EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 1

INDUKCE FLUORESCENCE CHLOROFYLU in vivo V PRŮBĚHU PRIMÁRNÍ FOTOSYNTÉZY U VYŠŠÍCH ROSTLIN RNDr. Karel Roháček, CSc. Biologické centrum AV ČR, v.v.i. Ústav molekulární biologie rostlin, Branišovská 31, 370 05 České Budějovice; <rohacek@umbr.cas.cz> 1. Úvod Záznam indukované fluorescence chlorofylu a (Chl) je cestou jak nedestruktivně zkoumat fotosyntetické procesy v rostlinách, řasách i sinicích - obecně ve všech fotosyntetizujících organizmech. Změny výtěžku fluorescence Chl jsou citlivým indikátorem fotosyntetických procesů probíhajících v časovém rozmezí od mikrosekund (rychlé primární fotofyzikální děje) až po mnoho minut (pomalé enzymatické procesy ve stromatu chloroplastů). Vyhodnocením časového záznamu fluorescence Chl, tzv. fluorescenční indukční křivky, lze stanovit hodnoty řady fluorescenčních parametrů, které umožňují kvalitativně i kvantitativně charakterizovat funkčnost fotosyntetického aparátu rostlin, jejich fyziologický stav a rovněž detailně studovat děje probíhající v tylakoidních membránách uvnitř chloroplastů. Fluorescence Chl má svůj původ ve fotosyntetických pigmentech zelených rostlin a odráží širokou škálu fotofyzikálních procesů, které probíhají v tylakoidních membránách uvnitř chloroplastů během přeměny energie slunečního (viditelného) záření na biochemicky dále využitelnou formu - v podobě molekul přenašečů vodíku (NADPH, redukované formy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu) a v makroergních molekulách (ATP, adenosintrifosfát). Energie kvant světelného záření (fotonů) je absorbována v anténních pigmentech dvou fotosystémů (FS I a FS II) a přenášena do reakčních center obou fotosystémů ve formě toku excitonů. V kaskádě fotochemických reakcí donor-akceptorového charakteru je tato energie využívána k transportu elektronů z primárního donoru (molekuly H 2 O) na cílový akceptor (NADP + ) za současného vzniku vysoce energetického substrátu (ATP), potřebného k fixaci CO 2 v Calvinově-Bensonově cyklu. První pokusy o měření výtěžku fluorescence Chl v rostlinách byly inspirovány klasickými pracemi Kautského a Hirsche z roku 1934 [1]. Koncem 20. století se měření indukované fluorescence Chl stalo velmi úspěšnou technikou v získávání kvalitativních i kvantitativních informací o účinnosti fotochemických a nefotochemických procesů uvnitř chloroplastů. Přispělo k tomu především rychlé rozšíření komerčních fluorimetrů, přístrojů pracujících na principu pulzní amplitudové modulace (PAM) fluorescenčního signálu. PAM-fluorimetrie, metoda úspěšně využívaná ve fotosyntetickém výzkumu, je spojena především se jménem a pracemi Ulricha Schreibera a jeho spolupracovníků [2]. 2. Fotosyntéza Fotosyntéza je složitý soubor procesů, jimiž fotoautotrofní organizmy využívají energii kvant slunečního záření k zabudování molekul ve vzduchu obsaženého oxidu uhličitého (CO 2 ) do organických sloučenin a k uvolnění molekulárního kyslíku (O 2 ) z molekul vody (H 2 O) do ovzduší. Fotosyntetická tvorba nových organických látek a kyslíku má tedy zásadní význam EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 1

