým dávkovačem). Do jeho krátké kapiláry (smyčky) o přibližném objemu 20 µl může být injekční stříkačkou nadávkován analyzovaný vzorek. Po přepnutí ventilu je smyčka vřazena do toku mobilní fáze a nadávkovaný vzorek je mobilní fází unášen na začátek kolony. Na výstupu z kolony jsou jednotlivé složky detegovány fotometrickým detektorem. Signál z detektoru je zaznamenáván počítačem, který je vybaven chromatografickým programem Clarity. Fotometrický detektor měří absorpci ultrafialového záření mobilní fází, která vytéká z kolony. Jako zdroj záření je použita deuteriová výbojka, z jejíhož spektra je monochromátorem izolováno záření s volitelnou detekční vlnovou délkou. Průtočná kyveta má optickou délku 1 cm a celkový objem 14 µl. Tok UV záření prošlý kyvetou je měřen fotodiodou. Elektrický signál na výstupu z detektoru je lineárně závislý na absorbanci roztoku v průtočné kyvetě pro zvolenou vlnovou délku. Zpracování signálu z detektoru Chromatografická datastanice Clarity pracuje pod operačním systémem Windows. Naměřené chromatogramy jsou ukládány jako soubory na pevný disk počítače. Uložené datové soubory mohou být kdykoliv vyvolány a dále zpracovány tak, aby se získaly např. informace o retenčních časech, plochách píku, výškách píku nebo o účinnosti kolony. (Při kvantitativní chromatografické analýze je možno vytvořit kalibrační soubory, s jejichž pomocí lze získat údaje o obsahu stanovované složky v nastřikovaném roztoku.) V této práci bude využita jen malá část možností, které datastanice poskytuje. Spuštění chromatografického systému Zkontrolujeme sestavení přístroje (kabely, kapiláry) a zjistíme, zda jsou ovládací tlačítka na chromatografu a počítači ve vypnuté poloze. Zapneme síťový vypínač na chromatografu (na přístroji je umístěn vlevo dole), po chvíli se rozsvítí oranžová ED dioda (vpravo nahoře), instrument je ve standby stavu. Zapneme síťový vypínač na počítači. Automaticky začne běžet spouštění programu Windows a na obrazovce se objeví požadavek Prihlášení k systému Windows. Uživatelské jméno bude automaticky předvyplněno ( student ), položku Heslo vyplníme také student a stiskneme tlačítko OK. Na ploše spustíme dvojklikem program Clarity. Objeví se nové okno se symbolem přikrytého chromatografu. Klikneme na něj, otevře se okno ogin Dialog s požadavkem Enter user name a s roletovým menu s nabídkou naposledy zpracovávaného projektu. Zde je možno vybrat projekt, který chceme otevřít k dalšímu zpracování, nebo vytvořit projekt nový. Pak beze změny user name stiskneme tlačítko OK. Po tomto kroku se objeví symbol odkrytého chromatografu a otevře se zvolený projekt ve stavu, v jakém byl naposledy opuštěn. V hlavním okně Clarity je zobrazeno formou ikon celé schéma chromatografického systému. Klikáním na ikony je pak možno přistupovat k jednotlivým částem/modulům HPC systému. Nahoře na liště okna je zobrazeno označení chromatografického systému a aktuálně zvolená metoda. Pokud je zvolena jiná metoda než Method

C:\Clarity\UVbezCD.met, vyhledáme tuto metodu v adresáři C:\Clarity\ příkazem File/Open Method a otevřeme ji. Dále v hlavním okně Clarity příkazem Monitor/Device Monitor otevřeme stejně označené okno obsahující v částech Grad. Pump, Column Oven a VWD aktuální informace o stavu gradientového čerpadla, termostatu kolony a detektoru s proměnnou vlnovou délkou (Variable Wavelength Detector). V tomto okně je také možno přímo vypnout nebo zapnout tyto části chromatografu. Dále klikneme na symbol vialky s mikrostříkačkou ve schématu HPC v hlavním okně Clarity. Otevře se okno umožňující v položce označené Chromatogram File Name volbu jména souboru, ve kterém bude budoucí chromatogramu uložen. Pokud již soubor s uvedeným jménem v rámci projektu již existuje, bude po ukončení následné analýzy po varování přepsán. Ostatní položky mohou zůstat nevyplněny. Dále v této obrazovce klikneme na Send Method. Tím se odešlou pracovní podmínky uvedené ve