Regulace receptorů spřažených s G proteiny

Regulace receptorů spřažených s G proteiny Regulation of receptors coupled to G proteins (GPCRs) PØEHLEDNÉ ÈLÁNKY Tománková H. 1, Mysliveèek J. 1,2* 1 Technická univerzita Liberec, Ústav zdravotnických studií, Laboratoø fyziologie, Èeská republika 2 Univerzita Karlova v Praze, 1. lékaøská fakulta, Fyziologický ústav, Èeská republika * korespondující autor SOUHRN Na základì zjištìní plynoucích z posledních dvou desetiletí výzkumu v oblasti receptorù spøažených s G proteiny (GPCRs) je stále více zøejmé, že signalizace prostøednictvím tìchto receptorù neprobíhá pouze podle klasického lineárního modelu, nýbrž jde o znaènì složitou, vzájemnì propojenou síś signálních cest s øadou spoleèných proteinù. Vzhledem k rozsáhlosti a spletitosti sítì aktivované tìmito receptory je zjevné, že zde musí existovat víceúrovòový systém regulace, který zajistí odpovídající kontrolu jak na úrovni rozsahu, tak z hlediska èasového a prostorového aspektu GPCR signalizace. Tento èlánek shrnuje hlavní mechanizmy regulace GPCRs a nabízí pøehled posledních poznatkù z této oblasti výzkumu. Klíèová slova: receptory spøažené s G proteiny, signalizace, regulace SUMMARY Regulation of G protein coupled receptors (GPCRs) looks to be not only classically lineary regulated but it is now discovered to be a complex network of interconnected proteins. Taking these in mind it is highly probable that there is multilevel system of regulation that is able to maintain control of signaling. We review here main mechanisms of GPCRs regulation. Key words: G protein-coupled receptors, signaling, regulation ÚVOD Receptory spřažené s G proteiny, G protein coupled receptors (GPCRs), představují největší skupinu membránových proteinů. Jejich sekundární strukturou je 7 transmembránových α-helixů, na něž se z vnitřní strany buněčné membrány váže G protein. Jde o receptory, které jsou zapojeny do celé řady buněčných funkcí (Shenoy a Lefkowitz, 2003). Jako signální proteiny reagují GPCRs na různé extracelulární podněty a zprostředkovávají přenos signálu směrem dovnitř buňky. Po navázání ligandu, nejčastěji odorantu, hormonu, růstového faktoru, chemokinu či neurotransmiteru (Xiao et al., 2010), dochází k aktivaci intracelulárních partnerů (většinou heterotrimerických G proteinů) a následné aktivaci s nimi propojených signalizačních drah (Cabrera-Vera et al., 2003). Díky dynamické organizaci své struktury mají GPCRs schopnost měnit svou konformaci v řádech milisekund či sekund v závislosti na specificitě přítomného ligandu, což je zásadní vlastností pro komplexnost a regulovatelnost celé signalizace. V posledních dvou desetiletích jsou naše poznatky z oblasti signalizace prostřednictvím GPCRs a její regulace stále obsáhlejší a komplexnější. V tomto článku se nebudeme věnovat popisu celé řady signalizačních drah, které jsou těmito receptory aktivovány, pro přehled odkážeme na dopodrobna zpracovaný článek (Kristiansen, 2004), nicméně signalizační procesy krátce zmíníme v následující kapitole. Dále se zaměříme spíše na mechanizmy regulace, které v této signalizaci hrají důležitou roli. Z dosavadních zjištění je jasné, že specifičnost signalizace lze regulovat na všech jejích úrovních: na úrovni receptorů, stejně jako na úrovni všech komponent následného signalizačního procesu. Víme, že zvýšením či snížením aktivace některých typů receptorů dochází ke změnám v jejich množství na buněčné membráně, což je vysvětlováno procesy tzv. homologní regulace, kdy dochází buď ke zvýšené (tzv. upregulaci), nebo ke snížené (tzv. downregulaci) produkci konkrétního receptoru (Nathanson, 1989). Změna v aktivaci receptoru však může ovlivnit také makromolekuly, které se podílejí na intracelulárních krocích transdukce signálu (Schulte a Levy, 15

2007), či receptory synergických nebo antagonistických funkcí (zde se jedná o tzv. heterologní regulaci, někdy nazývanou též cross-talk či cross-regulaci) (Lee a Fraser, 1993, Hur a Kim, 2002, Vázquez-Prado et al., 2003). Kromě up- a downregulace produkce receptorů zahrnuje regulace na úrovni GPCR také tzv. senzitizační a resenzitizační procesy, které mění schopnost receptoru reagovat na podněty přinášené ligandem. SIGNALIZACE PROSTŘEDNICTVÍM GPCRS Receptory spřažené s G proteiny (GPCRs) jsou integrální membránové proteiny, které vykazují strukturální podobnost sedmi transmembránových α-šroubovicových domén (GPCRs jsou proto někdy nazývány též 7-TM receptory). Tyto receptory jsou vazebným místem pro mnoho různých strukturálně odlišných endogenních ligandů a slouží tedy jako koordinátoři řady fyziologických funkcí. Přestože dosavadní poznatky neposkytují kompletní výčet a charakterizaci všech členů této skupiny, ze zjištění na základě sekvenování genomu je jejich počet odhadován na více než 800 (Fredriksson et al., 2003). Signalizační mechanizmus GPCRs je obvykle založen na klasickém funkčním modelu receptor-efektor, kterým je obvykle G protein (Pierce et al., 2002). G proteiny, které se sdružují s GPCRs, jsou charakterizovány jako heterotrimerické struktury složené ze tří podjednotek. α-podjednotka je zodpovědná za vazbu GTP nebo GDP a za hydrolýzu GTP. β a γ podjednotky jsou pevně spojené, tvoří β/γ dimer (Milligan a Kostenis, 2006). Vazba agonisty na receptor indukuje změnu v jeho konformaci, což může vést ke zvýšené afinitě receptoru ke G proteinu. Aktivovaný receptor pak slouží jako faktor pro výměnu guaninových nukleotidů (guanine nucleotide exchange factor, GEF), tedy zvyšuje rychlost uvolňování GDP z jeho vazebného místa na α podjednotce a umožňuje tak jeho okamžité nahrazení molekulou GTP (Pierce et al., 2002). U aktivovaného heterotrimeru dochází ke snížení afinity α podjednotky k dimeru β/γ a komplex disociuje. Volné podjednotky působí jako nezávislé aktivátory nebo inhibitory intracelulárních efektorů transdukce signálu (Cabrera-Vera et al., 2003) (viz obr. 1). Aktivovaný stav podjednotek