LABORATOŘ OBORU (N352014) MIKROBIOLOGIE ÚLOHA Č. 12 HODNOCENÍ BAKTERIÁLNÍCH, KVASINKOVÝCH A PLÍSŇOVÝCH KULTUR POUŽÍVANÝCH PŘI VÝROBĚ POTRAVIN Vedoucí práce: Ing. Šárka Horáčková, CSc. (sarka.horackova@vscht.cz) Zadání: 1. Vyhodnoťte dle pokynů vyučujících výsledky mikrobiologického rozboru potraviny z úlohy č. 11 a vyberte kolonie pro následné mikroskopování: a. výpočet počtu mikroorganismů jednotlivých stanovovaných skupin b. gramovo barvení G - bakterie, mikroskopie c. mikroskopický preparát sporulující bakterie d. katalasový test u min. 2 vybraných kolonií 2. U předložených dvou bakteriálních kultur (jogurtová, smetanová) proveďte: a. dle přiloženého návodu základní senzorické hodnocení obou kultur s důrazem na popis typických znaků, příp. zaznamenejte slovně přítomnost netypické chuti a vůně b. mikroskopickou kontrolu kultur (imerzní objektiv 100x) fixovaný preparát o barvení methylenovou modří o Gramovo barvení popis mikroskopického preprátu (tvar buněk, tvorba diplokoků, řetízků, ), u jogurtové kultury vypočítejte z několika zorných polí průměrný poměr mezi koky a tyčinkami c. stanovte aktivní kyselost obou kultur d. stanovte titrační kyselost obou kultur a vyjádřete ji v jednotkách SH e. vyhodnoťte, zda získané údaje odpovídají typickým znakům jogurtové či smetanové kultury 3. U předložené kvasinkové kultury proveďte: a. makroskopické pozorování s popisem morfologických znaků kolonií rostoucích na agaru (tvar, velikost kolonie, okraje, lesklý-matný povrch, ) b. mikroskopickou kontrolu vybraných kolonií u fixovaného i nativního preparátu přenos do kapky vody, fixovaný preparát, barvení methylenovou modří nativní preparát v kapce vody pod krycím sklíčkem popis mikroskopického preparátu (nákres pučení, pučení na široké základně, dělení, buňky samostatně, ve dvojicích, tvar buněk apod.) 1
4. U předložené plísňové kultury proveďte: a. makroskopické pozorování s popisem morfologických znaků kolonií rostoucích na agaru (velikost, barva, sporulace) b. mikroskopiské pozorování přímo z misky (objektiv 10x, příp. 40x) c. mikroskopické pozorování nativního preparátu v laktofenolu, zakreslete typ mycelia a tvar konidioforů d. stanovení proteolytické aktivity na agaru s přídavkem odtučněného mléka 5. Mikroskopické pozorování dle časových možností: o mikroskopické pozorovnání buněk L. acidophilus, Bifidobacterium sp. o mikroskopické pozorování rodu Aspergillus sp., porovnání mycelia a konidioforů s rodem Penicillium sp. Základní charakteristika smetanové zákysové kultury Mezofilní smetanová zákysová kultura se v mlékárenském průmyslu používá jako základní kultura. Tato kultura obsahuje homofermentativní laktokoky a aromatvorné leukonostoky: - Lactococcus lactis subsp. lactis - Lactococcus lactis subsp. cremoris - Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis - Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris - Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum. Aromatvorné koky využívají citrát za vzniku oxidu uhličitého a různých aromatických sloučenin (např. acetaldehyd, diacetyl, acetoin, 2, 3 - butandiol). Kultivační podmínky: teplota 20-30 C, doba 16-18 h, inokulum 1% (obj.). Titrační kyselost: 36-42 [2,5 mmol H +.l -1 ], aktivní kyselost: 4,2-4,7. Základní charakteristika jogurtové zákysové kultury Tato kultura obsahuje dvě termofilní bakterie Streptococcus thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus žijící v symbióze (protosymbiotická směs). Streptococcus thermophilus produkuje kyselinu mravenčí, čímž se sníží oxidačně-redukční potenciál, ke kterému je Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus citlivý. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus díky zvýšené proteolytické aktivitě tvoří esenciální aminokyseliny (např. valin, leucin, histidin, methionin, tryptofan, isoleucin a kyselinu glutamovou). Kultivační podmínky: teplota 42 až 45 C, doba 3,5 4,0 h, inokulum 1 2 % (obj.). Titrační kyselost: 40-50 [2,5 mmol H +.l -1 ], aktivní kyselost: 4,0-4,5. 2
