Využití antibakteriálních testů v textilním průmyslu Mgr. Irena Šlamborová, Ph.D. Fakulta Přírodovědně-humanitní a pedagogická, katedra chemie
OBSAH: 1. Stavba a fyziologie bakterií. 2. Kultivace bakterií, kultivační média. 3. Klasifikace bakterií. 4. Antibiotika. 5. Bakteriální kmeny používané k testům. 6. Testovací normy a metody. 7. Možnosti, výhled.
Bakterie (Bacteria) 0,2 2 mikrometry
Množení a růst bakterií A lag-fáze a fáze zrychlujícího se růstu B exponenciální fáze C stacionární fáze D postupné odumírání buněk
Kultivace bakterií Fyzikálně-chemické podmínky 1. Přítomnost vody vstřebávání živin 2. Optimální ph 7,2 7,4 3. Isotonie kultivačního prostředí přídavkem NaCl (většinou 0,5%) 4. Optimální plynná atmosféra (aerobní a anaerobní bakterie)
Kultivace bakterií 5. Optimální teplota minimum nejnižší teplota, kdy se zastavuje růst maximum nejvyšší teplota, kdy se růst zastaví, ale při ochlazení na nižší teplotu dále pokračuje optimum tepelný bod, při kterém je rychlost růstu maximální: 30 C až 40 C (v laboratořích 37 C) viz růstová křivka 6. Nároky bakterií na živiny
Mikrobiologické půdy 1. Kultivační půdy tekuté základem je masopeptonový bujón, pepton, cukry,... + soli, vitamíny 2. Kultivační půdy pevné přidává se 1-2% agar nalévá se do sterilních Petriho misek základem je masopeptonový agar přídavkem 5% ovčích erytrocytů vzniká tzv. krevní agar
Mikrobiologické půdy 3. Tkáňové kultury některé bakterie se množí pouze v buňkách (riketzie, chlamydie)
Agarové půdy
Krevní agary s bakteriálními koloniemi
Očkování kultivačních půd Očkování (inokulace) - přenesení kultury do tekuté půdy nebo na pevnou půdu - pevné půdy po zaočkování zředěnou bakteriální kulturou zasušíme v termostatu po dobu 15 30 minut při teplotě 37 C
Očkování kultivačních půd
Ředění bakterií Koncentrace Odebrání Získaná koncentrace z 10 8 CFU/ml z 10 6 CFU/ml z 10 5 CFU/ml z 10 3 CFU/ml 0,1 ml do 10 ml f.r. 10 6 CFU/ml 1 ml do 9 ml f.r. 10 5 CFU/ml 0,1 ml do 10 ml f.r. 10 3 CFU/ml 0,5 ml do 4,5 ml f.r. 10 2 CFU/ml f.r. fyziologický roztok: 8,5 g NaCl/1000 ml destilované vody CFU Colony Forming Units
Barvení bakterií podle Grama 1. grampozitivní (G+) modře zbarvené 2. gramnegativníg-) červeně zbarvené Princip barvení: vychází z odlišného složení buněčné stěny u G- obsahuje lipopolysacharidy a proto při jejich odbarvování ethanolem dochází k vyplavení komplexu krystalové violeti s jodem z cytoplasmy bakterie
Barvení bakterií podle Grama G+ mají pevnější buněčnou stěnu, a proto se výše uvedený komplex nevyplavuje Příklady: G+ : Staphylococcus aureus G - : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae
Grampozitivní bakterie
Gramnegativní bakterie
Gramovo barvení (VLAS) 1. roztok krystalové violeti 30 sekund 2. barvivo slít opláchnout vodou a převrstvit na 30 sekund Lugolovým roztokem 3. slít a opláchnout vodou 4. odbarvit ethanolem nebo acetonem (1-2 sekundy, dokud barvivo odtéká) 5. opláchnout tekoucí vodou 6. dobarvit safraninem 60 sekund 7. opláchnout tekoucí vodou, usušit na vzduchu
Hemolýza bakterií - jedná se o rozpouštění krevního barviva na krevním agaru v okolí bakteriálních kultur - beta hemolýza - úplné rozpuštění hemoglobinu (projasnění na krevním agaru) - alfa hemolýza(viridace) neúplná přeměna hemoglobinu na methemoglobin
Beta hemolýza
Hemolýza
Klasifikace bakteriálních kolonií Během inkubace se na agarové půdě za vhodných podmínek z každé bakteriální buňky vyvine 1 kolonie. Vzhled kolonie je charakteristický pro určitou skupinu nebo pro druh bakterie. Hodnocení kolonií důležitý diagnostický znak