trvá, dokud není GTP hydrolyzován na GDP, přičemž celý tento proces je kontrolován regulátory G proteinové signalizace (tzv. RGS bílkovinami). Jakmile se GTP rozštěpí na GDP, α-gdp a β/γ podjednotky znovu asociují a aktivační cyklus je ukončen. Klasický způsob signalizace prostřednictvím GPCRs je závislý na aktivaci G proteinů, které přenášejí extracelulární podnět na další efektory jako fosfolipázu C (PLC) či adenylát cyklázu (AC). Tyto efektory pak modulují produkci intracelulárních signálních molekul inositol fosfátu či diacylglycerolu nebo cyklického AMP (Cabrera-Vera et al., 2003). Existují však také mechanizmy GPCRs signalizace, které jsou na G proteinech nezávislé. Ty spočívají především v přímé vazbě receptoru na efektorové molekuly signalizačních cest. Vzhledem k tomu, že GPCRs jsou ukotveny na membránu, je evidentní, že k umožnění interakcí receptorů s kooperujícími molekulami je nutná existence určitého systému podpůrných proteinů, tzv. scaffolders (česky lešení), které jsou schopny celý systém signalizačních molekul shromáždit a tím signalizaci podporovat. REGULACE GPCRS Navázáním agonistů na GPCRs dochází nejen ke zprostředkování aktivace či inhibice různých efektorů navazujících signálních drah, ale také k vyvolání snížené schopnosti reakce receptoru na tento signál. Krátkodobá ztráta citlivosti receptorů na příslušné podněty je označována jako desenzitizace, zatímco dlouhodobá ztráta citlivosti představuje jev nazývaný downregulace exprese/produkce receptorů. Znemožnění vazby agonisty na receptor (blokáda antagonistou, denervace, narušená schopnost uvolnění transmiteru) může vést na druhou stranu k senzitizaci a/nebo upregulaci počtu receptorů. V případě desenzitizace a downregulace se jedná o mechanizmy negativní zpětné vazby, která chrání proti nadměrné stimulaci receptorů, zatímco resenzitizace, senzitizace a upregulace umožňují pozitivní zpětnou vazbu, která zajišťuje zachování citlivosti receptorů i v případě snížené stimulace agonistou. DESENZITIZACE GPCRs mají schopnost řídit svou vlastní reakceschopnost prostřednictvím mechanizmů, které vedou ke snížení jejich citlivosti až znecitlivění, tzv. desenzitizaci. Jedná se o proces spočívající v disociaci receptor/g proteinového komplexu. K disociaci tohoto komplexu dochází zejména důsledkem fosforylace receptoru, která je zprostředkována dvěma typy proteinkináz: jednak jsou to kinázy aktivované druhým poslem (tj. PKA proteinkináza A a PKC proteinkináza C) a kinázy receptorů spřažených s G proteiny (GPCR kinázy, GRKs). Tyto dva fosforylační procesy se liší svým mechanizmem účinku. U obou platí, že fosforylace probíhá na serinech a/nebo threoninech, ale úseky, kde k tomuto účinku dochází, nejsou identické. K fosforylaci prostřednictvím GRKs navíc dochází pouze u receptorů s navázaným agonistou (homologní desenzitizace), zatímco PKA a PKC se účastní fosforylace aktivovaných i neaktivovaných forem receptorů (heterologní desenzitizace). V druhém případě tak dochází k desenzitizaci neaktivovaného receptoru následkem aktivace jiného typu receptoru (Claing et al., 2002). Homologní desenzitizace je spojována spíše s vyššími koncentracemi agonisty, zatímco při heterologním mechanizmu desenzitizace se předpokládá působení spíše nižších koncentrací ligandu (Hendriks-Balk et al., 2008; Hull et al., 2010). Heterologní desenzitizace role PKA a PKC v regulaci GPCRs Jedním ze způsobů, jímž může dojít ke ztrátě citlivosti GPCRs, je heterologní desenzitizace. Ta umožňuje útlum signalizace, a to nejen za předpokladu předchozí aktivace receptorů, ale také v případě, že receptor nebyl vystaven působení agonisty (Ferguson, 2007). Dochází totiž k situaci, kdy tzv. druzí poslové (např. AC, PLC), kteří vzniknou v důsledku stimulace jednoho GPCR, mohou způsobit aktivaci proteinkináz, které pak fosforylují další GPCRs (viz obr. 1). K fosforylaci prostřednictvím PKA a PKC dochází na serinových a/nebo threoninových zbytcích, jež jsou součástí třetí 16

intracelulární smyčky a/nebo C-terminálního konce receptoru (Hendriks-Balk et al., 2008). Kromě toho jsou fosforylované sekvence lokalizovány v místech kontaktu receptoru s G proteinem, z čehož vyplývá, že fosforylace je v přímé kompetici s vazbou na G protein (Kristiansen, 2004). Na rozdíl od fosforylace prostřednictvím GRKs, heterologní mechanizmus desenzitizace nevede k vazbě β-arrestinu (Moore et al., 2007), ale předpokládá se, že hraje velkou roli v internalizaci GPCRs přes membránové rafty a/nebo útvary zvané kaveoly (Rapacciuolo et al., 2003). Dalším typem heterologní regulace může být heterologní down- a up- regulace zahrnující změny v expresi genů a/nebo v translačních procesech (viz příslušnou kapitolu), které jsou často způsobené cytoplazmatickými receptory (např. Kasahara et al., 2011). Homologní desenzitizace role GRKs v regulaci GPCRs Dalším procesem přispívajícím k zeslabení signalizace prostřednictvím GPCRs je homologní desenzitizace. Fosforylace receptoru je zde zajištěna GPCR kinázami (GRKs), které jsou klíčovými modulátory GPCR signalizace. Skupina GRK proteinů se skládá ze sedmi typů savčích serinthreonin protein kináz (Yang and Xia, 2006) fosforylujících a tím pádem také regulujících výhradně receptory aktivované vazbou na agonistu (Premont et al., 1995). Na základě sekvenčních a funkčních podobností se skupina GRK proteinů dále dělí do tří podskupin. Zástupci první skupiny, GRK1 (rhodopsin kinázy) a GRK7 (kinázy čípkových opsinů), se nacházejí pouze v buňkách sítnice. Členové dvou dalších podskupin, GRK2 (β-ark1) a GRK3 (β-ark2), tvoří část podskupiny s lépe známými parametry, GRK 4, GRK5 a GRK6 patří k těm, jejichž role jsou teprve předmětem výzkumu. GRKs se skládají z více než 500 aminokyselinových zbytků. Stejně jako v případě heterologní desenzitizace, fosforylace GPCR prostřednictvím GRKs probíhá na aminokyselinových zbytcích nesených karboxylovým koncem (rhodopsin, β 2 -AR) nebo třetí intracelulární smyčkou receptoru (např. M2 muskarinový receptor). Serin a/nebo threonin, který je v tomto případě fosforylován, je však odlišný od aminokyselinových zbytků fosforylovaných prostřednictvím Obr. 1: Po navázání agonisty na receptor dojde k vytvoøení pøechodného komplexu agonisty s aktivovaným receptorem a G proteinem. GDP je vzápìtí nahrazen GTP a G protein disociuje na své podjednotky (jednotku α a β/γ dimer), které mají v následném signalizaèním procesu rozdílné úlohy. 