ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky TÝMOVÝ PROJEKT. 2012 Marta Němečková

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky TÝMOVÝ PROJEKT 2012 Marta Němečková 1

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky Měření povrchu cévních stentů (pokrytých NCD) technikou skenovací elektronové mikroskopie SEM Measurement of vascular stents surface (coated with NCD) using scanning electron microscopy technique SEM TÝMOVÝ PROJEKT Vedoucí projektu: Prof. RNDr. Miloš Nesládek, CSc.,HDR Student: Marta Němečková leden 2012

Týmový projekt Charakterizace povrchu cévních stentů pokrytých biokompatibilní vrstvou nanokrystalického diamantu (NCD) (hlavní název pro celý tým) Měření povrchu cévních stentů (pokrytých NCD) technikou skenovací elektronové mikroskopie SEM (dílčí název pro jednoho studenta) Measurement of vascular stents surface (coated with NCD) using scanning electron microscopy technique SEM Podrobně se seznamte s technikou skenovací elektronové mikroskopie SEM (Scanning Electron Microscopy) včetně provedení rešerše historického vývoje tohoto zobrazovacího a měřicího přístroje. Popište metodu zobrazení povrchu vzorků pomocí skenovacího elektronového mikroskopu a charakterizujte jeho hlavní zobrazovací parametry. Pomocí SEM ve Fyzikálním ústavu AV ČR (FZÚ) pořiďte elektronové snímky povrchu cévních stentů pokrytých biokompatibilní vrstvou NCD (NanoCrystalline Diamond). Částečně se zaměřte také na ve FZÚ nově připravovaný typ nerezových stentů s povrchem modifikovaným titanovou nanovrstvou (nanesenou magnetronovým naprašováním). Vyhodnoťte morfologii (homogenitu, souvislost pokrytí, hrubost, praskliny, atd.) povrchu takto studovaných stentů. Konzultujte výsledky s pracovníky 3. lékařské fakulty UK, kteří stenty medicínsky testují. Následně sepište rešerši tématu a hlavní získané výsledky měření (včetně jejich vyhodnocení) do zprávy o týmovém projektu. Student: Marta Němečková Vedoucí: Prof. RNDr. Miloš Nesládek, CSc.,HDR Konzultanti: Ing. František Fendrych, Ph.D. RNDr. Aleš Jäger, Ph.D. As.MUDr. Viktor Kočka, FESC Doporučená literatura [1] Informace o SEM podle Wikipedie, atd. [2] F.Fendrych, A.Taylor et al.: Growth and characterization of nanodiamond layers prepared using the plasma-enhanced linear antennas microwave CVD system, J. Phys. D.: Appl. Phys. 43 (2010) 374018. [3] S.Koizumi, C.E.Nebel, M.Nesládek; Physics and Applications of CVD Diamond; Wiley-WCH Weinheim 2008, ISBN 978-3-527-40801-6. Datum zadání: 14. října 2011 Datum odevzdání: 15. prosince 2012 V Kladně dne 14. října 2011 prof. Ing. Peter Kneppo, DrSc. vedoucí katedry

Anotace Diamant jako velmi biokompatibilní nerost, se v poslední době začal využívat i k medicínským účelům a to například k pokrývání stentů. Stenty jsou kovové výztuhy poškozených cév a proto nesmí být tělu toxické. Používání kovových stentů provázely určité komplikace ve formě restenóz, a proto se začal používat nanokrystalický diamant pro pokrytí stentů. Takto upravené stenty totiž způsobovaly mnohem méně infekcí a lépe se adaptovaly na vnitřní prostředí těla. My jsme upravovali nerezový stent a to nejprve tak, že jsme magnetronovým naprašováním nanesli tenkou vrstvu Titanu a na ní jsme následně nechali vyrůst nano vrstvu diamantu. Diamond is a biocompatible mineral. In recent years diamond is used for medical purposes like covering the stents. Stents are metal tubes that are inserted to damaged vessels, because of that they can not be toxic for human body. Some complications grow up by using metal stents like restenosis, because of that the nanodiamond was used for covering the stents. Stents with nanodiamond caused fewer infections and they adapted better to vessel issue. We worked with rustproof stent. First we used magnetronic sputtering for application of Titan and second we let the diamond grow up on the surface of it.

Poděkování Tímto bych chtěla vyjádřit díky panu doktoru F. Fendrychovi, který mi byl velmi nápomocen při práci na tomto týmovém projektu. Děkuji za poskytnuté rady, materiály i vedení a zvláště za umožnění účastnit se na programech Fyzikálního ústavu AV ČR.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem.. vypracovala samostatně a použila k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné zprávě. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu 60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon). V. dne. podpis ii

Obsah Seznam obrázků... iv Úvod... 1 1. Stenty... 2 1.1 Historie stentů... 2 1.2 Typy stentů... 3 1.3 Koronární stenty... 3 2 Magnetronové naprašování... 5 3 Diamant... 6 3.1 Aplikace v biomedicíně... 6 3.2 Nanášení Diamantu... 6 4 Mikroskopie... 8 4.1 Historie elektronového mikroskopování... 8 4.2 SEM... 8 4.2.1 Princip... 8 4.2.2 Faktory ovlivňující kvalitu elektronového obrazu:... 10 5 Experimentální část... 11 Závěr... 14 Použité zdroje... 15 iii