pro udržení života na planetě Zemi. K tomuto účelu je využíváno elektromagnetické záření absorbované fotosyntetickými barvivy (chlorofyly, karotenoidy a fykobiliny) v tzv. viditelné oblasti slunečního spektra, tj. v intervalu vlnových délek od 400 do 700 nm [3]. Fotosyntéza patří k nejstarším a také nejdůležitějším biochemickým pochodům na zemi. První fototrofní organismy vznikly na naší planetě přibližně před třemi miliardami let. Velmi zjednodušeně je fotosyntéza charakterizována následující sumární rovnicí: h 6 CO 2 + 12 H 2 O C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 + 6 H 2 O. (1) Z této rovnice vyplývá, že fotosyntetické procesy v rostlinách mohou zůstat aktivní pouze při dostatečně dlouhé době ozáření a kontinuálním příjmu molekul H 2 O a CO 2. Použitím radioaktivních a stabilních izotopů C, N, O, P se zjistilo, že fotosyntetický proces je možno rozdělit na fázi světelnou (fotofyzikální) a fázi temnotní (chemosyntetickou). Světelná fáze zahrnuje oxido-redukční reakce, při nichž nastává fotolýza vody, vytváří se phgradient a vzniká ATP a NADPH. Temnotní fáze zahrnuje enzymatické reakce, v nichž se na úkor chemické energie produktů světelné fáze (NADPH, ATP) a za spoluúčasti CO 2 a H 2 O syntetizují důležité organické látky - sacharidy, tuky, bílkoviny apod., přičemž účinnost jejich syntézy v chloroplastech závisí na intenzitě přísunu ATP a NADPH, tj. na účinnosti světelných reakcí. 3. Chloroplast Nejmenší strukturní i funkční jednotkou, která je schopna i po izolaci absorbovat záření, fixovat CO 2 a zabudovávat uhlík do sacharidů, je chloroplast. Skládá se z dvojité povrchové membrány, vnitřní tekuté fáze, zvané stroma, jež obsahuje enzymy uplatňující se při fixaci CO 2, a membránových útvarů, tzv. tylakoidů, s granální strukturou. Membránu tylakoidů lze považovat za lipidovou dvojvrstvu, do níž jsou vnořeny pigment-bílkovinné komplexy, tvořící dvě základní fotosyntetické jednotky - fotosystém II a I (FS II a I). Ty se skládají z reakčního centra (RC), tvořeného molekulou dimeru Chl a, a z vnitřních (core) a vnějších (mobilních) světlosběrných antén, které obsahují velké množství molekul Chl a a b. Poměr chlorofylu a ku b je v tzv. vnějších anténách přibližně 3:1. Do RC směřuje energie fotonů absorbovaných celým světlosběrným komplexem ve formě toku excitonů (vázaných nábojových stavů). FS I má ve svém reakčním centru pigment s maximem absorpce kolem 700 nm (P 700 ) a téměř nefluoreskuje. FS II obsahuje analogický pigment s maximem při kratší vlnové délce 680 nm (P 680 ) a výrazně fluoreskuje (viz níže).oba dva fotosystémy jsou mezi sebou propojeny řadou elektronových přenašečů a navzájem úzce kooperují. 4. Chlorofyl Základním fotoreceptorem (látkou schopnou zachytit přicházející fotony), který se účastní fotosyntézy, je chlorofyl. Jeho molekulu tvoří planární hořečnatý komplex redukovaného porfyrinu s navázaným polyisoprenovým řetězcem alkoholu fytolu. Chl má v dopadajícím bílém (polychromatickém) světle zelenou barvu, neboť intenzivně absorbuje viditelné záření v oblastech vlnových délek okolo 430nm (modrá oblast spektra) a 663nm (červená oblast), zatímco záření ze zelené oblasti (cca 500 nm) propouští. Rozlišujeme dva základní typy, které se odlišují pouze jedním substituentem na porfyrinovém kruhu - Chl a obsahuje metylovou EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 2