1) Gα aktivuje nìkteré efektory, jako jsou AC nebo PLC, které pak dále aktivují kinázy aktivované druhým poslem (second-messenger dependent kinases, PKA a PKC). Tyto kinázy mohou fosforylovat i jiné než aktivované receptory, a tím zajistit jejich desenzitizaci. Internalizace receptoru se v tomto pøípadì dìje nejspíše prostøednictvím tzv. kaveol nebo lipidových raftù. Tyto procesy spadají svou podstatou pod tzv. heterologní regulaci. 2) Naopak β/γ dimer aktivuje GRKs, které fosforylují pouze receptory, na nìž byl navázán agonista. Následnì je z cytoplazmy rekrutován β-arrestin, jehož vazba iniciuje aktivování adaptinù, jako jsou klathrin, AP-2 èi dynamin, které dále smìøují receptor do tzv. CCPs k internalizaci. Receptor uzavøený v tzv. tøídicích endozomech je pak transportován buï do degradaèních kompartmentù (lysozomù), nebo recyklován, o èemž rozhodují tzv. tøídicí faktory nesené receptorem. Tyto procesy jsou souèástí tzv. homologní regulace. 17

proteinkináz aktivovaných druhým poslem (Hendriks-Balk et al., 2008). Vizuální a non-vizuální GRKs mají podobnou strukturu, zejména na úrovni vysoce konzervované centrální katalytické domény obsahující D-L-G sekvence a na úrovni N-terminální oblasti. Bylo zjištěno, že určitý úsek o délce 185 aminokyselin vykazuje značné podobnosti. Předpokládá se, že tato homologie v sobě nese informaci o rozpoznání receptoru. Tato oblast proteinu navíc obsahuje tzv. RGS domény, které jsou zodpovědné za znecitlivění receptoru nezávisle na fosforylaci tohoto receptoru (Yang a Xia, 2006; Brinks a Eckhart, 2010). V nestimulovaných buňkách jsou kinázy lokalizovány převážně v cytosolu a s plazmatickou membránou asociují po aktivaci GPCRs. GRK4, GRK5 a GRK6 ovšem vykazují schopnost membránové lokalizace i v případě absence stimulace agonistou (Premont et al., 1995). Při ukotvení GRKs v plazmatické membráně hraje významnou roli C-konec těchto proteinů. U kináz GRK4, GRK5 a GRK6 bylo prokázáno, že nejsou schopny interagovat s β/γ podjednotkami G proteinů pomocí PH (plecstrin homology) domény na C-konci, jako je tomu u GRK2 a GRK3, ale asociují s membránou díky palmitoylaci bílkoviny (případ GRK4 a GRK6) nebo prostřednictvím elektrostatických interakcí mezi karboxy-terminálními aminokyselinami a membránovými fosfolipidy (případ GRK5). V případě GRK1 je spojení s membránou usnadněno díky posttranslační farnesylaci karboxy-terminálního CAAX motivu. β-arks mají navíc schopnost interakce s PIP 2 (Touhara et al., 1995). Na rozdíl od heterologní desenzitizace, fosforylace prostřednictvím GRKs indukuje vazbu β-arrestinu na GPCR (Moore et al., 2007) a GRKs tak hrají důležitou roli nejen v desenzitizaci GPCRs, ale také v internalizaci receptorů (viz obr. 1). Arrestiny nejen klíčové regulátory desenzitizace Skupina proteinů, které hrají v regulaci signalizace prostřednictvím GPCRs klíčovou roli, tzv. arrestinů, se skládá ze čtyř členů. Vizuální arrestiny, arrestin 1 a arrestin 4, jsou exprimovány téměř výhradně v sítnici. Nezrakové (non-vizuální) arrestiny, arrestin 2 (β-arrestin1) a arrestin 3 (β-arrestin2) jsou exprimovány ve většině tkání (Patel et al., 2009). Vzhledem k tomu, že vizuální arrestiny mají určité specifické vlastnosti, které nejsou aplikovatelné na regulaci prostřednictvím GPCRs, zaměříme se zde pouze na β-arrestiny. Přestože β-arrestiny mohou být v případě potřeby lokalizovány v buněčném jádře i na plazmatické membráně, u nestimulovaných buněk je najdeme především v cytoplazmě. Tyto proteiny byly zpočátku známy především svou rolí v desenzitizaci aktivovaného receptoru. Při stimulaci receptoru agonistou dochází k jejich přemístění na buněčnou membránu, kde se vážou na intracelulární stranu aktivovaných receptorů (Gurevich a Gurevich, 2006). Afinita receptoru k bílkovinám arrestinu roste s fosforylací receptorů prostřednictvím GRKs (Moore et al., 2007) (viz obr. 1). Vazba arrestinu zabraňuje dalším interakcím mezi receptorem a G proteinem, což vede ke snížení až zamezení signalizace prostřednictvím těchto receptorů (Claing et al., 2002). Vazba arrestinu je v tomto směru velmi důležitá. Bylo zjištěno, že samotná fosforylace receptoru působením GRKs, bez přítomnosti arrestinu, má jen velmi malý efekt na rozpadnutí komplexu receptor/g protein. Kromě důležité role β-arrestinů v homologní desenzitizaci jsou tyto proteiny velmi podstatnou součástí mechanizmů tzv. internalizace receptoru a ovlivňují také jeho osud během vnitrobuněčného zpracování (trafficking, viz související odstavec níže). Kromě toho máme čím dál více důkazů o tom, že β-arrestiny plní i funkci tzv. scaffolders a propojují GPCRs s různými dalšími signalizačními drahami plně nezávislými na aktivaci G proteinu, jako je například MAPK kaskáda (Gurevich a Gurevich, 2006; Ma a Pei, 2007; Patel et al., 2009). Nedávné studie navíc prokázaly, že v reakci na aktivaci některých GPCRs asociují β-arrestiny s transkripčními kofaktory (v jádře) nebo s jejich regulátory (v cytoplazmě), a hrají tak důležitou roli v růstu buňky, apoptóze či imunitních funkcích (Ma a Pei, 2007). Výsledky nedávných studií svědčí také o tom, že non-vizuální β-arrestiny ovlivňují i endocytózu jiných receptorů než 7TMR, čímž regulují signalizaci prostřednictvím receptorů jiného typu, než jsou samotné GPCRs (např. IGF-1R, viz Shenoy a Lefkowitz, 2011). MECHANIZMY REGULACE GPCRS NEZÁVISLÉ NA FOSFORYLACI Nedávné studie ukazují, že vedle desenzitizace zprostředkované