Klasifikace bakteriálních kolonií 1. TVAR okrouhlá, nepravidelná,... 2. PROFIL plochý, vypouklý,... 3. OKRAJE rovné, zvlněné,... 4. POVRCH lesklý, hladký,... 5. TRANSPARENCE průhledná, průsvitná,... 6. BARVA bezbarvé, žluté,... 7. ZMĚNY OKOLÍ posuzujeme hemolýzu 8. KONZISTENCE mazlavá, drobivá,... 9. ZÁPACH fekální, hnilobný,... 10. VELIKOST tečkovité nebo průměr
ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINKY BAKTERIOCIDNÍ ÚČINEK bakterie jsou usmrceny účinkem látky, která je přítomna v testovaném materiálu BAKTERIOSTATICKÝ ÚČINEK množení bakterií je inhibováno (zastaveno) účinkem látky, která je přítomna v testovaném materiálu
ANTIBIOTIKA 1. Peniciliny v molekule beta-laktamový kruh (penicilin G, V, oxacilin, ampicilin, augmentin,...) + mají baktericidní účinek, nízkou toxicitu, dobrou snášenlivost - nedostatečně široké spektrum bakterií, krátkodobý účinek, možnost alergií a kožních problémů
ANTIBIOTIKA 2. Cefalosporiny laktamová antibiotika (cefalotin, cefaloridin, cefalexin, cefixim,...) + výborné baktericidní účinky a široké spektrum bakterií - možnost vzniku alergie, poškození ledvin
ANTIBIOTIKA 3. Tetracykliny - bakteriostatická antibiotika s velmi širokým spektrem působení působí na G+ i G- bakterie - negativa: gastrointestinální potíže, hepatotoxicita, alergie, ukládání do zubů, kostí (kontraindikace gravidita, děti do 8 let)
ANTIBIOTIKA 4. Chloramfenikol - širokospektré antibiotikum, proniká rychle do mozkomíšního moku - negativa: vzácně útlum kostní dřeně + porucha krvetvorby, kontraindikace u novorozenců a nedonošených dětí
ANTIBIOTIKA 5. Makrolidy (erytromycin, klaritromycin,...) - bakteriostatický účinek na G+ a G- - problémy s GAT, kontraindikace při onemocnění jater 6. Sulfonamidy(biseptol, septrin) - bakteriostatický účinek, dobře se koncentrují v moči i ve tkáních dýchacích cest - při používání: dostatek tekutin bez kyselého ph, aby nedošlo k vysrážení krystalků sulfonamidů v ledvinách
BAKTERIÁLNÍ KMENY
CCM Czech Collection of Microorganisms - klasifikovaná sbírka mikroorganismů - bakterie, kvasinky - Masarykova univerzita, PřF Česká sbírka mikroorganismů uchovává pouze kmeny rizikové skupiny 1 a 2 ve smyslu mezinárodních standardů hodnocení patogenity, testované kmeny jsou patogenní, patří do skupiny č. 2
Escherichia coli Escherichia coli CCM 2024, ATCC 9637 - gramnegativní, aerobní tyčinkovitá bakterie - součást mikroflóry tlustého střeva (vitamíny K a B12) - jako patogenní kmeny: a) extraintestinální onemocnění b) intestinální onemocnění
Escherichia coli
Staphylococcus aureus, MRSA Staphylococcus aureus CCM 229, ATCC 9637 a MRSA CCM 4223 - grampozitivní kokovitá bakterie - fakultativně anaerobní - rezistence teplota nad 55 C/ 30 minut - výskyt: nosní přepážka, kůže - široké spektrum onemocnění a intoxikace - (abscesy, furunkulózy, meningitidy, )
Staphylococcus aureus
MRSA
Acinetobacter baumanii Acinetobacter baumanii CCM 2265 - gramnegativní zaoblená tyčinkovitá bakterie - aerobní bakterie - výskyt: půda, voda, odpadní voda - původce nosokomiálních a kožních infekcí
Acinetobacter baumanii
Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae CCM 2318 - gramnegativní tyčinkovitá bakterie - fakultativně anaerobní, opouzdřená polysacharidovým pouzdrem - na pouzdře 70 kapsulárních antigenů - výskyt: půda, voda, dýchací cesty, trávicí trakt - hnisavé meningitidy, sepse a kožní záněty
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa/ccm1959 - gramnegativní, aerobní tyčinkovitá b. - odpadní vody, půda, stolice domácích zvířat a lidí - nemocniční patogenní kmeny vysoce virulentní a rezistentní na antibiotika
Pseudomonas aeruginosa
Proteus mirabilis Původce mnoha endogenních infekcí močové, hnisavé abscesy na kůži. Vysoce rezistentní k antibiotikům.
