Poloprovoz Hydrolýza a frakcionace lignocelulosových materiálů
Vypracovali: VŠCHT Praha Ústav biotechnologie Ing. Marek Drahokoupil Ing. Barbora Branská, PhD Dr. Ing. Leona Paulová Ing. Maryna Vasylkivska doc. Dr. Ing. Petra Patáková prof. Ing. Karel Melzoch, CSc. Rabbit Trhový Štěpánov a.s. Ing. Zdeněk Jandejsek Ing. Tomáš Fulín EcoFuel Labs Ing. Petr Kaštánek, PhD Briklis Aleš Svátek
Obsah Úvod do problematiky:... 3 Provedení poloprovozní zkoušky:... 4 Výsledky... 7 Závěr... 15 Příloha I Metodika rozboru pšeničné slámy.16 Úvod do problematiky: Cílem poloprovozní zkoušky, provedené v září 2017, na zařízení vyvinutém firmou Briklis a umístěném v areálu závodu Rabbit Trhový Štěpánov a.s. bylo ověření možnosti převodu části technologie, chráněné CZ patentem č. 306795 z laboratorního do poloprovozního měřítka. Podstatou zmiňovaného patentu je společná hydrolýza směsi zemědělských odpadů z rostlinné a živočišné výroby, kterou lze využít jako kompletní, levné kultivační médium pro mikrobiální produkci biopaliv, etanolu nebo butanolu. Rostlinný materiál, v tomto případě pšeničná sláma obsahuje lignocelulosový komplex, jehož součástí jsou polysacharidy, celulosa a hemicelulosa. Tyto polysacharidy jsou potenciálním zdrojem uhlíku a energie pro mikroorganismy, avšak vzhledem k tomu, že tvoří komplex s ligninem, jsou pro většinu mikroorganismů v nativním, přírodním stavu nevyužitelné. Lignocelulosový komplex jako takový je obtížně štěpitelný i přímou enzymovou hydrolýzou; aplikované enzymy se nemohou k polysacharidům dostat a výtěžnost přímé enzymové hydrolýzy je tak velmi nízká, kolem 5%. Proto je nutné lignocelulosový komplex rozrušit a uvolnit celulosu a hemicelulosu z vazby s ligninem. K tomu lze použít alkalickou hydrolýzu za mírných podmínek. Po skončení alkalické hydrolýzy je provedena neutralizace kyselinou fosforečnou, která zároveň slouží v médiu jako zdroj fosforu, a jsou přidány celulolytické enzymy, které štěpí přítomné polysacharidy na mikrobiálně využitelné monomery, glukosu, xylosu, arabinosu a další minoritní složky. Živočišný materiál, v tomto případě kuřecí peří, slouží jako zdroj dusíku. Peří je totiž z cca 90% tvořeno bílkovinou keratinem, která je vhodným zdrojem aminokyselin a peptidů, tedy mikrobiálně využitelným zdrojem dusíku. Při alkalické hydrolýze za mírných podmínek dochází k rozkladu nerozpustné bílkoviny keratinu zejména na rozpustné peptidy, které jsou přímo mikrobiálně využitelné.
Provedení poloprovozní zkoušky: Před začátkem poloprovozní zkoušky byla sláma namleta na velikost částic cca 1-5 mm. Složení pšeničné slámy, použité při hydrolýze, udává Tabulka I. Tabulka I Chemické složení sušiny pšeničné slámy Podíl (%) Sušina 93,04 ± 0,9 Popel 5,8 ± 0,2 Lignin rozp. 6,9 ± 0,19 Lignin nerozp. 20,83 ± 0,5 Celulóza 40,35 ± 1,31 Hemicelulóza 21,17 ± 2,1 Rozbor pšeničné slámy byl prováděn podle postupu, zpracovaného NREL laboratoří v USA (https://www.nrel.gov/docs/gen/fy13/42618.pdf). Principem metody je několikastupňová totální kyselá, tlaková hydrolýza biomasy, při které se postupně stanovují jednotlivé frakce materiálu buď vážkově nebo pomocí HPLC stanovení. Podrobný postup analýzy slámy je uveden v příloze I. Suché, nečistěné kuřecí peří bylo před pokusem také namleto. Sláma a peří v poměru, uvedeném v Tabulce II, byly nasypány do rektoru, viz Obr. 1 a 3. Poté byla do reaktoru napuštěna voda a přidáno předepsané množství hydroxidu draselného tak, aby vznikl roztok o koncentraci 0,6% -viz Obr.4. Na řídící jednotce reaktoru (Obr.2) byla nastavena požadovaná teplota a frekvence míchání, viz Tabulka II. Alkalická hydrolýza probíhala za neustálého míchání a udržování teploty po dobu 22h. TABULKA II PODMÍNKY ALKALICKÉ PŘEDHYDROLÝZY Alkalická předhydrolýza Látka Pšeničná sláma Mleté kuřecí peří Hydroxid draselný Voda Množství 2250 g 300 g 180 g 30 l Provozní parametry Hodnota Teplota 80 C Míchání 50 Hz Vzorkování 600 ml Celková doba předúpravy 22 hodin
Po skončení alkalické hydrolýzy byl odebrán vzorek (obr. 5a), směs byla ochlazena na teplotu 60 C a byla provedena neutralizace na ph 5,5 přídavkem 20% kyseliny fosforečné (viz tabulka III). Poté byly ke směsi (viz Obr.5b) přidány celulolytické enzymy, konkrétně enzymový komplex Cellic CTec2 (Novozyme). Enzymová hydrolýza probíhala 24 hodin za podmínek, uvedených v Tabulce III a z výsledného díla (Obr. 6) byl odebrán vzorek na HPLC stanovení sacharidů. Celá zkouška byla poté opakována. TABULKA III PODMÍNKY ENZYMATICKÉ HYDROLÝZY Enzymatická hydrolýza Látka Kyselina fosforečná 20 % obj. pro úpravu ph Enzym Cellic CTec 2 (Novozyme) Množství 500 ml 450 ml Provozní parametr Hodnota Teplota 60 C Míchání 50 Hz Celkový objem ~30 l Celková doba enzym. hydrolýzy 24 hodin
Obr. 1 Zařízení (reaktor) pro hydrolýzu směsného odpadního materiálu; zařízení bylo vyvinuto firmou Briklis s.r.o. a umístěno v areálu firmy Rabbit Trhový Štěpánov a.s.
