1 Úvod do molekulární biologie Slavomír Rakouský JU ZSF Tyto texty jsou určeny pouze pro studijní účely (přednášek kurzu Úvod do molekulární biologie) studentů 1. ročníku JU ZSF. Jejich další šíření, publikování atd. by bylo v rozporu s autorskými právy nakladatelů a autorů publikací, z nichž bylo čerpáno.
2 Biopolymery Živé soustavy obsahují až tisíce různých sloučenin, které jsou nezbytné pro jejich život Mimořádný význam - látky typu polymerů (polykondenzátů) bílkoviny nukleové kyseliny polysacharidy souhrnný název: Biopolymery Důvody: pro organizaci složitých soustav výhodný stavebnicový princip postačuje malý počet monomerů - asi 20 různých aminokyselin - 5 různých nukleotidů - několik desítek monosacharidů Živé systémy z nich mohou vytvořit ohromný počet různých polymerních molekul (odhad 10 100 až 10 1000 ) Tyto polymery mohou být použity jako stavební kameny pro stavebnice vyššího řádu, ze kterého jsou stavěny buňky. Biopolymery byly zdokonalovány v průběhu evoluce Bez biopolymerů by neexistovala forma organizovanosti hmoty ( živá hmota )
3 Znalosti struktury a funkce biopolymerů - nezbytným předpokladem pochopení životních procesů a funkcí na úrovni molekulární, buněčné i vyšších Chování biopolymerů je základem molekulárně biologických procesů Bílkoviny - představují cca. ½ suché hmotnosti buňky - molekuly bílkovin se podílí na všech základních životních procesech - součástmi buněčných struktur (stavební f-ce) Funkce bílkovin: strukturní (součástmi buněčných struktur) metabolická (realizují b. metabolizmus) informační (jako signály či receptory signálů) vedle toho základní komponentou všech tří hlavních principů funkční organizace buňky (paměťového, membránového, cytoskeletárního)
a) Primární struktura bílkovinné molekuly Stavební jednotkou (monomerem) bílkoviny (proteinu): - aminokyseliny (AK, AA) zastoupení jednotlivých druhů AK v molekule a jejich sled ozn. jako primární strukturu bílkovin Příklad: -158-Cys-Glu-Val-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ala-169- (CEVFVMPRA) 4 AMINOKYSELINY - odvozeny od organických kyselin, na α-uhlík je navázána aminová skupina (NH 2 ) α-uhlík (2. uhlík) AK skládající bílkoviny převážně - α- aminokyseliny a vždy z L- řady (jen ve stěnových peptidech někt. bakterií nalezeny i D-aminokyseliny)
5 STRUKTURA PEPTIDOVÉHO ŘETĚZCE AK v molekule bílkovin navzájem pospojovány peptidovou vazbou (spojuje se aminoskupina 2. uhlíku jedné AK s karboxylovou skupinou sousední AK a odštěpuje se molekula vody tj. polykondenzace) Pospojováním více AK (řetězením) vzniká peptidový řetězec
6 AMINOKYSELINOVÉ SLOŽENÍ BÍLKOVIN Zastoupení různých AK v molekule bílkoviny lze snadno zjistit po hydrolýze bílkoviny určením jejich počtu (obvykle %). Složení je charakteristické pro každý druh bílkoviny. O vlastnostech bílkoviny rozhoduje charakter postranních řetězců AK (z fyzikálně-chemického hlediska: kyselé, bazické, polární a nepolární). kyselé bílkoviny s hojným zastoupením dikarboxylových kyselin, např. Asp. Glu (-COOH skupina na postranních řetězcích) zásadité (bazické) bílkoviny - s četnými diaminokyselinami, např. Arg, Lys, His (-NH 2 skupina na postranních řetězcích)
7 Některé AK zakončené na postranních řetězcích hydrofobními skupinami, např. -CH3, jsou-li v převaze, určují hydrofobní charakter bílkovinné molekuly X Přítomnost AK s hydrofilními skupinami, např. COOH, -OH určují při převaze hydrofilní (polární) bílkovinné molekuly Souhrn (ke složení): zastoupení různých AK určuje fyzikální vlastnosti bílkovinné molekuly, které jsou jedním z důležitých faktorů pro funkci bílkoviny v buňce.