Seznam obrázků Obrázek 1: Rastrovací elektronový mikroskop princip 10 Obrázek 2: Spin coater 11 Obrázek 3: PELMWCVD 11 Obrázek 4: Antény uvnitř zařízení 11 Obrázek 5: Pohled dovnitř zařízení 11 Obrázek 6: Koronární stent pokrytý diamantem 12 Obrázek 7: Přiblížený stent 12 Obrázek 8: Povrch stentu 12 Obrázek 9: Pozorování řezu pod úhlem 30 12 iv

Úvod Okolo 45% lidí dnes umírá na choroby s oběhovou soustavou.[5] Velkým problémem kromě trombóz je v tomto oboru i ucpávání cév a jejich výdutě, které hrozí prasknutím. Aby nedocházelo ke zužování průsvitu cév, ať už z jakýchkoli příčin, používá lékařský obor angiografie balónky, které se katétrem zavedou do cévy a v místě jejího zúžení se nafouknou a obnoví tak její průchodnost. U závažnějších případů se používají kovové stenty, které mají udržet cévu ve správném tvaru a flexibilitě. Problémem stentů ale zůstávaly infekce a restenóza cév, které působili smrtelné komplikace. Proto se hledali nové materiály, které by tomuto předcházeli. Po titanu se stále více začíná uplatňovat diamant, který svým chemickým složením a biokompatibilitou dokázal velmi redukovat problém infekcí a velmi dobře se adaptuje na povrch cévní stěny. Jeho charakteristiky po nanesení na nerezový stent jsou cílem této práce. 1

1. Stenty Stenty jsou zdravotnické přístroje, které se vkládají do cévního řečiště tak, aby vyztužili poškozenou cévu. Z toho také plynou jejich vlastnosti. Jde o kovové pružinky dnes především z chirurgické oceli válcovitého tvaru, které mají zabezpečit roztažnost v podélné ose a ve smyku, ale pevnost na kolmý tlak. 1.1 Historie stentů První kdo realizoval nápad implantovat jakousi výztuhu do tepny, aby zprůchodnil ucpanou cévu, byl Ch. Dotter, který v roce 1983 zavedl kovovou spirálu do tepny zvířete. Avšak na člověku byly poprvé použity až v roce 1986, kde šlo o samoexpandabilní stent se kterým bylo potřeba během operace vyřešit mnoho problémů, jako bylo obtížné zavedení, nebo přesné umístění stentu. Operace dále komplikovaly velké výskyty akutních a subakutních uzávěrů. V následujících letech se sice dařilo odstranit problémy s umístěním, ale nadále přetrvával problém s trombotickými uzávěry a celková antikoagulace vedla k častým krvácivým komplikacím. Pacient musel být dlouho hospitalizován a náklady na celý proces byly veliké, proto se také tato metoda léčby využívala jen v nutných případech. I přes počáteční problémy se nadále pokračovalo dalším vývoji. Výsledky používání stentů byly kvůli aplikacím jen na akutní případy samozřejmě neuspokojivé, proto se kvůli pochybnostem, jestli stenty mají budoucnost, zorganizovalo několik studií dokazujících, že stenty dokážou účinně působit proti restenóze. Tyto studie porovnávali výskyt restenózy při implantaci stentu a koronární angioplastice bez stentu. Výsledkem obou studií byl významný pokles restenózy při implantaci stentu a to přibližně z původních 42 % na 32% a snížení residuální stenózy ze 35% na 19%. Tato čísla se s dnešními výsledky koronární angioplastiky s implantací stentu nedají srovnávat, ale tehdy měla za důsledek pokračování ve vývoji stentů. Během následujících tří let se postup implantace stentů výrazně změnil. A to především tím, že se pro profesionální kardiology stal běžným zákrokem a možnost použití intravaskulárního ultrazvuku po implantaci stentu ukázala, jaká je pozice stentu a reziduální stenóza. Dalším důležitým krokem bylo zjištění, že následnou postdilataci stentu, která se vytvořila u 30 % pacientů během následujících 6 měsíců po zákroku, se podaří snížit vysokým tlakem 14 20 atm. nepoddajného balónku. Tento tlak dokonale přitlačil stent ke stěně cévy. Mimo to, že se snížila restenóza, téměř úplně vymizela subakutní trombóza a potřeba antikoagulační léčby. Úspěšnost této léčby byla 94 %, výskyt akutní nebo subakutní trombózy stentu 0,9% a komplikace během hospitalizace se pohybovaly okolo 0,3 %. Během následujících let až po současnost se úspěšnost operací dostává až k 100 %. Akutní a subakutní trombóza se téměř přestala vyskytovat a antikoagulační léčba se nahradila léky. Nejprve podávaný Walfarin se postupně nahradil kombinací Tiklopidinu, kyseliny acetylsalicilové a heparinem. Procento krvácivých komplikací se také blíží nule.[21] Však nadále se nedaří snížit úplně na minimum potencionální restenózu ve stentu. U běžných stentů stále dosahuje 15 30 %.[20] Tento problém bude lépe popsán v kapitole typy stentů, kde se pokusím poukázat na výhody a nevýhody různých typů stentů. 2