fosforylací existují také mechanizmy, které se na útlumu signalizace GPCRs podílejí nezávisle na fosforylaci receptorů (Ferguson, 2007). Bylo zjištěno, že N-terminální oblasti všech GRKs obsahují tzv. RGS domény, u nichž byla prokázána schopnost podílet se na regulaci GPCRs nezávisle na fosforylaci. Tento mechanizmus regulace receptorů byl prokázán především pro GRK2 a GRK3 (Carman et al., 1999). INTERNALIZACE A POSTENDOCYTICKÝ OSUD GPCRS Dlouhodobá desenzitizace (v řádu minut až několika hodin) GPCRs vede k internalizaci receptorů neboli k tzv. sekvestraci či endocytóze. Endocytický proces hraje důležitou roli nejen v útlumu GPCR signalizace při přetrvávající stimulaci agonistou, ale účastní se také procesů resenzitizace či downregulace receptorů (Luttrell a Lefkowitz, 2002). Internalizace Internalizace receptorů je na agonistovi závislý proces, který napomáhá k přesunu povrchových receptorů aktivovaných ligandem z plazmatické membrány do intracelulárních kompartmentů, které s membránou asociují. Tento proces je zprostředkován serinovou a/nebo threoninovou fosforylací receptoru a vazbou arrestinu (Marchese et al., 2008). Z biochemického hlediska se jedná o snížení vazebných míst receptoru na plazmatické membráně při zachování celkového počtu receptorů. K procesu internalizace může dojít různými způsoby, nejčastěji prostřednictvím tzv. clathrin-coated pits (klatrinem 18

potažených jamek, CCP) a lipidových raftů (člunků) nebo tzv. kaveol (Hendriks-Balk et al., 2008) (viz obr. 1). V tomto procesu představují β-arrestiny pro mnoho GPCRs klíčové regulátory fungující jako tzv. adaptérové bílkoviny se schopností propojení aktivovaných receptorů se zásadními složkami internalizační mašinérie klathrinem a AP-2 (Gurevich a Gurevich, 2006) (viz obr. 1). Jakmile dojde k přesunu GPCRs do CCPs, β-arrestiny umožní také asociaci s dynaminem, který způsobí zaškrcení a následné odstřižení vznikající vezikuly od plazmatické membrány (Jean-Alphonse a Hanyaloglu, 2011). Kromě tohoto nejčastějšího a také nejlépe popsaného mechanizmu endocytózy, který je závislý na arrestinu a klathrinu, existují i jiné endocytické mechanizmy s různou závislostí na účasti arrestinu, klathrinu a/nebo dynaminu (související práce viz Prossnitz, 2004). Osud receptoru v intracelulárním prostředí (trafficking) Jakmile je GPCR internalizován, v intracelulárním prostředí může dojít k několika jevům. Jejich osudem se stává buď okamžitá enzymatická degradace v lysozomech (tento proces vede k downregulaci receptorů), může dojít ale také k jejich recyklaci zpět na plazmatickou membránu (tento proces je označován jako resenzitizace) či k jejich zadržení v endozomech, a tím ke zpomalení jak degradačních, tak recyklačních procesů (Jean- Alphonse a Hanyaloglu, 2011). Jak již bylo zmíněno, je stále jasnější, že i v procesech traffickingu hrají důležitou regulační roli β-arrestiny, a to na několika úrovních. V tomto ohledu jde o jakési třídicí činitele, kteří jsou schopni rozhodovat, zda jednotlivé receptory podstoupí dráhy degradačních nebo naopak recyklačních procesů. Konečný osud jednotlivých receptorů závisí na pevnosti jejich interakce s β-arrestiny během procesu internalizace a/nebo traffickingu. Jedna skupina GPCR receptorů, receptory třídy A, interagují přednostně s β-arrestinem2. Jejich interakce je slabá a přechodná, což vede k rychlé disociaci internalizovaného komplexu receptor-β-arrestin v endozomech a k následné okamžité recyklaci receptorů na plazmatickou membránu. Receptory třídy B vážou oba typy β-arrestinů s podobnou afinitou. Jejich interakce je silnější a tedy i dlouhodobější. Internalizované komplexy receptor-β-arrestin pak cestují společně, což vede ke zpomalení procesu recyklace a naopak k upřednostnění mechanizmů lysozomální degradace (Luttrell a Lefkowitz, 2002; Patel et al., 2009). Ohledně fungování arrestinů je nutné zmínit také to, že jak jejich funkce v endocytických procesech, tak jejich role v mechanizmech traffickingu jsou regulovány prostřednictvím posttranslačních modifikací, jako jsou fosforylace nebo ubiquitinace (další informace viz Shenoy a Lefkowitz, 2003; Wolfe a Trejo, 2007). Nedávné studie navíc prokázaly, že dalším regulačním jevem může být v tomto směru i S-nitrosylace klíčových prostředníků GPCR traffickingu (viz bod 4.2. v Jean-Alphonse a Hanyaloglu, 2011; Lima et al., 2010; Daaka, 2011). Výsledky nedávných studií představily také některé další typy tzv. třídicích faktorů, které jsou schopny určit, zda internalizovaný receptor podstoupí recyklační nebo degradační dráhu. Endozomální osud určují spíše krátké lineární peptidové sekvence obsahující především tyrosinové a dileucinové motivy, nebo tzv. PDZ ligandy. Naopak v lysozomech končí hlavně receptory, které byly vystaveny ubiquitinaci (Marchese et al., 2008) (viz obr. 1). Resenzitizace Proces resenzitizace zahrnuje endocytózu desenzitizovaného receptoru, defosforylaci tohoto receptoru v endocytických vezikulách (váčcích) a jeho následnou recyklaci zpět na membránu buňky. Jedná se o proces recyklace receptoru, který zabraňuje akumulaci a degradaci receptoru uvnitř buňky (Kristiansen, 2004) a umožňuje zahájení dalších kol signalizačních mechanizmů. Jak již bylo zmíněno, krátké lineární peptidové sekvence nesoucí tyrosin- a dileucinové motivy, či PDZ ligandy hrají klíčovou roli v míře recyklace GPCRs. Shrneme-li úlohu β-arrestinů v regulaci tohoto procesu, receptory třídy A jsou resenzitizovány rychleji než receptory třídy B. Je tedy upřednostněna jejich recyklace na membránu, protože tvoří s β-arrestiny komplexy se slabší vazbou. Downregulace Downregulační mechanizmus řízení GPCRs signalizace je odstartován jako následek dlouhodobého nebo opakovaného působení agonisty na receptor (v řádu hodin až dnů). Na rozdíl od rychlého procesu internalizace odpovídajícímu intracelulárnímu přerozdělování receptorů, je downregulace pomalejší a vyznačuje se poklesem celkového