skupinu, kdežto Chl b karbonylovou. Přesto se tato malá chemická záměna výrazně projevuje na optické fyzikální charakteristice, které říkáme absorpční spektrum molekuly Chl. Světlo - přesněji řečeno viditelná oblast elektromagnetického záření/pole - je proud fotonů (kvazičástic) o vlnové délce (λ) v intervalu od 400 do 700 nm. Každý pohlcený foton může způsobit jednoduchý fotofyzikální děj za předpokladu, že nese dostatečné množství energie (E hν ). Energie fotonů pohání primární fotochemické reakce, které iniciují fotosyntetickou přeměnu zářivé energie na biochemicky využitelnou formu a vedou k separaci náboje v RC FS II a FS I), nebo je disipována nefotochemickou cestou - přeměnou na teplo a fluorescenci. Vysvětlení fotochemických a nefotochemických procesů v RC vyžaduje použití některých základních pojmů z kvantové teorie. K jejich lepšímu pochopení slouží následující obrázek. Obr. 1: Zjednodušené tříhladinové schéma využití excitační energie v molekule chlorofylu reakčního centra fotosystému II [4]. Energetické schéma ukazuje základní singletní stav (S 0 ) a dva singletní excitované stavy (S 1, S 2 ) molekuly Chl. Horizontální čáry znázorňují vibrační stavy uvedených energetických hladin pro různá vibrační čísla (v" pro základní stav, v' pro excitované stavy). Vertikální šipky reprezentují následující kvantové procesy: (1) absorption - absorpce kvanta záření s určitou vlnovou délkou A, jež způsobí přechod elektronu ze základního do excitovaného stavu v čase kratším než 10-14 s, (2) dissipation to heat - rozptýlení excitační energie nezářivou vnitřní konverzí na teplo, a (3) fluorescence - zářivá deexcitace vzbuzeného stavu vyzářením fotonu s vlnovou délkou F větší než 650nm. Parametr znamená přibližnou dobu života elektronu v jednotlivých kvantových stavech. Horizontální šipky reprezentují tzv. fotochemickou cestu (photochemistry), tj. rozdělení náboje v RC FS II jako počátek transportu elektronů (Electron transport), a nábojovou neutralizaci iontu Chl + elektrony dodávanými (Donation of electrons) komplexem štěpícím vodu (WSC) [4]. Chlorofyl v RC můžeme popsat jako oxidoredukční systém: oxiduje se předáním elektronu na molekulu akceptoru a poté se vrací do základního (nábojově neutrálního) stavu tak, že přijme elektron od primárního donoru. Potřebné množství energie pro přechod elektronu mezi EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 3

základním a excitovaným stavem se získá absorpcí světla. Je-li absorbován foton z modré oblasti viditelného spektra (λ = 450 nm), přechází elektron do vyššího excitovaného stavu S 2, dojde-li k absorpci fotonu z energeticky chudší červené oblasti (λ = 650 nm), může elektron přejít pouze do stavu S 1. Doba života elektronu v excitovaném stavu S 1 je ale zároveň asi tisíckrát delší (τ = 10-9 10-8 s) než v S 2. Během této doby musí být elektron buď přenesen na sousední molekulu v elektronově transportním řetězci (feofytin u rostlin), anebo se vrací do základního stavu nezářivým procesem (teplotní disipace) nebo zářivým (fluorescence). Kvantová účinnost fotosyntézy (počet molů fixovaného CO 2 na 1 mol absorbovaných kvant záření) se zvýší, pokud je světlo absorbováno nejen chlorofylem a, ale také přídavnými pigmenty. Anténní komplexy proto obsahují vedle Chl a a b také tzv. pomocná barviva, hlavně karotenoidy. Jsou to žlutá a červená lipofilní barviva, jež zachycují světelná kvanta v oblasti spektra, kde Chl neabsorbuje. Excitační energie je následně využita rychlým přenesením na Chl a. Karotenoidy rovněž odstraňují radikálové formy kyslíku, které vznikají v průběhu fotosyntézy a působí destruktivně jak na RC, tak na další lipoproteiny v tylakoidní membráně. 