1.2 Typy stentů Ureterální stenty Ureterální stent je malá, jemná trubička dlouhá okolo 25 až 30 cm. Je umístěna v močovodu, což je svalová trubici, která kanalizuje moč z ledvin do močového měchýře. Jeden konec trubice je umístěn uvnitř ledviny, a jeden konec je umístěn v močovém měchýři. Funkcí stentu je zajištění správného odtoku moči a to buď dočasně, nejčastěji po operaci, kde se urolog obává ucpání močovodu jako reakce na poškození okolní tkáně. Další možností je v některých případech zanechat stent trvale, například při chronickém ucpávání močovodu. [19] Prostatické stenty Prostatický stent se používá k udržení průchodné močové trubice v případě prostatické obstrukce. Příčinami prostatické obstrukce může být benigní hyperplazie prostaty (nezhoubné zvětšení prostaty), která může vzniknout také akutně hned po léčbě benigní hyperplazie, rakoviny prostaty nebo po radioterapii. [18] Jícnové stenty Jícnové stenty jsou umístěny v jícnu, jejich funkcí je uvolnění stenózy jícnu tak, aby mohl člověk opět jíst a pít. Jícnový stent se používá hlavně při léčbě rakoviny jícnu. [17] Zde je vhodné dodat, že v roce 2008 byl uveden českou firmou ELLA-CS na trh zcela průlomový jícnový stent, který se momentálně používá v celé EU. [16] 1.3 Koronární stenty Těmto stentům věnuji největší část, protože se na tyto stenty zaměřuje náš experiment, a také proto, že jsou nejlepším příkladem k popisu stentů a mají ze všech druhů stentů nejdelší historii. o Lékové Stenty (DES) Tyto stenty mají v dnešní době vysoké uplatnění hlavně v koronárních stentech. Jeho funkce souvisí s obsahem léčiva nejčastěji na povrchu stentu, kde se postupně uvolňuje léčivá látka a zabraňuje tak vzniku restenózy. Tato vlastnost stentu povyšuje DES nad klasické síťované kovové stenty. Nevýhodou těchto stentů je, že osoba s DES musí změnit své životní návyky, podstoupit striktní léčebný proces, aby měl DES potřebné účinky. o Kovové stenty Tyto stenty jsou nečastěji vytvořené z roztažitelné síťoviny, neobsahují žádnou léčivou látku ani žádný jiný povlak. Tyto stenty představují první generaci stentů, dodnes patří mezi nejvíce využívané a jsou považovány za osvědčené. Mnoho lidí má implantovaný kovový 3

stent a žijí bez bolesti na hrudi. Nevýhodou těchto stentů je, že během operace je nutné použití antikoagulantů a krevních ředidel. o Bioaktivní stent Patří mezi novinky mezi stenty, je tedy biokompatibilní s lidským organizmem jeho chemickým složením. Tento stent nemá žádnou léčivou vlastnost. Jeho veliký přínos je v tom, že se na něj nemohou objevit alergické a jiné nežádoucí účinky způsobené citlivostí těla na jiné než tkáňové materiály. o Stent z umělých hmot Tento stent je alternativou ke kovovým stentům, které mohou poškodit cévy. Je vyroben z polymeru kyseliny mléčné, tento stent je v těle rozpuštěn do 24 měsíců, během této doby stent cévu roztahuje tak, aby až bude úplně rozpuštěn, byla céva dostatečně roztažená. Studie v Japonsku v Shiga Medical Center for Adults ukázala nižší restenózu než klasické kovové stenty. Velice výhodné je použití těchto stentů u malých dětí, kde by během růstu mohlo dojít k uvolnění kovového stentu a to by mohlo mít nebezpečné následky. [15] o Stenty pokryté nanokrystalickým diamantem V současnosti se díky novým pokrokům v oblasti nanotechnologií a techniky objevují nové možnosti, které dříve nebyly možné. My zaměřujeme svou pozornost na nanodiamanty, tedy spíše na tenké povrchy, složené spojitým rozložením nanokrystalů diamantu. Nanodiamanty ve formě fullerenů, tedy systematicky uspořádaných atomů uhlíku to různých útvarů, zvláště kulovitého nebo trubkovitého tvaru, mohou sloužit k přenosu léčiv přímo do buněk, nebo díky své struktuře, která zaštiťuje odolnost materiálu, i jako potahy implantabilních materiálů. Bylo potřeba zjistit toxicitu nanodiamantů v lidském organizmu. Literatura 6 odkazuje hned na dvě studie, které se výzkumem tohoto problému zabývaly. Obě měly podobné výsledky a to, že při výzkumu in vitro biokompatibility nanodiamantových částic nebyly prokázány žádné toxické vlivy na organismus. Z toho činí závěr, že diamant není pro živé buňky toxický a má tedy potenciál stát se vhodným kandidátem při využití v biomedicíně. 4

2 Magnetronové naprašování Na nerezové stenty se bude nanášet titan, který je velmi tvrdý a odolný a je prokázáno, že diamantová vrstva k němu dobře přilne. Klasické naprašování probíhá ve vakuové komoře, ve které je umístěn terč z látky, kterou chceme naprašovat. Do komory, kde se udržuje tlak asi jednotky packalu, je vstřikován pracovní plyn (např. argon). Před terčem je zapálen doutnavý výboj (nebo se používá jiný typ aktivační energie) a plyn se ionizuje. Těžké kationty jsou pak přitahovány k záporně nabitému terči a bombardují ho. Tím uvolňují do okolí atomy, které se usazují na vnitřních površích komory. Substrát (pro nás stent) se proto umisťuje těsně před terč, aby se většina odprášených atomů uchytila na substrátu. Zlepšit rovnoměrnost pokrytí lez například také rotací substrátu.[11] Magnetronové naprašování, jak již název napovídá, je zdokonalenou formou této metody a používá se při ní navíc magnetické pole. To v blízkosti terče vytvoří elektromagnety nebo permanentní magnety (magnetron). Takto působí na elektrony ionizovaného plynu magnetické síly a ty jsou tedy nuceny pohybovat se po delší trajektorii v blízkosti terče, což je zajištěno tzv. Lorentzovými silami, které určují elektronům v magnetickém poli trajektorii po šroubovici. Pohybující se elektrony mají větší možnost ionizovat další molekuly pracovního plynu. Toto uspořádání umožňuje pracovat za nižšího tlaku (desetiny pascalu) a napětí (jednotky Voltů). To je důležité pro širší možnost aplikací a pro kvalitu nanášené vrstvy.[11] Reaktivní magnetronové naprašování obohacuje tuto metodu ještě o možnost naprašování oxidů nebo nitridů rozprašovaného materiálu. To můžeme dosáhnout tím, že do vstřikovaného plynu přimísíme reaktivní směs například kyslík, dusík, ale i jiné plyny.[11] Takto lze naprašovat vodivé materiály, ale pokud použijeme vysokofrekvenční pulzy elektrického signálu, můžeme naprašovat i nevodivé materiály, jako jsou různé keramiky apod. Problém spočívá v nabíjení nevodivého povrchu materiálu, pokud tedy přivedeme k materiálu proud, můžeme materiál jednou polaritou rozprašovat a druhou vybíjet. [11] Hlavní výhodou této metody je možnost nanášení i těžkotavitelných materiálů a to dokonce při zachování poměrů zastoupení jednotlivých složek ve slitinovém terči. Zároveň je možná homogenní depozice na větších plochách.[11] 5