Senzorické hodnocení (provádí se po vychlazení na 10 C) Základní - smetanová kultura (zakysaná mléka, smetany, sýry, tvarohy, ) - jemná, hladká a hustá konzistence - po protřepání se má na stěnách nádoby tvořit celistvý homogenní film, který je stálý po dobu 1 min (ulpívá na stěnách) - chuť a vůně čistě mléčná, nepatrně štiplavá (CO 2 ) - výrazně aromatická - dle složení výrazná produkce aromatických sloučenin (diacetyl, acetoin, ) Senzorické vady Textura filmu: - nehomogenní, film neulpívá na stěnách, trhá se po promíchání Vady chuti a vůně: - nevýrazná, bez typického smetanového aroma - málo kyselá/překysaná - cizí příchutě (jogurtová, zatuchlá, ) Jogurtová kultura - hladký viskózní gel charakteristický ostřejší kyselou chutí a vůní zeleného jablka (někdy také uváděno jako vůně čerstvě posečené trávy), specificky jogurtová chuť, čistá, výrazně aromatická - povrch má být suchý, bez syrovátky, ale malé množství není na závadu - film po zamíchání jen slabě ulpívá na stěně kultivační baňky, rozděluje se na praménky Senzorické vady Textura filmu: - řídký, silně se ihned trhá, neulpí vůbec na stěně Vady chuti a vůně: - slabě aromatická, bez aromatu - slabě kyselá nebo nedokysaná, slabě/silně překysaná - cizí příchutě (smetanová, zatuchlá, kvasinková, )... Gramovo barvení fixace preparátu plamenem kapka krystalové violeti, nechat působit 20 s bez opláchnutí přidat kapku Lugolova roztoku, který slijte i s původním barvivem (violetí) a hned poté znovu nakapat dostatečné množství Lugolova roztoku, nechat působit 20 30 s preparát odbarvit aceton-ethanolovou směsí (pipetou, odbarvovací směs lijte opatrně na zešikmené sklíčko nad nátěr, přes preparát nechejte volně stékat a opakujte, dokud je zřejmé, že se barvivo vymývá opláchnutí vodou (střičkou nebo pipetou) dobarvení zředěným karbolfuchsinem (event. safraninem) 30 60 s nakonec preparát znovu opláchnout, nechat oschnout 3
Barvení methylenovou modří fixace preparátu plamenem kapka methylenové modři, nechat působit 2 3 min přebytečné barvivo opláchnout vodou preparát šetrně osušit Stanovení titrační kyselosti jogurtu (dle ČSN 570530) Do titrační baňky se odváží 25 g vzorku s přesností na 0,01g, přidá se 25 ml vody, 1 ml fenolftaleinového roztoku (2% etanolový roztok), zamíchá se a titruje 0,25 mol.l -1 NaOH za stálého míchání do slabě růžového zabarvení, které má srovnávací roztok 50 ml mléka + 1 ml 5 % CoSO 4. Zabarvení musí vydržet 30 s. Titrační kyselost se vyjádří ve SH. V případě nižší tuhosti smetanové kultury (také při stanovení kyselosti fermentovaných mlék, syrovátky a podmáslí) se titrace provádí s 50 ml vzorku, ale vzorek se neodměřuje pipetou, použije se 100ml odměrný válec se zabroušenou zátkou, ve kterém se titrace také provádí. Při nízké viskozitě jogurtové a smetanové kultury použijte navážku 25 g vzorku. Titrační kyselost (TK) může být vyjádřena několika způsoby: a) jako SH (dle Soxhlet-Henkela), což představuje počet mililitrů odměrného roztoku NaOH (o koncentraci přesně c = 0,25 mol.l -1 ) potřebných pro titraci 100 ml nebo 100 g vzorku v případě jogurtu: TK = 4.a.f a spotřeba roztoku NaOH k titraci f faktor titrace 1 SH = 1 ml přesně 0,25 mol.l -1 NaOH b) jako látkový obsah kyselin v [mmol.l -1 ]: používané při stanovení kyselosti mléka ( titrace 50 ml mléka bez přídavku vody + 2 ml fenolftaleinu, jinak postup stejný jako u jogurtu) TK = (a. c. 1000)/ m m = množství vzorku, použité k titraci, ml a = spotřeba roztoku NaOH při titraci vzorku, c = koncentrace roztoku NaOH, mol.l -1 c) jako gramy kyseliny mléčné : 1 SH = 0,0225 g kyseliny mléčné ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4