zvolené metodě z počítače do chromatografu. Chromatografický systému se pak přepne ze stavu standby do pracovního režimu podle těchto podmínek. ozběhne se čerpadlo, degaser mobilní fáze, a zapne se deuteriová lampa detektoru. V okně Device Monitor ověříme, zda parametry experimentu odpovídají požadovaným hodnotám: průtok 0,1 ml min -1, složení mobilní fáze 80% methanolu (složky B), detekční vlnová délka 220 nm. Nakonec ověříme, že v otevřeném okně se schématem HPC (v hlavním menu Clarity) je v dolní části nápis Waiting. Tím je systém připraven k prvnímu nástřiku. Úprava pracovních podmínek chromatografu Pokud je třeba změnit pracovní podmínky chromatografu, jako je průtok či složení mobilní fáze nebo detekční vlnová délka, upravíme nejprve aktuální parametry metody v příslušných sekcích nabídky Method ( Event Table, Measurement, Acquisition, Ingtegration, Calculation a Advanced a Thermostat Control ). Tyto sekce jsou rovněž přístupné ze sekce Method/C Control, v níž se nastavuje průtok a složení mobilní fáze. Pracovní podmínky chromatografu se nastaví podle změněných podmínek po příkazu Send Method v sekci C Control nebo v okně Single Analysis. Nástřik vzorku na kolonu a ukončení analýzy Přestavováním páky smyčkového dávkovače je smyčka tvořená nerezovou kapilárou buď vřazována, nebo vyřazována z toku mobilní fáze na kolonu. Je použita smyčka o celkovém objemu přibližně 20 µl. Přesvědčíme se, že v okně Clarity je v jeho dolní části nápis Waiting. Do injekční stříkačky nabereme definovaný objem roztoku, který chceme nastříknout na kolonu. Stříkačku opatrně vsuneme do nástřikového otvoru v pravé horní části čelní stěny ventilu až na doraz. Páku ventilu rychle přestavíme z polohy Inject do krajní polohy oad. Potom píst stříkačky zvolna stlačíme a tak přesuneme její obsah do smyčky. Následně rychle přestavíme páku zpět do polohy Inject. Tím se smyčka vřadí zpět do toku mobilní fáze a její obsah se tak nastříkne na kolonu. Spínací kontakt na ventilu současně automaticky spustí záznam chromatogramu programem Clarity. Přesvědčíme se o tom pohledem na hlavní okno Clarity se schématem HPC. Původní nápis Waiting se změnil na unning a nalevo od nápisu je zobrazován aktuální čas od provedení nástřiku. Potom vyjmeme stříkačku z ventilu, promyjeme ji několikrát methanolem a pak prostříkneme několikrát methanolem i dávkovací ventil, aniž bychom přitom páku ventilu kamkoliv přesunovali. Důležité: páku ventilu vždy přestavujeme sice opatrně, ale co nejrychleji, protože mezi krajními polohami páky je průtok mobilní fáze částečně přerušen a toto přerušení by mělo být co nejkratší.

Sběr dat lze ukončit stisknutím ikony STOP (symbol dopravní značky Stop). Po ukončení analýzy se může (podle toho jak je datastanice nastavena) automaticky otevřít okno Chromatogram Window, ve kterém je zobrazen právě získaný chromatogram. Detektor cirkulárního dichroismu JASCO CD-2095 Tento chromatografický detektor umožňuje měřit současně s absorbancí roztoku v průtočné kyvetě také jeho cirkulární dichroismus. Pracuje v rozsahu vlnových délek 220-420 nm se spektrální šířkou pásu 20 nm (na vlnové délce 365 nm). Jeho optické schéma je na Obr. 6. Jako zdroj záření je v tomto detektoru použita vysokotlaká výbojka obsahující xenon a rtuťové páry. Její spektrum obsahuje kromě kontinua tepelného záření obloukového výboje intenzivní čáry spektra rtuti. Záření z výbojky je kolimátorem soustředěno do polarizátoru typu Glan-Taylorova hranolu, který izoluje z dopadajícího záření lineárně polarizovanou složku. Záření dále prochází monochromátorem (Monk-Gilliesonova montáž), jehož mřížka má 1200 vrypů na mm. Obr. 6 Optické schema detektoru JASCO CD-2095 Víceméně monochromatické lineárně polarizované záření déle dopadá na fotoelastický modulátor. (Srv. http://www.hindsinstruments.com/knowlege-center/technology-primer) Toto zařízení využívá dvojlomu vytvořeného v některých materiálech při jejich