Candida albicans - kvasinka Komensál u zdravého člověka na kůži a sliznicích. Někdy zvýšení virulence invaze kvasinek do tkání. Léčba kortikosteriody, imunosupresiva a cytostatika.
Candida albicans kvasinkové infekce
Testovací metody a normy
1. ČSN EN ISO 20645 TESTOVACÍ METODA NORMA: Testy byly provedeny dle ČSN EN ISO 20645 Plošné textilie zjišťování antibakteriální aktivity zkouška šíření agarovou destičkou. Výsledky testů jsou dle výše uvedené normy hodnoceny následovně: Inhibiční zóna (mm): A. >1 mm až inhibiční zóna do 1 mm DOBRÝ ANTIBAKTERIÁLNÍ EFEKT B. 0 mm LIMIT ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINNOSTI ( bez inhibiční zóny, pouze omezené kolonie, růst téměř zcela potlačen), neboť stejně dobře 0 růst uvádí hranice účinnosti C. 0 mm NEDOSTATEČNÝ EFEKT
VÝSLEDKY TESTOVÁNÍ Čistá halo zóna
2. AATCC Method 100 An American Standard 1993 (2008) AATCC Method 100 kvantitativní metoda, je hodnoceno % redukce bakterií R(%) = 100.(B A)/B A standard (neupravený vzorek) B upravený vzorek (s úpravou) výsledkem je počet znovu obnovených bakteriálních kolonií
2. AATCC Method 100 An American Standard 1993 Jednotlivé bakteriální kolonie
2. AATCC Method 100 An American Standard 1993 (revize metody 2009) Jednotlivé bakteriální kolonie + hemolýza
3. AATCC Method 147 An American Standard 1993 AATCC Method 147 kvalitativní metoda - je hodnocena halo zóna (zóna zábrany růstu bakterií) W= (T-D)/2 [mm ] 2 T celkový rozměr standardu D celkový rozměr upraveného vzorku
AATCC Method 147 An American Standard 1993 Halo zóny
AATCC Method 147 An American Standard 1993 Negativní výsledek bez známky halo zón
4. Testování na pevných substrátech Sklo, keramika, kovy, plasty, Nanést určitý objem (koncentrace bakteriální suspenze), vystavit např. UV záření nebo ponechat na světle (zářivka) V určitých intervalech odběr (cca 200 300 mikrolitrů) vyočkovat na bakteriální půdu kultivace Hodnotíme počet znovu obnovených bakteriálních kolonií
Nové možnosti
Chitosan + tetracyklin (E.coli, S. A.)
Křemičitá nanovlákna + tetracyklin (E.coli, S.A.)
PVB + tetracyklin (E.C., S.A.)
POZITIVA NANOVLÁKENNÝCH OBVAZŮ 1. Kopíruje ránu, nezatěžuje jí 2. Snadná výměna a aplikace 3. Kontaktní účinek antibiotika přímo do rány nenaruší vnitřní homeostázu těla pacienta
Sol-gel metoda Konstrukce inteligentních obvazů metoda sol gel Zabudování stříbra a dalších látek do různých textilních substrátů touto metodou Stabilita zabudovaných látek
Princip metody sol-gel Záměna kationtů dle schématu Si OH+Ag + Si O Ag+H + Obecný postup alkoxid + organické rozpouštědlo polykondenzací na SOL dále na GEL odpařit rozpouštedlo, dále tepelně zpracovat = vstvy Ag
Výhody sol-gel metody 1. Schopnost tvořit vrstvu na různých substrátech (bavlna, viskóza, len, ) 2. Různorodost a variabilita přísad (různé vlastnosti vrstev) 3. Stabilita vpravovaných přísad 4. Nízká investiční a energetická náročnost
Příklad testování S. aureus 4. 3. 1. 2. 1. Bavlna + Ag 2. Fotochemicky upravená bavlna + Ag 3. Nanovlákna + Ag 4. Viskóza + Ag
Děkuji za pozornost