počtu receptorů přítomných v buňkách a tkáních (Tsao et al., 2001). Dalším rozdílem je i to, že receptory, které již prošly mechanizmem downregulace, nemohou být znovu recyklovány, což je v případě internalizovaných receptorů stále možné. Proces downregulace zahrnuje v prvé řadě zvýšení proteozomalní a/nebo lysozomální degradace internalizovaných GPCRs. Tyto degradační procesy mohou být umocněny agonist-indukovanou ubiquitinací receptoru. Za druhé, mechanizmus downregulace spočívá také ve snížení syntézy GPCRs. K tomuto jevu může dojít prostřednictvím změn na jedné i několika molekulárních úrovních (Schmidt a Meyer, 1994): a) změny na úrovni transkripce tj. snížení míry transkripce genu určitého receptoru b) změny na posttranskripční úrovni tj. změny ve stabilitě mrna c) změny na posttranslační úrovni tj. zkrácení biologického poločasu receptoru jako proteinu Tyto molekulární mechanizmy mohou být zprostředkovány dvěma způsoby. Za prvé jde o přímou interakci mezi regulační molekulou a cílovým genem. V případě β-ar najdeme minimálně dvě takové regulační molekuly se schopností modulovat syntézu bílkoviny β-adrenergního receptoru: CREB camp response element binding protein nebo CREM camp response element binding modulator. Tyto molekuly interagují s CRE (camp response element), který se nachází v oblasti promotéru genu pro β-adrenergní receptor (Vallejo, 1994), a jsou tak schopny účinně regulovat produkci GPCRs (Huang et al., 2010). 19

Druhým (a hypotetickým) mechanizmem je nepřímá cesta regulace prostřednictvím tzv. třetích poslů (Hughes a Dragunow, 1995). Třetí poslové jsou bílkoviny syntetizované bezprostředně po aktivaci receptoru, který je schopen modulace cílových genů. Vzhledem k velmi rychlé syntéze těchto bílkovin jsou jejich vlastní geny nazývány tzv. immediate early genes. Senzitizace a upregulace Existují ale také situace, kdy je receptor stimulován nedostatečně (denervace, blokáda receptoru působením antagonisty). V takových situacích může dojít k tzv. senzitizaci receptoru nebo jeho upregulaci. Mechanizmy senzitizace mohou zahrnovat a) aktivaci většího množství druhých poslů, b) zvýšení koncentrace enzymů katalyzujících syntézu druhých poslů nebo c) změny v citlivosti receptoru na působení agonisty. Upregulace má podobnou povahu jako downregulace (tj. jde o změny na úrovni transkripce nebo změny na posttranskripční či posttranslační úrovni) (Myslivecek a Trojan, 2000). nositelem selektivity vůči receptoru N-terminální oblast, zatímco větší RGS bílkoviny mohou interagovat s příslušným receptorem přímo prostřednictvím tzv. vazebných domén (např. PDZ domén, viz též výše). Z některých dalších studií navíc vyplývá, že RGS bílkoviny, zejména ty větší, mohou mít i funkci jakéhosi integrátora signalizačních drah aktivovaných prostřednictvím GPCRs, a to díky své schopnosti vytvářet a udržovat tzv. multiproteinové komplexy (Hollinger a Hepler, 2002). Tyto komplexy fungují na bázi multifunkčních signalizačních platforem, které pro svou soudržnost a funkčnost povolávají do svého jádra řadu již zmiňovaných scaffolding proteins. U některých takových scaffolders bylo navíc zjištěno, že slouží i jako regulátory samotných RGS bílkovin, např. spinophilin (viz spinophilin/ neurabin rovnováha Wang et al., 2007). Předešlý odstavec shrnuje jen několik základních funkcí RGS bílkovin v buňkách. Jak je zřejmé z nadpisu tohoto článku, soustředili jsme se především na pátrání po nových zjištěních ohledně interakcí mezi RGS bílkovinami a GPCRs. Tyto bílkoviny nicméně vstupují do kontaktu s mnoha dalšími proteiny, což jim propůjčuje mnohem širší spektrum biologických funkcí. RGS V REGULACI GPCRS Během posledních pár let se pozornost v oblasti studia regulace signalizačních drah aktivovaných prostřednictvím GPCRs obrací k novému mechanizmu regulace, kterého se účastní tzv. RGS bílkoviny neboli regulators of G protein signaling, tedy regulátory G proteinové signalizace. Tato relativně nová skupina proteinů se objevila ve druhé polovině 90. let (Hollinger a Hepler, 2002). Od té doby bylo v lidském genomu identifikováno 37 genů kódujících proteiny s RGS nebo s tzv. RGS-like oblastmi (Willars, 2006). Členové této skupiny bílkovin sdílejí pro ně charakteristickou oblast s tzv. RGS-homologií o 120 130 aminokyselinách a jsou zařazováni do šesti odlišných podskupin (viz (Hendriks-Balk et al., 2008). RGS bílkoviny byly zpočátku popisovány jako aktivátory GTPáz (neboli GAPs z angl. GTPase activating proteins), a to díky své schopnosti urychlit hydrolýzu GTP zprostředkovanou Gα podjednotkami, a tím ukončit aktivační cyklus G proteinu (De Vries et al., 2000, Ross a Wilkie, 2000) (viz obr. 1). Další studie prokázaly, že RGS bílkoviny jsou schopné regulovat signalizaci prostřednictvím GPCRs také pomocí mechanizmů, které jsou na GAP aktivitě nezávislé. Bylo zjištěno, že může docházet k regulaci signalizačních procesů buď prostřednictvím přímé interakce mezi jednotlivými proteiny, které se signalizačních drah účastní (např. efektorový antagonismus RGS4 v případě G protein-plc interakce), ovlivněním subcelulární lokalizace signálních molekul, nebo modulací translačních mechanizmů (Bansal et al., 2007; Sjögren et al., 2010). Co se týče regulace prostřednictvím interakce protein-protein, je stále zřejmější, že řada RGS bílkovin je schopna se vázat přímo na určité typy GPCRs a modulovat tak jejich signalizační dráhy přímým kontaktem (rozsáhlejší popis těchto interakcí viz (Abramow-Newerly et al., 2006; Neitzel and Hepler, 2006; Bansal et al., 2007). Existence přímé RGS-GPCR interakce byla podpořena také zjištěním, že koexprese obou bílkovin vedla k přesunu RGS bílkovin k buněčné membráně (Roy et al., 2003). V případě malých RGS je předpokládaným ZÁVĚR Signalizace prostřednictvím GPCRs, které jsou největší, nejvšestrannější a nejpřizpůsobivější skupinou membránových receptorů, hraje zásadní roli v mnoha fyziologických funkcích. Jedná se o