8 SEKVENCE AMINOKYSELIN Vlastnosti určité bílkoviny nejsou určeny pouze AK složením, ale i jejich pořadím, sekvencí) v peptidovém řetězci. Tj. táž množina AK může být teoreticky lineárně seřazena ve všech kombinacích (sekvencích). Např. peptid složený ze tří AK (Val, Ala, Cys) může mít až šest různých sekvencí: Val Ala Cys Val Cys Ala Ala Val Cys Ala Cys Val Cys Val Ala Cys Ala Val (při zastoupení 20ti různých AK by polypeptid měl přes 10 15 možných sekvencí. Běžná velikost polypeptidu 300 AK, také stejné AK zastoupeny vícekrát více než 19 380 různých sekvencí) Určování skutečných sekvencí AK v bílkovinách, tzv. sekvenování bylo dříve velmi obtížné (F. Sanger, 1953 struktura molekuly inzulínu). Dnes se primární struktura bílkovin odvozuje nepřímo podle sekvence nukleotidů DNA, které je kódují (sekvenování DNA je metodicky jednodušší). Známa úplná AK sekvence několik tisíc bílkovin databáze Souhrn (k prim. struktuře): Primární struktura bílkoviny určuje vlastnosti celé molekuly, tedy i její biologickou funkci. Primární struktura proto musí být velmi přesně určena (informace pro ni je v genetické paměti buňky).
9 Ze srovnání sekvencí bílkovin je možno vyvozovat závěry i o evoluční příbuznosti různých bílkovin b) Sekundární a terciární struktura bílkovinné molekuly krátké polypetidové řetězce (několik desítek AK) peptidy nebo oligopeptidy (podle počtu AK: tri-, okto-, dekapeptidy..) Oligopeptidy mají důležité biologické funkce, zejména regulační (např. některé hormony) nebo součástí složitějších makromolekul (např. mureinu peptidoglykan, jež je součástí b. stěny bakterií Bílkoviny (proteiny) sem řazeny látky s polypeptidovým řetězcem až z většího počtu AK (několika set). M.h. 10 4-5.10 4 (10-50 kilodaltonů - kd) (pro srovnání: průměrná m.h. 1 zbytku AK je asi 110 Daltonů ) polypeptidový řetězec je značně dlouhý až 3 µm Bílkoviny s ±nataženým polypeptidovým řetězcem, vytváří jakési vlákno - Fibrilární bílkoviny Většina buněčných bílkovin však vytváří molekuly, jejíchž tvar se blíží sférickým útvarům - Globulární bílkoviny Mnoho vazeb v dlouhém polypeptidovém řetězci umožňuje volnou rotaci atomů velká flexibilita tvaru. Tvar, který řetězec v prostoru zaujímá konformace proteinu
Konformace proteinu - není náhodná, je určována silami, které působí uvnitř molekul! Určována zejména rozložením AK s polárními a nepolárními postranními řetězci. Další působící silou vodíkové (H) můstky mezi peptidovými vazbami v řetězci, mezi nimi a postranními řetězci a mezi postranními řetězci navzájem. U některých proteinů se uplatňují i tzv. disulfidické můstky mezi SH skupinami cysteinů. Výsledkem působení všech těchto sil je to, že daný polypeptidový řetězec zaujme vždy stejnou třírozměrnou strukturu v prostoru (konformaci). Na druhé straně rozložení interakcí vyplývá ze sekvence AK, tj. primární struktura bílkovin určuje i konformaci molekuly. 10
11 Jestliže tuto konformaci nějakými silami změníme (molekulu denaturujeme), po působení sil se vrátí do původního stavu V konformaci různých proteinů byly nalezeny určité strukturní pravidelnosti, které se označují jako α-helix a β-struktura α-helix řetězec vytváří šroubovicové uspořádání Stabilizováno vodíkovými můstky mezi nad sebou ležícími peptidovými vazbami. U globulárních proteinů zaujímají α- helikální uspořádání některé úseky polypeptidového řetězce. Některé fibrilární proteiny (např. keratin) jen tuto konformaci.