deformaci. V důsledku dvojlomu se mohou lineárně polarizované paprsky, jejichž rovina polarizace je na sebe vzájemně kolmá, pohybovat různou rychlostí a tak získat vůči sobě fázový posun. Nabude-li fázový posun hodnotu ±π/4, vznikne při stejné amplitudě obou složek pravotočivě resp. levotočivě kruhově polarizované záření. Ve fotoelastickém modulátoru je deformace vytvářena periodicky piezoelektrickým krystalem řízeným střídavým napětím. Toto napětí je voleno tak, aby při maximálním stlačení a roztažení materiálu byl vytvořen právě fázový posun ±π/4. Procházející paprsek se tak periodicky mění v rozmezí pravotočivého a levotočivého kruhově polarizovaného záření. Takto modulované záření prochází průtočnou kyvetou a dopadá na fotodiodu. Pokud kyveta neobsahuje látku, která rozdílně absorbuje pravotočivě a levotočivě kruhově polarizované záření, mění se signál fotodiody pouze podle celkové

absorbance roztoku v kyvetě. Jakmile je v kyvetě pravotočivé a levotočivé záření absorbováno různě, objeví se na signálu fotodiody střídavá složka, z níž je možno vyhodnotit rozdíl absorbancí pro pravotočivé a levotočivé záření a tím i elipticitu. Střední hodnota signálu slouží i v tomto případě k určení celkové absorbance roztoku v průtočné kyvetě. Detektor má tedy dva výstupy, jeden pro CD signál a druhý pro celkovou absorbanci. Analogový výstup CD signálu pro integrátor je na detektoru JASCO CD-2095 kalibrován (vodným roztokem d-kamforsulfonátu amonného) tak, aby napětí 1V odpovídala elipticita 1, na výstupu pro celkovou absorbanci odpovídá napětí 1 V absorbanci A=1. Průtočná kyveta detektoru má optickou délku 25 mm a její objem je 44 µl. Pracovní návod 1. Ověřte činnost kapalinového chromatografu Zadaný vzorek (roztok derivátů propanové kyseliny) naředíme (smícháme 800 µl methanolu, 30 µl vzorku a 200 µl vody). S kolonou pro separaci s obrácenými fázemi zvolíme složení mobilní fáze 0,1% mravenčí kyselina ve vodě methanol 90:10, průtok 0,1 ml min -1 a detekční vlnovou délku 220 nm. Několikrát propláchneme stříkačku a smyčku dávkovacího ventilu methanolem. Poté, co se stabilizuje základní linie, nastříkneme na kolonu 1 µl zředěného vzorku. Stříkačku důkladně propláchneme methanolem. Zaznamenáme a uložíme chromatogram (doba záznamu asi 15 min). 2. Separujte isokraticky zadanou směs derivátů propanové kyseliny na koloně pro separaci s obrácenými fázemi pro tři složení mobilní fáze Opakujeme separaci za stejných podmínek jako v předchozím kroku. Pokud se chromatogram nebude lišit, je chromatografický systém již ostatečně stabilizován. Pak nastavíme složení mobilní fáze v poměru 85:15 a po 5 minutách stabilizace podmínek nástřik opakujeme. Postup opakujeme pro složení mobilní fáze v poměru 80:20. 3. Separujte isokraticky zadanou směs derivátů propanové kyseliny na chirální koloně pro tři složení mobilní fáze V chromatografu nahradíme kolonu pro separace s obrácenými fázemi chirální kolonou. Nastavíme stejné podmínky jako v bodu 1 a po stabilizaci základní linie nastříkneme naředěný vzorek. Dále postupujeme stejně jako v bodu 2. 4. Pro vybrané složení mobilní fáze opakovaně izolujte frakce ze separace na chirální koloně Na základě měření v bodu 3 zvolíme složení mobilní fáze, které bude vhodné pro izolaci komponent obsažených ve vzorku. Po stabilizaci základní linie nastříkneme na kolonu 5 µl původního vzorku. Během separace budeme jednotlivé významné komponenty jímat do předem připravených vialek. Nástřik a izolaci budeme opakovat ještě alespoň dvakrát. Do jedné z vialek zachytíme rovněž samotnou mobilní fázi pro záznam základní linie při měření spekter. 