3 Diamant Diamant jako nejtvrdší nerost na planetě je znám hlavně pod dvěma využitími. Je to zaprvé využití v klenotnictví, kde je pro jeho čistotu a vzácnost symbolem moci a bohatství, zadruhé je velmi významným pomocníkem ve výrobě, kde se využívá hlavně jeho tvrdosti. V posledních letech se ale výzkum zasloužil o identifikaci a popsání dalších významných vlastností, které jeho využití náhle alespoň teoreticky zmnohonásobili. Díky jeho stabilitě, elektrické a teplotní vodivosti, dopovatelnosti a světelné transparentnosti v širokém spektru elektromagnetického záření, mohou přinejmenším 3 nové obory nyní vývojem v tomto směru získat. Jde o medicínu, energetiku a informační technologie. [7] 3.1 Aplikace v biomedicíně Medicínská využití předpokládají především biokompatibilitu a stálost ve vnitřním prostředí lidského těla. To inertní diamant splňuje. Navázání na tkáň pak probíhá pomocí vodíků a kyslíků, které jsou zakončením uhlíkového řetězce, který tvoří diamant. Tyto prvky významně ovlivňují vlastnosti povrchu vůči okolí. Tvoří silné dipóly, ovlivňují povrchovou vodivost z velmi vodivého na téměř netečný, a jestli je diamant hydrofobní nebo hydrofilní. Chemicky se také dají zaměnit za jinou funkční skupinu a tak můžou sloužit některým chemickým reakcím. Například se tak dají použít pro vnášení organických molekul do makromolekul jako je DNA. Na těchto površích také velmi dobře rostou buňky všech typů a to zvláště na těch částech, které končí kyslíkovým atomem. [8] Mezi více známé aplikace pak patří pokrývání stentů nebo implantátů, u kterých je potřeba velká mechanická odolnost jako třeba umělé náhrady kloubů a podobně, nanovrstvou diamantu. Bohužel na rozdíl od pokrývání relativně malých stentů, jsou právě velké rozměry zatím překážkou k tomu, aby se na umělých implantátech toto pokrývání realizovalo. Vytváří se také čipy do sítnice oka, které mají nahradit ztrátu části zraku při tunelovém vidění. [9] K těmto účelům se používají různé formy diamantu, od pevného diamantu, přes diamantový prach až k nanokrystalickým vrstvám. [6] Tato práce se zabývá hlavně právě posledním zmíněným typem, který je nejpraktičtější k využití v medicíně NCD (NanoCrystalline Diamond). Způsobů výroby je více, avšak v laboratoři FZÚ AV budeme používat nanášení této tenké vrstvy pomocí plazmatického výboje. 3.2 Nanášení Diamantu V této práci je popisován stent pokrytý nanovrstvou diamantu, jak se ale dá stent takovou vrstvou pokrýt? Jedná se o takzvané tenké vrstvy, které se dnes nanášejí nejrůznějšími způsoby a mezi nejznámější a nejčastější patří dvě metody a to PVD (physical vapour deposition) a CVD (chemical vapour deposition). [11] Chemická depozice z plynné fáze (CVD) je metoda, která používá přeměny prvku z plynné fáze na pevnou za vzniku tenké vrstvy. Obecně tento děj probíhá za nízkého tlaku v uzavřeném prostoru, kam se přivede plynná sloučenina, která obsahuje prvek, kterým chceme vytvořit tenkou vrstvu. V případě diamantu se používá metan. Tento plyn se pak snažíme disociovat různými druhy energií, podle toho, která je použita se CVD ještě dělí. Například metoda žhaveného drátu využívá k aktivaci plynu tepelnou energii, plazmochemická depozice 6