β-struktura (β-skládaný list) probíhají úseky řetězce paralelně vedle sebe. Struktura stabilizována H můstky mezi sousedícími ( přiloženými ) úseky. Pouze některé proteiny mají tuto strukturu (např. fibroin z přírodního hedvábí). X Běžná u globulárních bílkovin (většinou se však kombinuje s úseky s α-helikální strukturou Tato uspořádání polypeptidového řetězce ozn. jako sekundární struktura 12
13 Konečnou strukturu molekuly bílkoviny, tj. prostorové uspořádání celého řetězce, ozn. jako terciární strukturu. Její poznání metodicky obtížné (např. difrakcí X paprsků na krystalech bílkovin) Evolučně příbuzné proteiny (tzv. rodiny proteinů) velkou podobnost v terciární struktuře. Např. serinové proteázy (proteolytické enzymy jako chymotrypsin, trypsin a elastáza) až ze 40 %. Srovnávací biochemie proteinů tak naznačuje jejich evoluční vývoj, a tím i jejich biologickou účelnost. Molekuly mnohých bílkovin s větším počtem AK jakoby rozděleny na dvě i více částí. Tyto struktury ozn. domény (velikost 100-200 AK zbytků). Uspořádání domén naznačuje, ve srovnání s jinými proteiny, evoluční historii různých proteinů. Všechny interakce udržující konfirmační stabilitu energeticky poměrně slabé (nekovalentní) vnějšími faktory (změny ph, teploty) lze ovlivnit terciární strukturu.
14 Nevratná změna - ozn. nevratná denaturace X reverzibilní denaturace (vratná), která je důležitým mechanizmem regulace biologické funkce proteinu. Většina funkcí bílkovin vyplývá přímo z jejich terciární konfirmace. c) Podjednotkové bílkoviny Některé bílkoviny složeny z většího počtu menších molekul (více polypeptidových řetězců podjednotek, protomer) navzájem vázány nekovalentními vazbami. Tyto proteiny ozn. podjednotkové (oligomerní) podle počtu podjednotek dimerní (2), tetramerní (4) Podjednotky buď zcela identické, nebo různé (např. homodimery, heterodimery). Vzájemné prostorové uspořádání podjednotek kvarterní struktura bílkovin
15 Př. Transportní bílkoviny membrán - 2 subj., myoglobin - 4 subj., imunoglobuliny - 4 subj. a jejich násobky, některé dehydrogenázy tvořeny až 16 subjednotkami, kapsidy virů (desítky až stovky identických subjednotek) Síly udržující kvarterní konformaci - vždy nekovalentní vazby polymerní bílkoviny jsou snadno disociovatelné na své podjednotky (možnost znovu reasociovat v příslušnou kvarterní strukturu). Shrnutí: Biologická aktivita polymerních bílkovin je determinována jejich kvarterní konformací. Regulovaná změna kvarterní struktury je tedy cestou k regulaci jejich aktivity. d) Funkce bílkovin v buňce Bílkoviny se podílí na všech základních životních procesech (funkce: strukturní, metabolické, informační). Mnohé bílkoviny bifunkční či polyfunkční Př. Některé proteiny jsou strukturálními komponentami biomembrány a současně mají enzymovou f-ci (membránové ATPázy) nebo f-ci transportní (transportní proteiny). Membránové imunoglobuliny imunocytů jsou stavební součástí membrány a současně plní f-ci signální - rozpoznávají své antigeny. Specifická f-ce bílkoviny vždy dána terciární (či kvarterní) strukturou. Každá interakce bílkoviny s jinou molekulou (procesy morfogenní, enzymové, informační) předpoklad na povrchu
16 molekuly bílkoviny existuje specificky uspořádané vazebné či rekogniční místo, na něž se váže liganda (molekula vážící se na vazebné místo) vazebné místo liganda Specifita rozpoznávacího místa vůči ligandě - zpravidla dána prostorovou konformací několika či několika desítek AK (postranních řetězců). Specifická funkce bílkovin spočívá ve schopnosti rozeznat s jakou molekulou mají reagovat (primární struktura neomezené možnosti rozpoznání) STAVEBNÍ BÍLKOVINY Součástí buněčných struktur (stavebními kameny) - prakticky všech b. struktur (př. komponenty cytoskeletu, bičíky tvořeny výlučně bílkovinami). Jinde spojeny s jinými biopolymery či jinými látkami: (např. v eukaryotických chromozomech a ribosomech agregace s NK, v biomembránach s fosfolipidy, v buněčných stěnách či extracelulární matrix s molekulami polysacharidů