5. Elektronový transport Přenos elektronů přes dlouhou řadu přenašečů spojených do tzv. elektronově transportního řetězce je poměrně složitý proces, během něhož jsou elektrony transportovány z primárního donoru - molekuly vody, až na cílový akceptor - molekulu NADP +. Tímto způsobem rostliny transformují světelnou energii na chemickou, přesněji řečeno oxido-redukční. Tento proces je popisován pomocí tzv. Z-schématu (obr. 2), do něhož patří: komplex tvořený 4 atomy Mn, který štěpí naráz 2 molekuly H 2 O na 4 protony (H + ), 4 elektrony a molekulární kyslík (O 2 ), tyrosin obsahující molekula (Y Z ), jež dopravuje elektrony do dimeru Chl v RC FS II (P 680 ), excitony vybuzený Chl (P 680 *), který je primárním donorem elektronů pro molekulu feofytinu (Pheo), z něhož jsou elektrony přenášeny na plastochinonovou molekulu (Q A ), pevně vázanou na D2 proteinu, a poté na D1 proteinu volně vazný plastochinon (Q B ). Ten po obdržení 2 elektronů a 2 protonů se oddělí a v podobě redukovaného plastochinonu (PQH 2 ) se pohybuje uvnitř tylakoidní membrány směrem k superkomplexu tvořenému Rieskeho FeS-proteinem, dvěma cytochroby b 6 a cytochromem f. Odtud s pomocí vysoce mobilního plastocyaninu (PC), měď obsahujícího proteinu, jsou elektrony přenášeny do RC FS I (P 700 ), kde po obdržení excitační energie přechází ze vzbuzeného stavu Chl (P 700 *) na primární akceptor FS I (A 0 ) a dále přes molekulu fyllochinonu - vitaminu K (A 1 ) na trojici imobilních FeSproteinových center F X, F A a F B. V závěrečné fázi se přes pohyblivý FeS-protein ferredoxin (Fd) a za přispění enzymu ferredoxin-nadp-oxidoreduktázy elektronový pár přenáší na cílový akceptor - oxidovanou formu nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADP + ), který se navázáním protonu redukuje na NADPH [5]. Molekuly vody slouží na jedné straně jako donor protonů pro tvorbu NADPH a na druhé straně jako zdroj elektronů pro kladně nabitou molekulu aktivního Chl a v RC FS II. Při transportu elektronů se napříč thylakoidní membránou zároveň transportují též protony (H + ), čímž vzniká ph-gradient, nezbytný pro vytváření molekul ATP z adenosindifosfátu (ADP) a fosfátové skupiny pomocí tzv. ATP-syntázy (membránového enzymatického bílkovinného komplexu). NADPH a ATP jsou substráty nezbytné pro fotosyntetickou fixaci molekul CO 2 do molekul glukózy, jež jsou syntetizovány v rámci kaskády biochemických reakcí v tzv. Calvinově-Bensonově cyklu. EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 4

Obr. 2: Z-schéma lineárního elektronového transportu [5]. 6. Fluorescence Záznam fluorescence vyzařované molekulami Chl a se ve fotosyntetickém výzkumu stal základem široce využívané metody, která dovolila pochopit fotochemické a nefotochemické procesy probíhající v tylakoidní membráně chloroplastů. Dostupnost komerčních zařízení, pracujících na principu pulzní amplitudové modulace (PAM) fluorescenčního signálu, umožnila přesná měření fluorescence chlorofylu (FChl) dokonce i v polních podmínkách. FChl je při pokojové teplotě detegována převážně (asi z 90 %) z chlorofylových komplexů FS II a představuje cca 3 5 % z celkové pohlcené energie. K popsání a kvantifikování procesu emise fluorescence byl zaveden termín kvantový výtěžek fluorescence ( F), který je definován jako podíl počtu vyzářených fotonů (n F ) k počtu všech absorbovaných kvant (n A ): F = n F / n A, (2) resp. může být vyjádřen následující rovnicí: F = I F / I A = k F / Σk i, (3) kde I F značí intenzitu fluorescence, I A intenzitu absorbovaného záření, k F rychlostní konstantu fluorescence a Σk i představuje sumu rychlostních konstant všech konkurenčních procesů, které vedou k návratu molekuly Chl do základního stavu (viz obr. 1) [4]. Přestože fluorescence Chl představuje minoritní proces deaktivace excitovaných pigmentů, časové změny výtěžku FChl umožňují zkoumat mechanismy, pomocí nichž tylakoidy regulují využití zářivé energie absorbované komplexy FS II. Jak plyne z obr. 1 a zákona zachování energie, růst jedné komponenty vede ke snížení nejméně jedné z ostatních dvou komponent, do nichž excitační energie přechází. Mezi fotochemickými a nefotochemickými procesy platí antiparalelní vztah a tudíž měřením F lze nepřímo usuzovat na účinnost fotochemických dějů v RC FS II. Záznam časových změn kvantového výtěžku fluorescence (tzv. Kautského jev) se nazývá fluorescenční indukční křivka (FIK) a její příklad je na obrázku 3. Analýza EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 5

takovéto křivky umožňuje kvalitativně i kvantitativně posoudit zužitkování excitační energie ve fotosystému II a nepřímo také dalšími komplexy v tylakoidní membráně. Např. zvýšení toku excitační energie do fotochemických procesů vede k poklesu (zhášení) výtěžku FChl. Tímto způsobem FIK odráží změny v účinnosti primárních fotosyntetických procesů. Obr. 3: Fluorescenční indukční křivka zaznamenaná fluorimetrem PAM-2000 (H. Walz, Effeltrich, SRN) na listu fazolu in vivo. Dark period označuje temnotní adaptaci listu, light period fotosynteticky aktivní fázi a dark relaxation návrat vzorku ze světelně do temnotně adaptovaného stavu. +MR/-MR znamená zapnutí/vypnutí měřícího záření (ozářenost povrchu < 0,1 μmol hν m -2 s -1 ), +AR/-AR zapnutí/vypnutí aktinického záření (290 μmol hν m -2 s -1 ), SP spuštění saturačního pulzu (cca 2500 μmol hν m -2 s -1 ) a FR se šipkou označuje aplikaci far-red záření (cca 10 μmol hν m -2 s -1, 3 s). Použito bylo normování FIK na maximum FChl (F M ) [4]. Metodou saturačních pulzů lze rozlišit dva základní typy zhášení FChl: fotochemické zhášení, které odpovídá energii spotřebované při rozdělení (separaci) náboje v reakčních centrech FS II a nefotochemické zhášení, jež je vyvoláno tvorbou ph-gradientu a také aktivací četných regulačních mechanismů, které zajišťují efektivní využití excitační energie a umožňují rostlinám vypořádat se s nadměrnou ozářeností (fotoinhibicí) nebo jiným druhem poškození fotosyntetických komplexů způsobených v průběhu stresu. 6. Fluorescenční indukční křivka V temnotně adaptovaném stavu (TAS), který je vzhledem k elektronově transportním procesům v tylakoidní membráně fotochemicky neaktivním stavem, jsou obecně všechna RC FS II reoxidována ( otevřená ). V tomto stavu je možné zaznamenat tzv. minimální výtěžek FChl (viz F 0 na obr. 3), jestliže je vzorek ozařován slabým modulovaným měřícím zářením (MR). Je-li vzorek následně vystaven krátkému pulzu (max. 1 s) velmi intenzivního bílého světla, způsobí tento saturační pulz (SP) rychlé uzavření všech aktivních reakčních center FS EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 6