velmi dobře řízený proces, který zahrnuje několik kroků regulace na všech úrovních signalizace. Ke snížení a/ nebo oslabení signalizace vedou na úrovni GPCRs tři procesy: desenzitizace, internalizace a downregulace; zatímco resenzitizace, senzitizace a upregulace zvyšují citlivost na stimulaci agonistou a obnovují tak schopnost receptoru aktivovat své signalizační dráhy. Kromě těchto diskrétních mechanizmů regulace je v posledních letech označován za významný regulační mechanizmus GPCR signalizace také komplexní systém tzv. receptor traffickingu. Schopnost reakce receptoru na extracelulární podněty je navíc řízena také přímou interakcí s řadou bílkovin, zejména pak s tzv. RGS proteiny. Novější modely dokonce předpokládají, že GPCRs fungují jako multifunkční platformy, kde dochází k těsné kolokalizaci receptorů a G proteinů s dalšími proteiny zapojenými do transdukce konkrétních signálu, stejně jako s řadou regulačních či adaptinových bílkovin nebo s tzv. scaffolders. Závěrem pak připomeňme, že signalizace prostřednictvím GPCRs již dávno není považována za mechanizmus výhradně homologního charakteru, ale že se jí účastní také heterologní procesy, a tedy i systémy regulace existují jak na homologní, tak na heterologní úrovni. DALŠÍ PERSPEKTIVY Receptory spřažené s G proteiny a signalizační dráhy s nimi spojené hrají klíčovou roli v řadě onemocnění, ať už se jedná o kardiovaskulární potíže, dysfunkce imunitního či nervového systému a další. Proto jsou tyto receptory stejně jako signální molekuly jimi aktivovaných drah velmi častým cílem terapeutických látek. Ve vývoji dalších léčiv v této oblasti se dnes 20

otevírá možnost orientace výzkumu směrem, který by hledal způsoby, jak narušit interakce mezi bílkovinami adaptinů či scaffoldů a hlavními účastníky GPCR signalizace. Jako další trend v hledání látek s léčebným účinkem se nabízí zaměření výzkumu na GPCR trafficking. Ať už se ale další vývoj léků orientovaných na signalizační dráhy s účastí GPCRs bude ubírat kterýmkoli směrem, velký potenciál pro úspěšnost tohoto výzkumu spočívá ve využití nových nástrojů z oboru počítačových simulací a modelování protein-proteinových interakcí. Nové perspektivy se otevírají také v oblasti základního výzkumu samotné signalizace prostřednictvím GPCRs. Byly totiž otevřeny nové možnosti studia regulačních mechanizmů, které se týkají oligomerizace těchto membránových receptorů. U tohoto jevu totiž stále ještě není jasné, zda jde o obecně relevantní jev pro všechny typy GPCRs či nikoli (Milligan, 2007; Maurice et al., 2011). Poděkování: Tato publikace vznikla za podpory grantu GACR309/09/0406. Rádi bychom poděkovali Ondřeji Hofmanovi za grafické zpracování ilustrace. Definice vybraných pojmů: G proteiny (guanin nukleotid-vazebné proteiny) bílkoviny, které se účastní přenosu různých signálů z vnějšího do vnitřního prostředí buňky. Patří do skupiny GTPáz. Velké G proteiny jsou heterotrimerické struktury složené z α, β a γ podjednotek a k jejich aktivaci dochází prostřednictvím GPCRs. Menší G proteiny (20 25 kda) jsou monomerické a jde o malé GTPázy ze skupiny Ras proteinů. Oba tyto typy váží GTP (aktivní stav G proteinu) nebo GDP (inaktivní stav). GTPázy enzymy ze skupiny hydroláz. Váží a jsou schopny hydrolyzovat GTP na GDP. Regulační GTPázy jako G proteiny mají vlastní GTPázovou aktivitu, která jim umožňuje spouštět nebo naopak vypínat jejich schopnost přenosu signálu. GEF (z angl. guanine nukleotide exchange factor) faktor pro výměnu guaninových nukleotidů je protein, který je schopen aktivovat GTPázy tím, že usnadňuje disociaci GDP a jeho nahrazení molekulou GTP. GAPs (z angl. GTPase activating proteins) regulační bílkoviny, které jsou schopny vazby na aktivované proteiny asociující s GTP (např. G proteiny), zvyšují míru hydrolýzy GTP a ukončují tak přenos signálu. RGS (z angl. regulators of G protein signaling) multifunkční bílkoviny, které urychlují hydrolýzu GTP a jsou tak schopny rychlé inaktivace G proteinů. Fungují tedy jako tzv. GAPs, viz výše. Jejich regulační schopnost je zakódována v tzv. RGS homology doménách. V některých RGS bílkovinách jsou ale kódovány i další domény, které jim propůjčují řadu jiných funkcí. PLC (fosfolipáza C) hydrolytický enzym, který štěpí fosfolipidy před fosfátovou skupinou. Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP 2) je tak štěpen na dvě důležité molekuly, které plní funkci tzv. druhých poslů: diacylglycerol (DAG) a inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3). IP3 iniciuje zvýšení koncentrace cytosolického kalcia, kalcium společně s DAG aktivuje protein kinázu C (PKC), která vstupuje jako regulační faktor do řady signalizačních drah. AC (adenylát cykláza) enzym, který po aktivaci G proteinem (GS) katalyzuje konverzi AMP na camp. camp (cyklický adenosin monofosfat) důležitý druhý posel, který se účastní řady signalizačních drah, kde aktivuje např. proteinkinázu A (PKA). PKA/PKC (proteinkináza A/C) enzymy, které fosforylují serinové a threoninové zbytky bílkovin, jejichž funkce jsou tímto způsobem schopny regulovat. Jsou aktivovány tzv. druhými posly, kterými jsou např. camp nebo DAG/Ca 2+. Kromě jiných funkcí, které v buňce mají, jsou tyto enzymy důležitými regulátory tzv. heterologní desenzitizace GPCRs. GRK (GPCR kinázy) proteinkinázy, které se účastní homologní desenzitizace (regulace) GPCRs. Fosforylují serinové a/nebo treoninové zbytky aktivovaných receptorů. Fosforylované zbytky vážou arrestiny, čímž je znemožněna opětovná asociace receptorů s G proteiny a naopak umožněna iniciace procesu tzv. internalizace receptoru neboli endocytózy. -arrestiny malé bílkoviny s důležitou rolí v regulaci přenosu signálu. Účastní se procesů desenzitizace, internalizace i následného traffickingu. Kromě jejich schopnosti se vázat na GPCRs mohou asociovat i s dalšími typy receptorů a signálních molekul. Scaffolding proteins či scaffolders bílkoviny, které mají schopnost