17 Vznik složitějších struktur z jednotlivých strukturních proteinů: pomocí vazebných míst 2 stejné molekuly (každá 1vazebné místo) dimer více molekul (každá 2 vazebná místa) řetězce Nadmolekulární struktura vzniká samovolně! (nepotřebuje informaci a zpravidla ani energii)
18 Tyto morfogenní procesy - autoorganizační (autoagregační) Informace pro specifické uspořádání podjednotek (strukturních monomerů) je obsažena již ve struktuře molekuly (vazebného místa) Jiný příklad autoagregace bakteriálních bičíků (globulární bílkovina flagelin) Totéž i při tvorbě nadmolekulárních komplexů s jinými molekulami (reagregace ribosomů)
19
20 ENZYMOVÉ BÍLKOVINY Jednou z nejdůležitější funkcí proteinů je enzymová katalýza (téměř všechny reakce v buňce jsou enzymové!) Význam enzymové katalýzy: 1. enzymy urychlují průběh chemických reakcí (o několik řádů) 2. umožňují průběh i těch reakcí, které by za daných podmínek vůbec probíhat nemohly (př. v rozmezí biokinetických teplot) 3. specifita katalýzy určuje, které z možných chemických reakcí skutečně probíhat budou 4. reakce lze velmi přesně regulovat zásahem do katalytické aktivity enzymů (zpravidla reverzibilní změnou konformace molekuly enzymu) 5. díky tomu, že všechny enzymy jsou bílkoviny, umožněno řízení enzymového vybavení vnitřní pamětí buňky (genetickou informací) cestou transkripce a translace
21 Enzymová katalýza - spočívá v podstatném snížení aktivační energie přeskupením elektronové struktury u molekuly substrátu. K tomu se musí přechodně spojit enzym (E) se substrátem (S). Po proběhnutí reakce se komplex enzym-substrát (ES) rozpadá na původní enzym a produkt katalyzované reakce: E + S ES E + produkt proběhne velmi rychle (µs ns), tj. jedna molekula enzymu může zpracovat velké množství molekul (př. kataláza rozloží za 1 min až 5. 10 6 molekul H 2 O 2 na vodu a molekulární kyslík)
22 Všechny enzymy jsou globulární bílkoviny. Za katalytickou funkci odpovědná pouze část molekuly aktivní centrum (místo) enzymu. Aktivní centrum (AC) dáno: - buď souvislou sekvencí několika AK na určitém místě polypeptidového řetězce exponovaného na povrchu molekuly - nebo častěji až terciární konfigurací molekuly do vztahů se dostávají zbytky AK, které v polypeptidovém řetězci spolu vůbec nesousedí (RNázy, chymotrypsin) - někdy za katalytickou funkci odpovědna nebílkovinná složka kovalentně vázaná na bílkovinu (tzv. prostetická skupina) Velké množství enzymů jsou podjednotkové bílkoviny (tj. jejich molekula je tvořena několika polypeptidovými řetězci (tzv. oligomerní enzymy). Jejich enzymová aktivita podmíněna určitým prostorovým seřazením podjednotek (kvarterní strukturou) podjednotky jsou méně aktivní či jinou aktivitu než oligomerní enzym.
23 Enzymy mají dvojí specifitu: funkční a substrátovou Funkční specifita (FS) vyjadřuje chemickou reakci, kterou enzym katalyzuje (hydrolýzu, fosforylaci, oxidaci, dehydrogenaci atd.) FS jedním z hledisek, podle kterého nazývány (hydrolázy, fosforylázy..) Substrátová specifita (SbS) vyjadřuje chemické sloučeniny, na kterých je určitá chemická reakce katalyzována SbS je u některých enzymů vysoce vyhraněna (např. různé proteázy rozeznávají určité sekvence AK, mezi kterými přerušují peptidovou vazbu, obdobně některé nukleázy štěpí polynukleotidový řetězec pouze v určitých sekvencích bazí) Jiné enzymy jsou substrátově méně specifické (např. některé nukleázy štěpí polynukleotidový řetězec kdekoliv, jak u RNA, tak u DNA.