Obr. 2 Řídící jednotka zařízení pro hydrolýzu
Obr. 3 Pohled shora do reaktoru na suchou směs odpadů; ve spodní části mletá sláma, v horní části mleté kuřecí peří
Obr.4 Směs slámy a peří po přídavku vody a hydroxidu a po zamíchání (stav před alkalickou hydrolýzou)
Obr.5a Odběr vzorku po alkalické hydrolýze směsi slámy a peří
Obr.5 b Pohled do reaktoru na směs slámy a peří po alkalické hydrolýze, stav před enzymovou hydrolýzou
Obr.6 Pohled do reaktoru po skončení enzymové hydrolýzy
Výsledky Kapalný podíl vzorků, odebraných před enzymovou hydrolýzou a po ní byl analyzován na obsah přítomných monosacharidů pomocí HPLC. Podmínky HPLC analýzy jsou uvedeny v Příloze I. Obr.7 ukazuje chromatogram vzorku před enzymovou hydrolýzou (modrá linie), kde je vidět, že koncentrace kvantifikovatelných sacharidů, zejména glukosy a xylosy, je přede enzymovou hydrolýzou pod detekčním limitem. Zároveň je z tohoto obrázku vidět, dramatické zvýšení koncentrace monosacharidů po enzymové hydrolýze (červená linie). Kromě xylosy jsou součástí hemicelulosy i další minoritní složky, arabinosa, manosa a další. Při HPLC analýze, prováděné za uvedených podmínek nedochází k dokonalému rozdělení všech přítomných monosacharidů, zejména xylosy a arabinosy, a proto je jejich obsah vyjadřován společně jako xylosa, jež tvoří majoritní podíl pentos. Ostatní sacharidy jsou přítomné v hydrolyzátu v zanedbatelných množstvích. Koncentrace glukosy, xylosy a celkových monosacharidů v hydrolyzátu je uvedena v Tabulce IV. Zde jsou zároveň uvedeny výtěžnosti celkového postupu, počítané na vložené množství slámy. Případný nízký obsah sacharidů v kuřecím peří je zanedbáván. Celková dosažená výtěžnost hydrolýzy byla 65 a 68%. Z hlediska změn, kterým podléhá při provedení společné alkalické a enzymové hydrolýzy, kuřecí peří je třeba konstatovat, že na tento materiál působí pouze hydroxid při alkalické hydrolýze a nikoliv celulolytické enzymy a to tak, že dochází k převedení nerozpustného keratinu na rozpustné polypeptidy. Celková koncentrace rozpustných peptidů v hydrolyzátu je cca 6,5 g/l v hydrolyzátu, což představuje asi 76% původního keratinu v peří. Z předchozích laboratorních zkoušek je zřejmé, že společná hydrolýza slámy a peří probíhá hůře z hlediska výtěžnosti sacharidů než hydrolýza samotné slámy. Důvodem může být například skutečnost, že část enzymů se nevratně váže na pevný, nehydrolyzovaný podíl kuřecího peří. Avšak výhody společné hydrolýzy obou materiálů nižší spotřeba energií, chemikálií a vody, menší množství odpadu, úspora času ospravedlňují její společné provedení i za cenu dosažení nižší účinnosti.