II, provázené redukcí všech akceptorů Q A a vysycením fotochemických procesů ve FS II. Tehdy je zaznamenán tzv. maximální výtěžek FChl (F M na obr. 3). Správné stanovení jak F M, tak F 0 je nezbytné pro následné kvantifikování procesů fotochemické i nefotochemické povahy, které se uplatňují během primární fáze fotosyntézy. Rozdíl mezi F M a F 0 je označován jako maximální výtěžek variabilní FChl v temnotně adaptovaném stavu (F V ). F V lze vypočítat ze vztahu: F V = F M F 0. (4) Po zapnutí aktinické záření (AR) se výtěžek FChl dynamicky mění v důsledku působení fotochemických a nefotochemických procesů. Fotochemické procesy se vztahují k rozdělení náboje v RC FS II, nefotochemické procesy zahrnují vytváření ph-gradientu, nezářivou disipaci energie na teplo, fosforylaci mobilních světlosběrných komplexů FS II, fotoinhibici reakčních center FS II, konformační změny tylakoidní membrány atd. V průběhu světelné periody přechází fotosyntetický aparát postupně z temnotně do světelně adaptovaného stavu (SAS). Ten je charakterizován nepřetržitou syntézou ATP, NADPH a souběžnou fixací CO 2. Jakmile se procesy elektronového transportu a spřažených biochemických reakcí dostanou do rovnováhy, je dosaženo i tzv. ustálené úrovně (steady-state) výtěžku fluorescence Chl (F S ). Použití saturačního pulzu v SAS umožňuje určit maximální výtěžek FChl (F M '). Jakmile je AR vypnuto, je po krátkém pulzu slabého dlouhovlnného červeného záření (far-red, FR), jež urychluje reoxidaci akceptorové strany FS II, zaznamenán minimální výtěžek FChl (F 0 '). Pak je možné určit maximální výtěžek variabilní FChl ve světelně adaptovaném stavu (F V ') jako: F V ' = F M ' F 0 '. (5) Obecně tedy úrovně fluorescence F M a F 0 jednoznačně charakterizují temnotně adaptovaný stav, F M ', F S a F 0 ' charakterizují světelně adaptovaný stav tylakoidní membrány. Návrat vzorku ze SAS do TAS po vypnutí indukčního aktinického záření lze sledovat během tzv. temnotní relaxační fáze aplikací pulzů saturačního záření v určitých časových intervalech (viz obr. 3). Analýzou relaxační kinetiky nefotochemického zhášení FChl pak lze najít jeho základní komponenty, které úzce souvisí s aktivací konkrétních regulačních a reparačních mechanizmů uvnitř tylakoidní membrány v průběhu primární fotosyntézy. 7. PAM-fluorimetr Blokové schéma PAM-fluorimetru, přístroje pracujícího na principu pulzní amplitudové modulace indukované FChl, je na obr. 4. Měřící postup je následující: Předzatemněný vzorek (10 15 min) je vystaven červenému (λ = 650 nm) velmi slabému (cca 0,1 mol fotonů m -2 s -1 ) pulsujícímu (f = 600 Hz) měřícímu záření (MR) ze světloemitující diody (LED). Jednotlivé pulzy jsou dlouhé 3 s. Anténní pigmenty obou fotosystémů světlo pohlcují a polovodičový fotodetektor zaznamenává vzniklou fluorescenční odezvu (úroveň F 0 na obr. 3). Detektor zaznamenává signál pouze na frekvenci MR, čímž se dosahuje vysoké selektivity a citlivosti. Vystavení vzorku aktinickému záření, které je schopno navodit fotosynteticky aktivní stav, nebo saturačnímu záření, které v krátkém časovém okamžiku uzavře všechna RC FS II, se projeví změnou amplitudy (výšky) pulzů indukované fluorescence. Ta je elektronickou částí vyhodnocena jako časově proměnný výtěžek FChl a znázorněna na displeji počítače. EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 7