Charakteristika kvasinkové kultury Kluyveromyces marxianus var. lactis Morfologie buněk Kvasinky jsou oválné nebo kulaté, v průměru 3,0-3,5 μm, vyskytující se často jednotlivě nebo v párech. Viditelné vakuoly jsou přítomny v buňkách při delší kultivaci (viz Obr. 1). Vzhled kolonií Na sladovém agaru jsou kolonie kvasinek homogenní, lesklé, smetanově bílé, bez barevných vad. V tekutinách vytvořit sediment a prstenec, na povrchu obvykle tenkou kožku. Očkování a kultivace Kvasinky se očkují na povrch šikmého agaru GKCH s použitím očkovací kličky a jsou kultivovány při pokojové teplotě, po dobu 2-4 (3) dnů, aerobně. Po kultivaci se pozorují makroskopické morfologické vlastnosti kvasinek (např. vzhled a barva kolonií na agaru) a rychlost růstu kvasinek. Mikroskopické preparáty jsou barveny methylenovou modři. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Charakteristika plísňové kultury Penicillium roqueforti Morfologie buněk Plísně tvoří konidiofory o délce asi 100-150 μm, o průměru 4-6 μm. Konidiofory jsou rozvětvené a asymetrické. Metuly mají velikost 12-15 x 3,0-4,5 μm. Fialidy mají velikost 8-12 x 3,0-3,5 μm. Konidie jsou kulaté, hladkého povrchu, tmavě zelené, nebo podlouhlé o velikosti 3,5 až 5,0 μm (viz Obr. 1). Vzhled kolonií Kolonie na Czapek - Doxově agaru mají sametový vzhled, jejich povrch je hladký, jsou modro-zelené nebo hráškově zelené barvy, s jasně bílými, nerovnými, paprskovitými okraji. Většina kmenů nevykazuje gutaci (tzn. že vylučuje přebytečnou vodu ve formě průhledných kapek). Starší kolonie tvoří na spodní části tmavý pigment (viz Obr. 3a). Obr. 1. Mikroskopie morfologie plísně Penicillium roqueforti; detail rozvětveného konidioforu. 5
Charakteristika plísňové kultury Penicillium camemberti Morfologie buněk Plíseň tvoří konidiofory o různých délkách. U konidioforů vyrostlých ze substrátu, jsou jejich velikosti 250-600 x 2,5-3,5 μm. U konidioforů vyrostlých ze vzdušných hyf je jejich délka 40 až 200 µm. Větve dosahují velikostí 12-18 x 2,2-3,4 µm. Metuly jsou seskupeny po 2-3 ve skupině a jejich velikosti jsou 9-14 x 2,2-3,2 µm. Fialidy jsou seskupeny po 2-5 ve skupině a jejich velikosti jsou 9-14 x 2,2-2,8 um. Konidie jsou eliptické, později kulovitého tvaru a jejich velikosti jsou 3,5-5,0 x 3,0-4,5 um. Vzhled kolonií Kolonie plísně jsou na Czapkově-Doxově agaru řídké, vločkovité, připomínající vatu. Jsou bílé (viz Obr. 2b), později šedozelené, voní po houbách. Obr. 2. Kolonie Penicillium sp. na Czapkově-Doxově agaru: a) Penicillium roqueforti, b) Penicillium camemberti. Kolonie se očkují na povrch agaru GKCH (zkumavka s šikmým agarem) za pomoci očkovací kličky a na povrch agaru GKCH (vpíchnutím do středu Petriho misky) za pomoci očkovací jehly. Kultivace plísní probíhá při pokojové teplotě po dobu 5-7 dnů za denního světla, které podporuje sporulaci a vznik kolonií typického zbarvení. Po kultivaci jsou na agaru pozorovány morfologické vlastnosti kolonii (např. vzhled a barva kolonií na agaru) a jejich velikost. Mikroskopické preparáty plísní se připravují s laktofenolem. Charakteristika plísňové kultury Penicillium nalgiovense Plíseň tvoří bílé nebo béžové kolonie, které mohou být později lehce nazelenalé. Konidie jsou kulovité, bezbarvé. Plíseň je schopna růstu při 5 C, neroste již při 37 C, toleruje 6 8 % NaCl. Mikroskopie plísní laktofenolový preparát (laktofenol zabraňuje svraštění a bobtnání buněk) do kapky laktofenolu na podložním sklíčku přenést vyžíhanou preparační jehlou část mycelia přiklopit krycím sklíčkem tak, aby se vypudily vzduchové bubliny 6
Stanovení proteolytické aktivity plísňové kultury U testované plísně se za pomoci plotnové agarové metody (Petriho miska s agarem PCA s odtučněným mlékem) provede stanovení proteolytických zón. Na misku se sterilně naočkuje kousek mycelia plísně, očkování bodově vpichem. Podmínky kultivace plísně: 25 C, 5 (7) dnů, aerobně, za přítomnosti denního světla. Kvalitativní pozorování jasných proteolytických zón kolem kolonie plísně s potvrzením přítomnosti proteolytických enzymů. Změřte velikost proteolytické zóny kolem jednotlivé kolonie. Zároveň po týdenní kultivaci proměřte velikost kolonie plísně stanovení rychlosti růstu. 7