interagovat s řadou komponentů signálních komplexů a zlepšovat tak efektivitu a specificitu drah buněčné signalizace. Clathrin-coated pits (CCP) malé struktury, které váží klathrin, adaptiny a jiné regulační proteiny na vnitřní stranu buněčné membrány, aby zajistily její deformaci. Tento proces pak vede k postupnému uzavírání vchlípených částí membrány a k vytvoření klathrinem potažených váčků (tzv. CCVs z angl. clathrin coated vesicles). Klathrin bílkovina, která asociuje s klathrinovými váčky (CCVs) a má schopnost třídit jejich obsah mezi endocytózou a biosyntetickými drahami. AP-2 multimerní bílkovina, která funguje podobně jako klathrin a usnadňuje internalizaci obsahu vezikul během endocytózy. Dynamin GTPáza, která tvoří spirálu kolem zúžení váčku vznikajícího vchlipováním membrány. Kaveola zvláštní typ lipidových raftů (člunků), které zprostředkovávají mechanizmus endocytózy nezávislý na klathrinu. Tyto struktury obsahují bílkovinu kaveolin, která způsobuje místní morfologické změny plazmatické membrány vedoucí ke vzniku invaginací lahvovitého tvaru bohatých na cholesterol. Lysozom buněčná organela obsahující hydrolytické enzymy, účastní se trávení buněčného odpadu. Endozom buněčná organela obsahující materiál pohlcený prostřednictvím endocytózy. Rozlišujeme několik stavů těchto organel. Endocytické váčky splývají s tzv. ranými endozomy. Rané endozomy pak mají povahu buď tzv. třídících endozomů, nebo tzv. recyklačních endozomů. V třídících endozomech dochází k oddělení receptoru a jeho ligandu. Volné receptory určené k recyklaci jsou transportovány do recyklačních endo- 21

zomů. Ostatní receptory, stejně jako volné ligandy, zůstávají v třídicích endozomech, jejichž vnitřní prostředí je čím dál kyselejší. Tyto endozomy pak dozrávají v pozdní endozomy, které fúzují s lysozomy. Určení mezi degradačními a recyklačními drahami probíhá prostřednictvím tzv. třídících agentů (ubiquitin, arrestin, PDZ vazebný protein atd.) Ubiquitin regulační protein o velikosti 76 aminokyselin, který vytváří konjugáty s cílovou bílkovinou prostřednictvím lyzinových zbytků. Bílkovina značená ubiquitinem je pak směrována ke své degradaci. PDZ domény vazebné domény o velikosti 80 90 aminokyselin, které jsou často součástí signalizačních bílkovin a tzv. scaffolders. Jejich název je kombinací počátečních písmen prvních členů této skupiny: post synaptic density protein (Psd95), Drosophila disc large tumor suppressor (Dlg1), and zonula occludens-1 protein (ZO-1). doc. MUDr. Jaromír Mysliveček, Ph.D. Fyziologický ústav 1. LF Univerzity Karlovy Albertov 5 128 00 Praha E-mail: jmys@lf1.cuni.cz LITERATURA 1. Abramow-Newerly M, Roy AA, Nunn C, Chidiac P (2006) RGS proteins have a signalling complex: interactions between RGS proteins and GPCRs, effectors, and auxiliary proteins. Cell Signal 18: 579-591. 2. Bansal G, Druey KM, Xie Z (2007) R4 RGS proteins: regulation of G protein signaling and beyond. Pharmacol Ther 116: 473-495. 3. Brinks HL, Eckhart AD (2010) Regulation of GPCR signaling in Hypertension. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Molecular Basis of Disease 1802: 1268-1275. 4. Cabrera-Vera TM, Vanhauwe J, Thomas TO, Medkova M, Preininger A, Mazzoni MR, Hamm HE (2003) Insights into G Protein Structure, Function, and Regulation. Endocr Rev 24: 765-781. 5. Carman CV, Parent J-L, Day PW, Pronin AN, Sternweis PM, Wedegaertner PB, Gilman AG, Benovic JL, Kozasa T (1999) Selective Regulation of Gαq/11 by an RGS Domain in the G Protein-coupled Receptor Kinase, GRK2. Journal of Biological Chemistry 274: 34483-34492. 6. Claing A, Laporte SA, Caron MG, Lefkowitz RJ (2002) Endocytosis of G protein-coupled receptors: roles of G protein-coupled receptor kinases and beta-arrestin proteins. Prog Neurobiol 66: 61-79. 7. Daaka Y. (2011) S-nitrosylation-regulated GPCR signaling. Biochim Biophys Acta. 8. De Vries L, Zheng B, Fischer T, Elenko E, Farquhar MG (2000) The regulator of G protein signaling family. Annu Rev Pharmacol Toxicol 40: 235-271. 9. Ferguson SS (2007) Phosphorylation-independent attenuation of GPCR signalling. Trends Pharmacol Sci 28: 173-179. 10. Fredriksson R, Lagerström MC, Lundin L-G, Schiöth HB (2003) The G Protein-Coupled Receptors in the Human Genome Form Five Main Families. Phylogenetic Analysis, Paralogon Groups, and Fingerprints. Molecular Pharmacology 63: 1256-1272. 11. Gurevich EV, Gurevich VV (2006) Arrestins: ubiquitous regulators of cellular signaling pathways. Genome Biol 7: 236. 12. Hendriks-Balk MC, Peters SLM, Michel MC, Alewijnse AE (2008) Regulation of G protein-coupled receptor signalling: Focus on the cardiovascular system and regulator of G protein signalling proteins. European Journal of Pharmacology 585: 278-291. 13. Hollinger S, Hepler JR (2002) Cellular Regulation of RGS Proteins: Modulators and Integrators of G Protein Signaling. Pharmacological Reviews 54: 527-559. 14. Huang Y, Qiu AW, Peng YP, Liu Y, Huang HW, Qiu YH (2010) Roles of dopamine receptor subtypes in mediating modulation of T lymphocyte function. Neuro Endocrinol Lett 31: 782-791. 15. Hughes P, Dragunow M (1995) Induction of immediate-early genes and the control of neurotransmitter-regulated gene expression within the nervous system. Pharmacological Reviews 47: 133-178. 16. Hull LC, Llorente J, Gabra BH, Smith FL, Kelly E, Bailey C, Henderson G, Dewey WL (2010) The Effect of Protein Kinase C and G Protein- Coupled Receptor Kinase Inhibition on Tolerance Induced by μ-opioid Agonists of Different Efficacy. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 332: 1127-1135. 17. Hur E-M, Kim K-T (2002) G protein-coupled receptor signalling and cross-talk: Achieving rapidity and specificity. Cellular Signalling 14: 397-405. 18. Jean-Alphonse F, Hanyaloglu AC (2011) Regulation of GPCR signal networks via membrane trafficking. Molecular and Cellular Endocrinology 331: 205-214. 