Obr. 4: Blokové schéma PAM-fluorimetru pro detekci indukované fluorescence Chl a: A (amplifier) - zesilovač, AR (actinic radiation) - zdroj aktinického záření, D (detector) detektor, e (emission) - emise modulované fluorescence Chl, FR (far-red) - zdroj far-red záření, LF (long-pass filter) - filtr propouštějící světlo o delší vlnové délce (λ > 700 nm), MR (measuring radiation) - zdroj měřícího záření, r (reflected radiation) - odražené záření, SF (short-pass filter) - filtr propouštějící světlo o kratší vlnové délce (λ < 670 nm), SR (saturating radiation) - zdroj saturačních pulzů (SP) [4]. Kontinuální aktinické záření (AR) emitované LED (650 nm) s hustotou toku fotonů řádově 100 mol m -2 s -1 vyvolává separaci náboje v RC, tok elektronů od FS II přes FS I na NADP +, tvorbu ph-gradientu, syntézu ATP a fixaci CO 2 v Calvin-Bensonově cyklu. Saturační pulzy (SP) o délce 0,8 s jsou vytvářeny halogenovou lampou (řádově 10 3 mol m -2 s -1 ). Toto bílé světlo (SP) způsobí, že se všechna RC FS II převedou do uzavřeného (přeredukovaného) stavu. V tomto stavu jsou fotochemické procesy ve FS II plně saturovány a excitační energie je disipována procesy nefotochemické povahy, tj. dochází k její přeměně na fluorescenci a teplo. V tomto stavu je dosaženo tzv. maximálního výtěžku FChl (F M, F M ' na obr. 3). Frekvence měřícího záření se během aplikace AR a SP zvyšuje z 600 Hz na 20 khz, čímž se dosahuje vyššího časového rozlišení. Zdroj far-red (FR) záření ( = 735 nm, 10 mol m -2 s -1 ) je využíván k rychlé reoxidaci akceptorové strany FS II (plastochinonového zásobníku) po vypnutí AR nebo po aplikaci SP. Má vliv pouze na činnost FS I a je nezbytný pro stanovení úrovně FChl označované jako F 0 ' (obr. 3) [4]. 8. Fluorescenční parametry Pro účely kvantitativní analýzy záznamů FIK byly ve fotosyntetickém výzkumu zavedeny tzv. fluorescenční parametry (FP). Definování FP je závislé na pětici vzájemně nezávislých úrovní FChl: F 0, F M (pro TAS), F 0 ', F M ' a F S (pro SAS). Jejich korektní naměření je zcela zásadní pro správné určení hodnot příslušných FP. Z celé řady parametrů se velmi často používá následujících šest [4]: 1. Maximální kvantový výtěžek fotochemických procesů ve FS II ( Po) Po = F V /F M = (F M F 0 )/ F M = 1 F 0 /F M ; (0 Po 1) (6) EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 8

Po patří mezi nejpoužívanější parametry. Jednoznačně charakterizuje TAS. Počítá se jako podíl mezi maximálním variabilním (F V ) a maximálním (F M ) výtěžkem FChl. Určuje míru maximální fotochemické kapacity FS II a jeho střední hodnota u mnoha druhů rostlin je za nestresujících podmínek rovna 0,832. U rostlin vystavených stresu, anebo v případě jejich poškození, se hodnota tohoto parametru výrazně snižuje. Po tedy může velmi rychle prokázat poškození komplexů FS II, a to např. jako následek stresu suchem, nadměrnou ozářeností, chladem apod. 2. Koeficient fotochemického zhášení variabilní FChl (q P ) q P = (F M ' F S )/( F M ' F 0 ') = F/F V ' ; (0 q P 1) (7) Tento parametr se vztahuje k SAS. Kvantifikuje fotochemickou kapacitu FS II a velmi úzce souvisí s aktuální frakcí otevřených (reoxidovaných) reakčních center FS II. 3. Koeficient nefotochemického zhášení variabilní FChl (q N ) q N = (F V F V ')/F V = 1 F V '/F V (0 q N 1) (8) Velikost q N je odrazem účinnosti nefotochemických procesů, které jsou charakteristické pro SAS. K nim patří tvorba ph-gradientu, syntéza ATP, činnost Calvinova-Bensonova cyklu, aktivace regulačních mechanismů (odpojení mobilních světlosběrných komplexů, aktivace xantofylového cyklu) atd. Na rozdíl od q P, při poškození fotosyntetického aparátu rostliny se hodnota q N zvyšuje. 