(PECVD) využívá elektrického výboje, který vytvoří plazma. V plazma se generují horké elektrony, jejichž energie stačí k disociaci plynu. Pro depozici diamantu se používá mikrovlnný plazmový výboj nebo plazmová tryska. Disociované ionty plynu se pak pohybují ve směru opačného náboje. Stačí tedy nabít substrát tak, aby se na něm usazovaly správné ionty. [14] My budeme v experimentální části používat přístroj PELMWCVD (Plasma enhanced linear microwave chemical vapour deposition), který používá právě tuto metodu. Do prostoru pro depozici se vloží stent, který nabijeme kladným předpětím. Katodu budou tvořit stěny komory. Z prostoru se vysaje vzduch a tlak se udržuje na 50-200 Pa. Dovnitř se přidá reakční směs, kterou tvoří obvykle metan, oxid uhličitý ve vzdušném vodíku. Jako zdroj aktivační energie se používá mikrovlnné vlnění, které vzniká v pulzním generátoru (nebo v magnetronu) a obdélníkovými vlnovody je vedeno do komory. Tam je vyvedeno pomocí 4 rovnoběžných antén v quartzových (křemenných) obalech, díky nimž je možné deponovat substráty již o velikosti 50 x 30 cm. Tento přístroj je ale zatím jediný na světě, který má tak velkou možnost depozice, jiná zařízení zatím dosahují maximální velikosti kolem 30 cm 2. [12] Toto je celkem problém, protože kvůli tomu nelze zatím pokrývat velké substráty. Mikrovlnné výboje vytvoří v komoře plasma a substrát, který nabijeme kladným předpětím, přitahuje ionty CH 3, CH 2, nebo CH, které se podílejí na vzniku diamantové vrstvy. Uzemněné stěny komory tvoří katodu. Změnou parametrů jako je tlak v komoře, teplota substrátu, velikost předpětí, složení plynné směsi a výkon a frekvence mikrovlnných pulzů můžeme měnit vlastnosti vrstev. [13] Na substrát, na který chceme deponovat diamantovou vrstvu, musíme nejdříve umístit tak zvaná jádra, od kterých pak diamant bude v komoře růst. To lze provést například třením o diamantový prach. My použijeme pokrytí disperzí, která již obsahuje drobná zrna diamantu. Aby se rovnoměrně rozmístili, dáme substrát do zařízení zvaného spin coater, která zajistí odstředění přebytečné disperze a tenké pokrytí. Tomuto procesu se říká seeding. Takto připravený substrát můžeme dát deponovat. Růst vrstvy je dvoufázový. Nejprve probíhá nukleace, při které vznikají jednotlivé krystalky sférického tvaru, a to buď homogenní nukleací nebo heterogenní. Homogenní nukleace znamená, že se krystalky diamantu tvoří již v plazma a pak se přichytávají na substrát, naopak při heterogenní nukleaci se uchytávají uhlíky na substrát přímo. Množství, hustota a velikost krystalů je pro každý substrát jiná. Po této fázi začíná diamant růst na těchto krystalcích, které tvoří plošky (fazety), ke kterým je difuze uhlíku z okolí větší než na jiných místech.[13] Princip vzniku diamantové vrstvy předpokládá pokrytí substrátu vodíkem. Mikrovlnné výboje tvoří radikály CH 4, CO 2 i H 2. Na povrch substrátu se naváže metanový radikál, na který se pak váže buď další metanový, nebo vodíkový radikál. Vodíkové radikály jsou v plazma velmi důležité, protože rychleji odbourávají uhlíkové vazby podobné grafitu (sp 2 ) než diamantové (sp 3 ). [13] Kyslík zvyšuje koncentraci atomárního vodíku, neboť ho během reakce vytěsňuje z metanu. [12] Pokud substrát atakuje vodíkový radikál, dojde k vzniku molekuly H 2 a volné vazby, kam se mohou vázat uhlíky tvořící C-C vazby a tím diamantovou vrstvu.[13] 7

4 Mikroskopie Mikroskopie nám pomáhá vidět věci běžným okem nerozpoznatelné a používá k tomu čočku nebo soustavy čoček, které daný objekt zvětší. Rozeznáváme několik druhů mikroskopie a jejich členění. Základním členěním je rozdělení na optické a elektronové mikroskopy. Optická mikroskopie se pak ještě dělí podle způsobu osvětlení na mikroskopii v procházejícím světle, v dopadajícím světle a inverzní mikroskopii. Speciální skupinou jsou mikroskopy elektronové, které používají k zobrazení objektů místo viditelného světla proud elektronů. Tato skupina se dělí na dvě hlavní metody a to transmisní elektronovou mikroskopii, kdy elektrony procházejí pozorovaným mikroskopem a dopadají na stínítko, nebo jiný detektor. Elektrony, které projdou, se jeví jako světlé body, některé se ale odrazí nebo zachytí v objektu a ta místa zůstávají tmavá. Druhou metodou je rastrovací elektronová mikroskopie, která je blíže popsána v následujících odstavcích. [3] 4.1 Historie elektronového mikroskopování Historie mikroskopování začíná na konci 16. století, kdy byl vynalezen první optický mikroskop. V polovině 17. století pak sestrojil několik jednočočkových mikroskopů A. van Leeuwenhoek a R. Hooke přišel již se složeným mikroskopem z více čoček. V 19. století pak vývoj velmi pokročil, ale ani nejlepší optické mikroskopy ještě nedokázaly zobrazit detaily buněk. [1] Toto se povedlo Ernestovi Ruskovi, který v roce 1931 vyrobil jako první elektronový prozařovací mikroskop, který byl založen na jiném principu a to ozařování preparátu proudem elektronů. [3] První rastrovací elektronový mikroskop zkonstruoval V. K. Zworykin a kol. v roce 1942. [4] O krok dál se dostal ještě C. W. Oatley, který představil první komerčně vyráběný rastrovací (skenovací) mikroskop (SEM scanning elektron microscope).[2] 4.2 SEM 4.2.1 Princip SEM pracuje na bázi odražených elektronů od povrchu preparátu, které snímá detektor, a jsou zobrazovány na monitoru. Na rozdíl od transmisního elektronového mikroskopu tedy elektrony neprocházejí skrz preparát, ale snímají bod po bodu v řádcích povrch. [3] Zdroje elektronů jsou různé. V zásadě se dají rozdělit do dvou skupin a to termoemisní zdroje a autoemisní zdroje. Termoemisním zdrojem může být například wolframové vlákno nebo krystal LaB6. Jeho princip je únik elektronů, které se emitují na základě zvýšené teploty při průchodu elektrického proudu. Wolframové vlákno se zahřívá 2800 C a emituje poměrně malé množství elektronů. Naproti tomu krystal LaB6 je potřeba zahřát jen na 2100 C a emituje mnohem více elektronů a zároveň ještě je jeho životnost 1 rok naproti wolframovému vláknu, které vydrží jen asi měsíc. Autoemisním zdrojem je pak například studené wolframové vlákno, které je vytvarované do hrotu. Pokud se před něj dá silně nabitá anoda, vzniklé elektrické pole vytrhává elektrony z hrotu vlákna. Nevýhodou tohoto zdroje je potřebná vysoká hodnota vakua. [1] 8