Obr.7. Ukázka chromatogramu kapalného podílu materiálu po alkalické hydrolýze (tj. před přidáním enzymu) modrá linie a po enzymové hydrolýze (červená linie)
Tabulka IV Výsledky po alkalické a enzymové hydrolýze směsi slámy a peří Hydrolýza č. Glukosa (g/l) Xylosa (g/l) Celkové monosacharidy (g/l) Výtěžnost hydrolýzy celulosy (%) Výtěžnost hydrolýzy hemicelulosy (%) 1 18,3 10,3 28,6 65 70 67 2 19,6 10,8 30,4 70 73 71 Výtěžnost celkové hydrolýzy (%) Závěr Provedením poloprovozní zkoušky se jednoznačně prokázalo, že patentovaná technologie hydrolýzy směsi rostlinného a živočišného materiálu je dobře převoditelná z laboratorního do poloprovozního měřítka. Je pravděpodobné, že po další optimalizaci pro konkrétní provozní zařízení by bylo možné dosáhnout lepších výsledků, zejména vyšší výtěžnosti hydrolýzy. Rezervy jsou patrně zejména v účinnosti míchání a v nízké účinnosti, případně nedostatečném množství přidaného komplexu celulolytického enzymu. Avšak vysoká cena a nízká účinnost celulolytických enzymů obecně jsou hlavním faktory, prodražujícími celou technologii, a proto bylo v tomto případě zvoleno kompromisní řešení přídavek z finančního hlediska ještě únosného množství enzymového komplexu. Pokud bychom se však chtěli zaměřit čistě na účinnost hydrolýzy lignocelulosového komplexu, bez ohledu na další faktory, vyšší koncentrace enzymu by jistě vedla ke zvýšení účinnosti. Výsledný hydrolyzát, jak bylo opakovaně prokázáno při laboratorních testech, je možné využít pro mikrobiální produkci butanolu, etanolu nebo kyseliny mléčné.
Příloha I Metodika rozboru pšeničné slámy 1. Stanovení sušiny a popela Do vysušené a předem zvážené porcelánové misky bylo naváženo 0,5 g pšeničné slámy s přesností na čtyři desetinná místa. Miska byla poté vložena do sušárny a při teplotě 105 C po dobu cca 20 hodin. Do předem vysušené a zvážené porcelánové misky bylo naváženo 0,5 g vzorku biomasy. Vzorek byl následně umístěn do sušárny a při teplotě 105 C byl po dobu cca 15 hodin vysušen do konstantní hmotnosti. Po zchladnutí v exsikátoru byla miska se vzorkem zvážena a byl stanoven obsah sušiny. Stanovování sušiny probíhalo ve třech paralelách, kdy byl vypočten průměr těchto hodnot a jejich směrodatná odchylka. Stanovení popela Miska s vysušenou biomasou byla umístěna do pece a při teplotě 550 C se nechala po dobu přibližně 4 hodin spálit na popel. Po vychladnutí v exsikátoru byla miska s popelem zvážena a byl stanoven procentuální obsah popela. Stanovení popela opět probíhalo ve třech paralelách. 2. Frakcionace vzorku Do tlakových zkumavek s teflonovým uzávěrem bylo naváženo 0,3 g pšeničné slámy, a poté byly přidány 3 ml 72% H2SO4. Zkumavky byly řádně promíchány a poté temperovány po dobu 60 minut ve vodní lázni při teplotě 30 C. Následovalo zředění kyseliny na 4 % přidáním 84ml demineralizované H2O a směs byla opět důkladně promíchána. Poté byla provedena hydrolýza v autoklávu při teplotě 121 C po dobu 60 minut. Po hydrolýze byl roztok přefiltrován přes předem zvážený filtrační papír. Kapalná fáze byla jímána do předem zvážených baněk a pevná fáze byla promyta 30 ml demineralizované H2O. Pevná fáze byla vysušena při teplotě 105 C po dobu cca 15 hodin, kdy vzorek v misce tak odpovídal obsahu nerozpustného ligninu a popela. Poté byla pevná fáze spálena v peci vyhřáté na teplotu 575 C po dobu cca 3 hodin a byl stanoven procentuální obsah popela. Po odečtení hmotnosti popela od hmotnosti vysušeného zbytku po filtraci byl vypočten obsah nerozpustného ligninu. Pro stanovení monosacharidů byly obě kapalné fáze podrobeny analýze pomocí HPLC (podmínky jsou uvedeny v Tab. I). Lignin rozpustný v kyselině byl stanoven spektrofotometricky při vlnové délce 197 nm (filtrát byl ředěn 20x a roztok po promytí pevné fáze 10x). TAB. 1 PODMÍNKY ANALÝZY HPLC Chromatograf Agilent 1200 Series Kolona Watrex 250 8 mm polymer IEX H+ Průtok 0,5 ml.min -1 Mobilní fáze 5 mm H2SO4 v demih2o Teplota kolony 60 C Detektor Refraktometrický Objem nástřiku 20 μl Analýza byla provedena dle A. Sluiter, B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and D. Crocker (2012) Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass, Laboratory Analytical Procedure (LAP), Denver West Parkway Golden, Colorado. https://www.nrel.gov/docs/gen/fy13/42618.pdf