19. Kasahara M, Groenink L, Olivier B, Sarnyai Z (2011) Corticotropinreleasing factor (CRF) over-expression down-regulates hippocampal dopamine receptor protein expression and CREB activation in mice. Neuro Endocrinol Lett 32: 193-198. 20. Kristiansen K (2004) Molecular mechanisms of ligand binding, signaling, and regulation within the superfamily of G protein-coupled receptors: molecular modeling and mutagenesis approaches to receptor structure and function. Pharmacology & Therapeutics 103: 21-80. 21. Lee NH, Fraser CM (1993) Cross-talk between m1 muscarinic acetylcholine and beta 2-adrenergic receptors. camp and the third intracellular loop of m1 muscarinic receptors confer heterologous regulation. J Biol Chem 268: 7949-7957. 22. Lima B, Forrester MT, Hess DT, Stamler JS (2010) S-Nitrosylation in Cardiovascular Signaling. Circ Res 106: 633-646. 23. Luttrell LM, Lefkowitz RJ (2002) The role of β-arrestins in the termination and transduction of G protein-coupled receptor signals. Journal of Cell Science 115: 455-465. 24. Ma L, Pei G (2007) β-arrestin signaling and regulation of transcription. Journal of Cell Science 120: 213-218. 25. Marchese A, Paing MM, Temple BR, Trejo J (2008) G protein-coupled receptor sorting to endosomes and lysosomes. Annu Rev Pharmacol Toxicol 48: 601-629. 26. Maurice P, Kamal M, Jockers R (2011) Asymmetry of GPCR oligomers supports their functional relevance. Trends in pharmacological sciences 32: 514-520. 27. Milligan G (2007) G protein-coupled receptor dimerisation: Molecular basis and relevance to function. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1768: 825-835. 28. Milligan G, Kostenis E (2006) Heterotrimeric G proteins: a short history. Br J Pharmacol 147 Suppl 1: S46-55. 29. Moore CAC, Milano SK, Benovic JL (2007) Regulation of Receptor Trafficking by GRKs and Arrestins. Annual Review of Physiology 69: 451-482. 30. Myslivecek J, Trojan S (2000) Mechanisms of G protein coupled receptor regulation. Sb Lek 101: 205-213. 31. Nathanson N, M. (1989) Regulation and development of muscarinic receptor number and function. In: Brown JH (ed.) The muscarinic receptors Humana Press, Clifton, pp. 419-454. 22

32. Neitzel KL, Hepler JR (2006) Cellular mechanisms that determine selective RGS protein regulation of G protein-coupled receptor signaling. Semin Cell Dev Biol 17: 383-389. 33. Patel PA, Tilley DG, Rockman HA (2009) Physiologic and cardiac roles of [beta]-arrestins. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 46: 300-308. 34. Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ (2002) Signalling: Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3: 639-650. 35. Premont R, Inglese J, Lefkowitz R (1995) Protein kinases that phosphorylate activated G protein-coupled receptors. The FASEB Journal 9: 175-182. 36. Prossnitz ER (2004) Novel roles for arrestins in the post-endocytic trafficking of G protein-coupled receptors. Life Sciences 75: 893-899. 37. Rapacciuolo A, Suvarna S, Barki-Harrington L, Luttrell LM, Cong M, Lefkowitz RJ, Rockman HA (2003) Protein Kinase A and G Proteincoupled Receptor Kinase Phosphorylation Mediates β-1 Adrenergic Receptor Endocytosis through Different Pathways. Journal of Biological Chemistry 278: 35403-35411. 38. Ross EM, Wilkie TM (2000) GTPase-activating proteins for heterotrimeric G proteins: regulators of G protein signaling (RGS) and RGS-like proteins. Annu Rev Biochem 69: 795-827. 39. Roy AA, Lemberg KE, Chidiac P (2003) Recruitment of RGS2 and RGS4 to the Plasma Membrane by G Proteins and Receptors Reflects Functional Interactions. Molecular Pharmacology 64: 587-593. 40. Shenoy SK, Lefkowitz RJ (2003) Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J 375: 503-515. 41. Shenoy SK, Lefkowitz RJ (2011) [beta]-arrestin-mediated receptor trafficking and signal transduction. Trends in pharmacological sciences 32: 521-533. 42. Schmidt TJ, Meyer AS (1994) Autoregulation of corticosteroid receptors. How, when, where, and why? Receptor 4: 229-257. 43. Schulte G, Levy FO (2007) Novel aspects of G protein-coupled receptor signalling -different ways to achieve specificity. Acta Physiol (Oxf) 190: 33-38. 44. Sjögren B, Blazer LL, Neubig RR (2010) Regulators of G Protein Signaling Proteins as Targets for Drug Discovery. In: Charles AL (ed.) Progress in Molecular Biology and Translational Science. Academic Press, pp. 81-119. 45. Touhara K, Koch WJ, Hawes BE, Lefkowitz RJ (1995) Mutational analysis of the pleckstrin homology domain of the beta-adrenergic receptor kinase - Differential effects on G(beta gamma) and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate binding. Journal of Biological Chemistry 270: 17000-17005. 46. Tsao P, Cao T, von Zastrow M (2001) Role of endocytosis in mediating downregulation of G protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences 22: 91-96. 47. Vallejo M (1994) Transcriptional control of gene expression by campresponse element binding proteins. J Neuroendocrinol 6: 587-596. 48. Vázquez-Prado J, Casas-González P, García-Sáinz JA (2003) G proteincoupled receptor cross-talk: pivotal roles of protein phosphorylation and protein-protein interactions. Cellular Signalling 15: 549-557. 49. Wang X, Zeng W, Kim MS, Allen PB, Greengard P, Muallem S (2007) Spinophilin/neurabin reciprocally regulate signaling intensity by G protein-coupled receptors. EMBO J 26: 2768-2776. 50. Willars GB (2006) Mammalian RGS proteins: multifunctional regulators of cellular signalling. Semin Cell Dev Biol 17: 363-376. 51. Wolfe BL, Trejo J (2007) Clathrin-Dependent Mechanisms of G Protein-coupled Receptor Endocytosis. Traffic 8: 462-470. 52. Xiao J, Huang HW, Peng YP, Bao JY, Huang Y, Qiu YH (2010) Modulation of natural killer cell function by alpha-adrenoreceptor-coupled signalling. Neuro Endocrinol Lett 31: 635-644. 53. Yang W, Xia SH (2006) Mechanisms of regulation and function of G protein-coupled receptor kinases. World J Gastroenterol 12: 7753-7757. 23