Elektrony jsou urychlovány elektromagnetickými cívkami a to v uzavřeném prostoru s vakuem. [3] Při prohlížení biologických preparátů se používá urychlovací napětí 25kV. [2] Elektromagnetické čočky jsou z čistého měkkého železa zasazeného v cívkách a plní funkci pouze spojek. [1] Jejich funkcí je záporně nabité elektrony nasměrovat do správného místa (řádkovat) a co nejvíce zúžit proud elektronů, které budou dopadat na povrch preparátu. Proto je v tubusu uložena série cívek, které tyto funkce plní. Nastavením lez určit počet řádků i rychlost přeběhu. [2] Od rastrovacích cívek odstupuje z tubusu také skanovací obvod, který přináší na obrazovku informaci o poloze bodu, který právě snímáme. Elektromagnetické čočky mají ale také své nedostatky a objevují se u nich stejné vady, jaké můžeme pozorovat u čoček optických. Jsou to: Sférická vada (kulová) paprsky z bodového zdroje se v čočce lámou pod různým úhlem podle vzdálenosti od středu čočky a ta není schopna zaostřit opět jen do jednoho bodu. Místo toho pozorujeme tzv. rozptylové kruhy. [3] A obraz je zvětšen jinak veprostřed a na okrajích. [1] Chromatická vada (barevná) lom světla také závisí na vlnové délce paprsků. Čím je paprsek rychlejší a má větší energii, tím má kratší vlnovou délku a ohýbá se jinak než pomalé elektrony s velkou vlnovou délkou. [2] Dopadá-li tedy na čočku polychromatické světlo, jednotlivým barvám odpovídá jiná ohnisková vzdálenost, kde se tvoří obraz. Jde pak o barevnou vadu polohy, kdy se obraz určitých barev vytváří v jiném místě. A o barevnou vadu velikosti, kdy pro jednotlivé barvy vzniká obraz různě velký. Vzhledem k tomu, že lidské oko je nejvíce citlivé na žlutou barvu, jsou optické přístroje, které používají polychromatické světlo, uzpůsobeny a seřízeny na tyto hodnoty. [3] Tuto vadu lze snížit maximální stabilizací urychlovacího napětí na cívkách. Osový astigmatismus je způsoben nesymetrií magnetického pole cívky v jedné ose. Tuto vadu lze korigovat vnějším magnetickým polem. Těsně před výstupem primárního svazku elektronů z tubusu je objektivová clona. Odtud již elektrony dopadají přímo na preparát, který musí mít vodivý povrch. To se v praxi řeší nanesením malého množství zlata nebo jiného kovu. [3] Při dopadu elektronů se z kovové vrstvy může odrazit nebo vyloučit hned několik částic. Fotony rentgenového záření a viditelného světla, sekundární emitované elektrony, odražené elektrony, Augerovy elektrony a některé elektrony se mohou i absorbovat. Sekundární elektrony jsou vyraženy z vnější elektronové vrstvy atomů preparátu. Některé elektrony ale mohou dopadnout na právě takový elektron, který je ve vyšší energetické hladině a spadne tak na svou původní stabilní. Tím ale vyzáří kvantum energie (foton) a dojde k emisi tzv. Augerova elektronu. [1] Detektory mají zachytit odražené elektrony, a tudíž říkáme této metodě nepřímá. Na detektory jsou ovšem kladeny mnohé požadavky. Díky tomu, že počet elektronů je dosti malý, a proud, který vzniká, je v rozsahu kolem 1pA-1nA, je třeba, aby daný detektor měl velkou citlivost. Zároveň ale musí pokrývat široký rozsah přijímaných intenzit, které se mění až 100 násobně. Také jeho velikost limituje možné zvětšení obrazu. Čím je detektor blíže elektromagnetickým čočkám, tím je zvětšení větší. Samozřejmě se také klade důraz na odolnost (pracuje s vakuem podtlak), cenu a životnost. Nejznámějším detektorem je Everhart- Thornleyův detektor. Detektor je umístěn ve Faradayově kleci s předpětím 200kV, aby napětí scintilátoru neovlivňovalo proud elektronů. Dopadem elektronů na scintilátoru (+10kV 9