5. Změřte absorpční spektra zachycených frakcí na spektrometru CAY 50 Na spektrometru CAY 50 nastavíme podmínky měření (rozsah 200-400 nm, krok měření 0,5 nm a dobu měření jednoho bodu 0,1 s, režim měření s korekcí základní linie). Do čisté křemenné kyvety spektrometru vneseme samotnou mobilní fázi, vložíme do spektrometru a zaznamenáme základní linii. Poté postupně do kyvety vneseme jednotlivé najímané frakce a zaznamenáme jejich spektra. Při těchto měřeních je automaticky odečítána předem změřená základní linie. Je důležité, aby měřící paprsek ve spektrometru procházel nerušeně roztokem v kyvetě a nedopadal na stěnu nebo dno kyvety nebo při malém objemu roztoku na jeho hladinu. To se většinou projeví jako zvýšená úroveň absorpce na vlnové délce 400 nm, kde by absorbance měla být blízká nule, pokud měřený roztok není barevný. 6. Pro vybrané složení mobilní fáze separujte zadanou směs derivátů propanové kyseliny na chirální koloně s detekcí detektorem JASCO CD-2095

Kapilárou propojíme výstup mobilní fáze z detektoru chromatografu Agilent se vstupem detektoru JASCO CD-2095. Ukončíme program Clarity a spustíme program aunch Manager. Zde zvolíme konfiguraci přístroje Jasco_CD a poté, co se spustí program Clarity zvolíme příkazem File/oad Method metodu UVsCD.met a aktivujeme ji příkazem Send Method. Na detektoru JASCO CD- 2095 nastavíme detekční vlnovou délku 220 nm (postupný stisk kláves EDIT/ENTE, 220 a a EDIT/ENTE na klávesnici detektoru). Na kapalinový chromatograf pak nastříkneme původní vzorek a zaznamenáme chromatogram registrovaný detektorem chromatografu Agilent a dále CD a UV chromatogramy registrované detektorem JASCO CD-2095. 7. Separujte zadanou směs derivátů propanové kyseliny na chirální koloně s detekcí detektorem JASCO CD-2095 se současným záznamem CD a UV spekter Na kapalinový chromatograf znovu nastříkneme původní vzorek a během separace zaznamenáme nejprve základní linii pro spektra měřená detektorem JASCO CD-2095 v oblasti, kde není eluována žádná složka vzorku. Poté zaznamenáme do jednotlivých registrů detektoru spektra jednotlivých eluovaných komponent vzorku. Je výhodné zaznamenat alespoň jedno spektrum na náběžné hraně píku a druhé na sestupné hraně píku. Doba záznamu spekter detektorem JASCO CD-2095 je poměrně dlouhá (asi 40 s) a tak se obsah kyvety detektoru během záznamu spektra významně mění. Pokud se ale zprůměruje měření na vzestupné a sestupné hraně píku, tento vliv změny složení roztoku v kyvetě během měření se částečně potlačí. Pro záznam spektra CD (a absorpčního spektra) se na detektoru JASCO CD-2095 stiskne tlačítko SCAN, čímž detektor přejde do režimu snímání spekter. Na výstupech z detektoru je stále aktuálně měřený CD a UV signál. Před záznamem spektra se stiskem kláves n, EDIT/ENTE, kde n je celé číslo od 0 do 9, zvolí paměťový registr detektoru, kam se má následně změřené spektrum uložit. Stiskem klávesy POG UN se zahájí měření spektra a jeho ukládání do paměti detektoru. Paměťový registr 0 je reservován pro spektrum základní linie, která je při exportu jednotlivých spekter od každého spektra automaticky odečítána. Do počítače jsou spektra z paměti detektoru přenášena (stejně jako chromatogramy) analogovým signálem, který je digitalizován datastanicí Clarity. Pro export spektrálních dat ukončíme program Clarity a spustíme program aunch Manager. Zde zvolíme konfiguraci přístroje SpectraCD a poté, co se spustí program Clarity zvolíme příkazem File/oad Method metodu CDSpectra.met a aktivujeme ji příkazem Send Method. Pak zvolíme jméno souboru pro uložení spektrálních dát, spustíme záznam dat programem Clarity a na detektoru JASCO CD-2095 postupně exportujeme spektra z jednotlivých registrů. Na detektoru zvolíme režim exportu dat stiskem SHIFT a SCAN. Kurzorem nebo z číselné klávesnice zvolíme číslo registru (0 až 9), ze kterého má být spektrum exportováno, volbu potvrdíme stiskem EDIT/ENTE a export spektra ze zvoleného registru zahájíme stiskem POG UN. Spektra v rozsahu 220 až 420 nm jsou exportována rychlostí 5 nm s -1 a jsou uvedena a zakončena konstantní úrovní signálu v délce 2 s. Protože ve zvolené metodě registruje program Clarity 5 hodnot za 1 s, jsou v souborech jednotlivé hodnoty od sebe vzdáleny právě o 1 nm.