24 Enzymy, které u polymerů postupně odštěpují monomery od konců molekuly exoenzymy (exoglukanázy, exonukleázy, exopeptidázy) Enzymy, které štěpí polymer uvnitř endoenzymy (endoglukanázy, endonukleázy, endopeptidázy)
25 Izoenzymy (obecně izoproteiny) mají stejnou katalytickou a substrátovou specifitu, ale liší se navzájem v kinetice katalyzované reakce (různá optimální teplota, ph, různá afinita k substrátu, jejich aktivita je regulována různými mediátory atd.) Z molekulárního hlediska - stejné aktivní centrum, liší se konformací molekuly v jiném místě (tj. mají odchylky v sekvenci AK) lze je rozdělit separačními technikami (např. elektroforézou). U některých enzymů až několik desítek izoenzymů (izozymů) jejich existence podmíněna genovým polymorfizmem K syntéze/rozkladu určité molekuly obvykle nestačí jedna enzymová reakce. Postupnou přeměnu substrátu v konečný produkt ozn. jako metabolickou dráhu V ní jsou za sebou spojeny různé enzymy, které katalyzují jednotlivé chemické reakce v přesném sledu (produkt první reakce se okamžitě stává substrátem pro druhý enzym, jeho produkt pro třetí enzym atd.).
Z enzymové kinetiky celé této soustavy je velmi výhodné, jestliže všechny enzymy vytváří tzv. enzymový komplex. V něm jsou navzájem spojeny (např. zakotveny v daném sledu na pevnou strukturu nejčastěji biomembrány, např. enzymy dýchacího řetězce v mitochondriích). Některé enzymy mají na povrchu molekuly vedle AC i vazebné místo, kam se může vázat liganda (efektor), která mění enzymovou aktivitu molekuly - nazýváno alosterické centrum (místo) Vazbou efektoru na alosterické centrum se poněkud změní terciární struktura molekuly včetně aktivního centra (tím AC ztratí schopnost vázat substrát či se změní afinita k němu může vést až k inaktivaci enzymu (alosterické inhibici) Alosterickými inhibitory bývají často produkty konečného stupně enzymatických reakcí (drah). Tím se uskutečňuje negativní zpětnovazebná regulace. (Je-li nasyntetizován dostatek produktu, zabrzdí se aktivita prvního enzymu dráhy. Při poklesu koncentrace alosterického inhibitoru se uvolňuje alosterické centrum, AC může vázat substrát a celý řetězec enzymových aktivit se znovu rozeběhne.) 26
Alosterickými aktivátory se uskutečňuje zpětná vazba pozitivní (celá enzymová reakce se stále zrychluje). Některé enzymy mají i více alosterických center specifických pro různé efektory. 27
Pro energetické přenosy v buňce mají mimořádný význam enzymy, které štěpí makroergické fosfátové vazby (kovalentní s vysokým obsahem energie, ) Makroergní fosfátové vazby P Rozštěpením jedné makroergní vazby se uvolní energie kolem 30kJ. Nejčastějšími organickými fosfáty s makroerg. vazbou - nukleozidtrifosfáty. Z nich nejdůležitější je adenozintrifosfát (ATP). ATP nukleotid složený z: adeninu ribózy tří zbytků kyseliny fosforečné 28 adenin- ribóza-p P P Makroergní vazby jsou mezi 1. a 2. a mezi 2. a 3. zbytkem kyseliny fosforečné Analogicky: guanozintrifosfát (GTP) uridintrifosfát (UTP)
Pro energetické přenosy v buňce je nejdůležitější hydrolýza trifosfátů na difosfáty nebo naopak vazba posledního zbytku kyseliny fosforečné 29 ATP + H 2 O ADP + H 3 PO 4 Štěpení ATP na ADP katalyzováno enzymem adenozintrifosfatázou (ATPázou). Bílkovin s ATPázovou aktivitou je v buňce velké množství (ATPázy, obdobně GTPázy). Při syntéze některých biopolymerů (bílkovin a NK) je využíváno makroergní vazby mezi prvním a druhým zbytkem kyseliny fosforečné. ATP + H 2 O AMP + P P ATP se rozštěpí na adenozinmonofosfát (AMP) a anorganický difosfát (pyrofosfát, P P) Významnou roli v regulaci aktivity proteinů (nejenom enzymových) hraje kovalentní připojení fosfátové skupiny na některý z postranních řetězců molekuly fosforylace způsobí výraznou konformační změnu. Defosforylací se obnovuje původní stav.