urychluje elektrony) se generuje světelný paprsek, který je veden světlovodem k okraji vakuového obalu a komoru opouští křemíkovým okénkem. Tam dopadá na fotonásobič, který převede světelný signál na elektrický a zesílí ho (1 000x 1 000 000x). Tímto způsobem dopadá na detektor asi 60 % sekundárních a odražených elektronů. [1] Obraz, který vzniká, může zobrazit hned několik kvalitativních charakteristik preparátu. Prvně vzniká topografický obraz, který zobrazuje vyvýšené části světlejší barvou a hlubší části tmavěji obraz je černobílý. Zadruhé lze rozlišit jednotlivé prvky, kdy lehčí prvky se budou jevit jako tmavší a těžké jako světlejší oblasti. Toto lze využít při prvkové analýze. Rušivým vlivem by mohlo být nabíjení preparátu, pokud není dostatečně vodivý. [2] 4.2.2 Faktory ovlivňující kvalitu elektronového obrazu: Volba urychlovacího napětí při volbě vysokého urychlovacího napětí má obraz lepší rozlišení, ale naproti tomu jsou povrchy mírně rozmazané, dochází k efektu zdvojení hran, které jsou u nižších napětí ostré. Při volbě vysokého napětí také větší hloubka ostrosti. Náklon vzorku Náklonem můžeme nastavit vzorek tak, aby kraje, které nás zajímají, byly kolmé k scintilátoru, tím se vyhneme krajovému efektu. Také se tímto způsobem nejlépe hrany zobrazí, neboť nedojde k eliminaci ohnutých paprsků vlivem hran kolimátorem. Nabíjení vzorku Nabíjení vzorku můžeme ovlivnit změnou urychlovacího napětí nebo také zlepšením odvodu absorbovaného proudu. Pracovní vzdálenost S větší vzdáleností roste i hloubka ostrosti, ale klesá rozlišení. Kvalita pokovení Zde se kromě kvality také jedná o tloušťku pokovení.[10] Obr. 1 Rastrovací elektronový mikroskop princip [1] 10

5 Experimentální část Bohužel jsem nakonec díky poruše zařízení a Fyzikálním Ústavu AV ČR nestihla tyto procedury vyzkoušet. Proto zde popíši, na čem se mělo pracovat, s jakým i přístroji a jak. V první fázi bychom chtěli pokrýt stent titanem. Základními vstupy do procesu naprašování jsou materiál terče (pro nás tedy titan), tlak inertního plynu (podtlak ve vakuové komoře), tlak reaktivního plynu (vstřikovaného do komory) a teplota substrátu stejně jako energie magnetronového výboje. Z těchto parametrů vyplývá tloušťka a struktura nanesené vrstvy a rychlost depozice. [22] Typické pracovní podmínky v magnetronovém výboji jsou: Magnetické pole: 200 500 G Pracovní tlak: 1-10 mtorr Katodový spád: 300-800 V Tloušťka terče: 3-20 mm Hustota energie e - : <10 15 cm -3 Z tohoto přístroje můžeme pokračovat k procesu pokrývání nanovrstvou diamantu. Nerezové stenty bychom nejprve pokapali emulzí, která obsahuje atomické části diamantu, která byla zakoupena již hotová. Poté bychom dali stent do odstředivky, která, jak již bylo popsáno, má zabezpečit, aby se diamant rozprostřel co nejrovnoměrněji po povrchu a to v jedné vrstvě. To by mohl být u stentu problém, neboť kapky emulze spolu s atomy diamantů by mohly díky povrchovému napětí zůstávat na vnějších částech stentu a tvořit tak nežádoucí vrstvy. To ovšem nebylo prokázané a tudíž s touto případnou komplikací dále nepočítáme. K tomuto procesu použijeme Spin coater model WS-400BZ-6NPP/LITE (obr. 1). Vprostřed tohoto zařízení je vystouplé místo, kam se přikládá stent a zároveň sem vede odsávačka, která přidržuje stent namístě. Na připojeném ovládacím panelu můžeme nastavit otáčky a také podtlak odsávacího zařízení. Obr. 2 Spin coater [13] 11

Z tohoto zařízení již můžeme stent vložit do komory pro pokrývání diamantem. My bychom stent vložili do nekomerčního zařízení jediného svého druhu a to do PELMWCVD tedy zařízení pro chemickou depozici z plynné fáze iniciovanou lineárním mikrovlnným plazmatem. Tento přístroj má laditelný vstupní výkon stejně tak jako periodu pulzů a jejich tvar. Toto se dá také zobrazit na připojeném osciloskopu. Toto zařízení může produkovat pulzy v rozsahu frekvencí 25 khz 9 Hz. Je schopno pracovat i při nízkých teplotách <500 C. Obr. 3 PELMWCVD [13] Obr. 4 Antény uvnitř zařízení [13] Obr. 5 Pohled dovnitř zařízení [13] 12

Takto pokrytý stent bych pak mohla pozorovat rastrovacím elektronovým mikroskopem. Výsledky jiných měření jsou na obrázcích 6-9, kde je vidět povrch stentu ve velmi dobré kvalitě. Rastrovací mikroskop na Fyzikálním ústavu umožňuje také zobrazení měřítka a dalších parametrů, což je vidět na obrázcích 8-9. Zde je také zobrazení příčného řezu nanášeného diamantu. Ten bych nejspíše vůbec nepozorovala. Kdyby ale k takovému pozorování došlo, Vypadalo by zobrazení jinak než na obrázku 9, protože zde vůbec nebyla titanová vrstva a povrch, na kterém diamant rostl, byl křemík a ne nerezový stent. Obr. 6 a 7 Koronární stent pokrytý diamantem (vlevo) a jeho přiblížení (vpravo) [23] Obr. 8 a 9 Povrch stentu (vlevo) a pozorování řezu pod úhlem 30 (vpravo) [13] 13