4. Koeficient relativní změny základní FChl (q 0 ) q 0 = (F 0 F 0 ')/F 0 = 1 F 0 '/F 0 ; (-0,2 q 0 1) (9) Parametr q 0 popisuje změny počáteční úrovně F 0 poté, co byl vzorek vystaven aktinickému záření. Podobně jako q N kvantifikuje děje nefotochemické povahy v SAS a odráží též konformační změny uvnitř pigment-proteinových komplexů v tylakoidní membráně. 5. Efektivní kvantový výtěžek fotochemické přeměny energie ve FS II ( 2) 2 = (F M ' F S )/F M ' = F/F M ' ; (0 2 < 1) (10) Parametr 2 se vztahuje k SAS a kvantifikuje účinnost fotochemické konverze zářivé energie v FS II během fotosyntézy, resp. účinnost lineárního elektronového transportu. Je velmi často využíván v terénním výzkumu, neboť nevyžaduje předchozí temnotní adaptaci vzorku. 6. Nefotochemické zhášení FChl (NPQ) NPQ = (F M F M ')/F M ' = F M /F M ' 1 (0 NPQ 6) (11) NPQ je důležitý FP vztahující se k SAS. Odráží procesy, které vedou ke snížení hodnoty F M v průběhu adaptace rostliny na světlo. NPQ kvantifikuje nefotochemické procesy způsobující přeměnu velké části excitační energie na teplo. Jeho velikost souvisí s tvorbou ph-gradientu, aktivací xantofylového cyklu (reverzibilní konverzí pigmentu vioalaxantinu na zeaxantin ve světlosběrných komplexech FS II jako následek nadměrné ozářenosti), fotoinhibicí, resp. fotodestrukcí reakčních center FS II atd. 9. Závěr Zde uvedený text shrnuje základní informace o fotofyzikálních procesech a navazujících biochemických dějích v primární fázi fotosyntetické přeměny zářivé energie, jež jsou nutné pro vznik složitějších organizkých látek (cukrů, škrobů, bílkovin), na nichž je založen život na naší planetě. Vysvětluje potřebné fyzikální pojmy a také metodu, pomocí níž lze relativně EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 9

rychle a efektivně účinnost primárních fotofyzikálních procesů měřit. Pro hlubší pochopení dané problematiky odkazuji čtenáře na níže uvedenou literaturu a další četné práce odborníků, kteří se zabývají biofyzikálním a biochemickým výzkumem fotosyntézy. Tento příspěvek vznikl v rámci výzkumného záměru ÚMBR AV ČR č. AV0Z50510513. Literatura [1] Kautsky H., Hirsch A.: Chlorophyllfluoreszenz und Kohlensäureassimilation. I. Das Fluoreszenzverhalten grüner Pflanzen. Biochem. Z. 274: 423-434, 1934. [2] Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W.: Continuous recording of photochemical and nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10: 51-62, 1986. [3] Procházka S., Macháčková I., Krekule J., Šebánek J. a kol.: Fyziologie rostlin. Academia, Praha, 484 stran, 1998. [4] Roháček K., Barták M.: Technique of the modulated chlorophyll fluorescence basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica 37: 339-363, 1999. [5] Whitmarsh J., Govindjee: The photosynthetic process. Článek zveřejněný na URL-adrese [http://www.life.uiuc.edu/govindjee/paper/gov.html]. Seznam v textu použitých zkratek ADP adenosindifosfát AR aktinické záření ATP adenosintrifosfát Chl chlorofyl FChl fluorescence chlorofylu FIK fluorescenční indukční křivka FP fluorescenční parametr FR far-red záření FS I a II fotosystém I a II LED světlo emitující dioda MR měřící záření NADPH redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidfosfátu PAM pulzní amplitudová modulace RC reakční centrum SAS světelně adaptovaný stav SP saturační pulz TAS temnotně adaptovaný stav WSC vodu štěpící komplex Karel Roháček, 22.3. 2011 EKOTECH Fluorescence chlorofylu in vivo 10