30 Fosforylaci uskutečňují proteinkinázy, defosforylaci pak proteinfosfatázy. Proteinkinázy (PK) rozsáhlou rodinou enzymových proteinů s katalytickou doménou o 250 AK Jiné sekvence rozeznávají specifické substráty (proteiny jež mají být fosforylovány), další sekvence představují vazebná místa pro regulaci aktivity proteinkináz (různými signály). Při reakci je fosfátová skupina z ATP přenesena na hydroxylovou skupinu serinových, threoninových či tyrozinových postranních řetězců. Označení PK: podle zbytku AK, kterou fosforylují (př. tyrozinkinázy) nebo podle funkce proteinů, které fosforylují (mitogeny aktivující kinázy - MAP kinázy, aktivují proteiny účastnící se aktivace genů mitotického cyklu) nebo podle faktoru, který reguluje jejich aktivitu (cyklin dependentní kinázy Cdk, které jsou regulovány cykliny)
31 Proteinfosfatázy vytváří několik rodin (některé přísně specifické podle proteinu, který defosforylují, u jiných specifita menší) Jiný způsob navázání guanozintrifosfátu (GTP) Dané proteiny ozn. GTP vážící enzymy (GTPázy) aktivace Protein + GTP protein-gtp* inaktivace Shrnutí: Aktivita PK a proteinfosfatáz představuje klíčové nástroje vnitrobuněčné signalizace, jejichž důležitým článkem jsou i GTPázy
32
33 INFORMAČNÍ BÍLKOVINY Bílkoviny se účastní regulace buněčných procesů a mezibuněčných vztahů V těchto informačních procesech mají dvojí roli: 1. jako signály, které přenášejí informaci 2. jako receptory, které mohou signál přijímat (rozpoznat) a případně transformovat v jiný(é) signál(y) Molekula bílkoviny splňuje všechny předpoklady pro signální funkci: Informace může být snadno zakódována do primární struktury (sekvence AK), ta udává finální konformaci uplatňující se jako signál Stavebnicový princip skladby bílkovin umožňuje vznik neomezeného množství různých a velmi specifických signálů Omezená mobilita bílkovin (omezený průchod membránami či vazba na membrány) šíření může být vymezeno na určité kanály Bílkoviny lze snadno štěpit tj. lze snadno zrušit jejich signální funkci
34 Mezi nejdůležitější bílkoviny s vysloveně signální f-cí patří: Bílkovinné hormony Imunoglobuliny Regulátory genové aktivity Bílkoviny nesoucí morfogenní informaci (templáty) Vedle toho izolována (či předpokládána) řada bílkovin, které specificky iniciují (spouští) nebo inhibují (zastavují) celou řadu dalších buněčných procesů jako jsou: Iniciace replikace DNA Regulace translace Fungují jako sekundární signály (při přenosu informace z receptoru na cílovou strukturu) Bílkovinné hormony - např. hormony hypofýzy, příštítných tělísek, pankreatu atd. Lze k nim přiřadit i některé oligonukleotidy s funkcí v hormonálních regulacích Imunoglobuliny (Ig) - vysokomolekulární bílkoviny, specificky rozpoznávající strukturu antigenů. Základem všech typů Ig je tetrametr polypeptidových řetězců, které jsou navzájem vázány disulfidovými můstky
35 Regulátory genové aktivity - proteiny s malou m.h., které se podílejí především na regulaci transkripce. Jejich informační f-ce spočívá ve dvojí specifitě. Rozpoznávají: jednak chemickou strukturu induktorů či korepresorů RNA polymerázy apod. jednak určité sekvence nukleotidů v chromozomální DNA Receptory- struktury buňky se schopností přijímat (číst, rozpoznávat) signály přicházející z okolí buňky. Pro příjem informace nesené chemickými signály slouží většinou molekuly bílkovin. Čtení chemických signálů spočívá opět ve specifitě sterických interakcí mezi signálem (bílkovinné i nebílkovinné povahy) a receptorovou bílkovinou. Většina receptorů, které čtou signály jak z okolí buňky, tak vnitrobuněčné signály vázána na biomembrány.