Závěr Výsledky našeho měření byly nulové, ale z předešlých projektů je známo, že nanášení titanu je již celkem běžnou praxí a že vázání diamantu na titan probíhalo velmi dobře. Povrch stentu je sice drsnější, ale nedochází k restenózám ani k častým infekcím. Doufám, že v budoucnu k tomuto experimentu přeci jen dojde a že jeho výsledky budou ku prospěchu medicíny a povedou ke zlepšení života lidí, kteří jsou odkázáni na implantované stenty. Pro mě osobně byla tato práce přínosná, neboť jsem měla možnost se seznámit s pracovištěm FÚ AV ČR, kde jsem viděla většinu ze zde popsaných přístrojů. Zároveň jsem měla možnost hlouběji se zabývat problematikou nanášení tenkých vrstev a diamantu, o kterých jsem předtím nic nevěděla. Zajímavými pro mě rozhodně byly i výstupy z elektronového mikroskopu. 14

Použité zdroje 1. Šafářová Klára, SKENOVACÍ (RASTROVACÍ) ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE 2. Elektronová mikroskopie přednášky 3. Vymětalová Veronika, BIOLOGIE PRO BIOMEDICÍNSKÉ INŽENÝRSTVÍ, laboratorní cvičení 4. JÄGER, Aleš; GÄRTNEROVÁ, Viera. Www.fzu.cz [online]. 2008 [cit. 2011-11-26]. Elektronovým mikroskopem do nitra materiálů aneb jak vypadá jejich struktura. URL: <http://www.fzu.cz/popularizace/elektronovym-mikroskopem-do-nitra-materialu-anebjak-vypada-jejich-struktura>. 5. Www.cszo.cz [online]. 2011 [cit. 2011-11-26]. Demografická ročenka ČR 2010. URL: <http://www.czso.cz/csu/2011edicniplan.nsf/p/4019-11>. 6. KRUGER, Anke. New Carbon Materials : Biological aplications of functionalised nanodiamond materials. Chemistry : a european journal. 2008, č. 14, s. 1382-1390. 7. KOIZUMI, Satoshi; NEBEL, Christoph; NESLADEK, Milos. Physics and applications of CVD diamond. Německo : Wiley-vch, 2006. 374 s. ISBN 978-3-527-40801-6. 8. REZEK, Bohuslav. Diamond bioelectronics. Ústavní seminář FZÚ AVČR, 2009. s. 50. 9. NESLADEK, Milos; FENDRYCH, Frantisek; MEFFERT, S. Morpohology evolution from nanocrystalline diamond to surface nanostructures: applications to bioelectronics, 2009 10. SULOVSKÝ, Petr. Elektronová mikroskopie a mikroanalýza. PDF dokument, 2002. 26 11. LIBRA, Martin. Naprašování tenkých vrstev. Elektro : odborný časopis pro elektrotechniku [online]. 2002, č. 7, [cit. 2011-11-26]. URL: <http://www.odbornecasopisy.cz/index.php?id_document=25484>. 12. FENDRYCH, František. PE-LA-MW-CVD. PDF dokument, 2010, s. 39. ----MODRA 13. HAZI, Josef. Depozice nanokrystalických diamantových vrstev. Cheb, ČR, 2010. 48 s. Středoškolská odborná práce. Gymnázium Cheb. URL: <http://docs.google.com/> - COC2010_HAZI. 14. ŠPERKA, Jiří. Depozice nanokrystalických diamantových vrstev v mikrovlnném poli. Brno, 2009. 33 s. Bakalářská práce. Masarykova universita. URL: <http://docs.google.com/> - bcthesis. 15. LIVESTRONG [online]. c2010 [2011-12-1]. Types of Heart Stents. URL: < http://www.livestrong.com/article/175671-types-of-heart-stents>. 16. ČESKÝ DIALOG [online]. c2008 [2011-12-1]. Český vynález prorazil na světové trhy. URL: <http://sppd.cesky-dialog.net/clanek.php?idcl=3663&aidci=>. 17. ASHFORD & ST PETER'S HOSPITALS [online]. c2009 [2011-12-1]. Oesophageal Stent. URL: <http://www.ashfordstpeters.nhs.uk/attachments/476_oesophageal%20stent.pdf>. 18. TOUCH BRIEFINGS [online]. c2003 [2011-12-1]. Prostatic Stents in the Treatment of Benign Prostatic Hyperplasia. URL:<http://www.touchbriefings.com/pdf/33/gs031_p_16dijk.pdf>. 19. UNIVERSITY OF MICHIGAN HEALTH SYSTEM [online]. c2007 [2011-12-1]. Frequently Asked Questions about Ureteral Stents. URL: <http://www.med.umich.edu/1libr/urology/umureteral_stents.pdf>. 20. REMEDIA [online]. c2004 [2011-12-1]. Koronární stenty uvolňující farmaka (DES Drug Eluting Stents) revoluce v léčbě ischemické choroby srdeční. URL: <http://www.remedia.cz/clanky/prehledy-nazory-diskuse/koronarni-stenty-uvolnujici- 15

farmaka-des-drug-eluting-stents-revoluce-v-lecbe-ischemicke-choroby-srdecni/6-fc5.magarticle.aspx>. 21. VOJÁČEK, Jan. Koronární stenty. 1. Praha : Grada Publishing, 1997. 164 s. 22. Fyzikální metody přípravy tenkých vrstev. Http://physics.ujep.cz [online]. [cit. 2011-12- 29]. URL: http://physics.ujep.cz/~mkormund/ufptv/2_prednaska_ufptv.pdf 23. REZEK, B. a K. JUREK. Biokom: Stent_BB. Praha, 2010. Prezentace. 16