OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
Základy ADME a toxického hodnocení léčiv v preklinickém vývoji OCH/ADME LS 2012/2013
Metodické přístupy ke studiu toxických účinků vyvíjených látek při vývoji léčiv 10.4.2013
testování účinku na lidský organismus - založeno na nepřímých metodách experimenty: in vivo na pokusných zvířatech in vitro na tkáňových kulturách (živočišných a lidských buněk) testy toxicity - nedílná součást vývoje léků
in vivo výhody možnost studovat celou patofyziologii toxického poškození studium toxicity orgánově specifických sloučenin nevýhody ekonomické etické (zásady 3R Reduction, Refinement, Replacement) legislativní
Laboratorní zvířata - gnotobiologie Konvenční typ zvířat nedefinovaná mikroflóra otevřený chov za dodržení základních hygienických pravidel SPF (Specific patogen free) zvířata jsou prostá specifikovaných patogenních mikroorganismů, zpravidla určených jejich výčtem (salmonela, hepatitida ) tato zvířata jsou chována obvykle v odděleném prostoru za hygienickou bariérou (bariérový chov)
Laboratorní zvířata - gnotobiologie Germ-free (GF) (Axenická) = zárodků prostých zvířata jsou zcela prostá všech mikrobů jsou buď celý život udržována ve sterilním prostředí, nebo mohou být použita k založení kolonie gnotobiotických zvířat (z řeckého gnótos - známý + bios - život). To jsou zvířata uměle osazená určitým počtem vybraných druhů nepatogenních mikroorganismů. všechna tato zvířata jsou chována ve zvláštním zařízení, tzv. izolátoru
Laboratorní zvířata - gnotobiologie Gnotobiotická velmi dobře definovaná střevní mikroflóra první generace - očkování mikroflóry GR zvířatům chov ve sterilním prostředí - izolátory
Schéma izolátoru
Typy kmenů laboratorních zvířat Outbrední populace populace zvířat křížená tak, aby jedinci byly co nejméně příbuzní nejsou geneticky definované, v dané generaci méně než 1% příbuznost výhody: vysoká produktivita, tedy i levnost a snadná dostupnost Inbrední kmeny jsou produktem 20 a více páření bratr x sestra, kdy všichni jedinci jsou odvozeni od jediného páru geneticky téměř identičtí jedinci
Typy kmenů laboratorních zvířat F1 hybrid první generace po zkřížení zástupců dvou inbredních kmenů nejsou homozygotní, jsou heterozygotní ve všech lokusech, ve kterých se rodičovské kmeny liší Knock-out technologie jde o cílené vyřazení jednoho konkrétního genu, což následně umožňuje zkoumat důsledky jeho chybění a tedy jeho funkci využívají se jako model choroby, kterou vyřazení genu způsobilo
Typy kmenů laboratorních zvířat Transgenní kmeny vznikají přenosem a integrací určitého sledovaného genu do genomu zygoty definovaného kmene Mutantní kmeny kmeny jsou nositelem definované mutace Kongenní a koisogenní kmeny dva kmeny jsou koisogenní tehdy, jestliže se mezi sebou liší v jediném lokusu jako následek bodové mutace v definovaném diferenčním lokusu. dva kmeny jsou kongenní tehdy, jestliže se liší v určitém lokusu a přilehlé malé oblasti chromosomu. výsledek spontánní mutace, nebo zpětného křížení
Typy kmenů laboratorních zvířat Rekombinantní inbrední kmeny jsou odvozeny opakovaným sourozeneckým křížením od generace F2 dvou inbredních kmenů
Laboratorní zvířata Laboratorní potkan Laboratorní myš Laboratorní morče Laboratorní králík Laboratorní křeček Prase domácí Kočka Pes (plemeno beagle) Opice (Makakové, Paviáni
in vitro výhody rychlé získání výsledků nižší cena možnost užití lidských buněk etické hledisko vysoká míra homogenity výsledků nevýhody nutný proces validace ověření shody výsledků s in vivo metodami omezený pohled z hlediska toxicity orgánově specifických sloučenin nutné vytipovat vhodný orgán a zvolit buňky (epidermální keratinocyty, hepatocyty, ) nelze získat informace o toxikokinetice, systémových účinků
In vitro - 3R Replacement (náhrada klasických testů) využití databází a počítačových programů, testy in vitro - tkáňové kultury, bílé krvinky, jaterní buňky Reduction (snížení spotřeby laboratorních zvířat) racionální a efektivní využití laboratorních zvířat (screeningové a pilotní studie, vhodný statistický design studie, v některých případech užití inbredních kmenů zvířat) Refinement (zjemnění) provádět testy tak, aby docházelo k co nejmenšímu utrpení zvířat
in vitro pomocí testů in vitro lze nahradit některé in vivo testy (test akutního podráždění oka - buněčná kultura z oka kuřete či králíka, test akutního podráždění kůže - lidská kožní buněčná kultura, imunologické testy) in vitro testy slouží k zjišťování jiného typu dat než in vivo testy (studium interakce toxická látka receptor, studium genotoxicity na buněčné úrovni, )
Rozdělení testů toxicity (TT) různá kritéria dle druhu testovaného organismu dle doby expozice (akutní: 4-24 hodin, subchronická: několik týdnů až 4 měsíce, chronická: půl rok až několik let) dle koncentrace toxické látky dle způsobu podání (orální, inhalační, i.v., ) není jednoduché vymezit hranici mezi skupinami TT
Rozdělení testů toxicity (TT) různá kritéria pro toxické veličiny jiné než mortalita speciální testy: neurotoxický test, reprodukční test, test na teratogenitu, test na mutagenitu, test na karcinogenitu, test vlivu látek na imunitní systém, test vlivu látek na kůži, oči, test chování organismu, )
OECD, FDA, ICH guidlines Organisation for economic co-operation and development: www.oecd.org U.S. Food and Drug Administration http://www.fda.gov/ Harmonisation for better health http://www.ich.org/
akutní, subakutní, subchronické a chronické testy toxicity studium vlivu dané látky na zdraví a mortalitu zvířat vývojové testy toxicity pozorování, zda daná látka vyvolá abnormality ve vyvíjeném plodu a novorozenci reprodukční testy toxicity pozorování vlivu dané látky na plodnost a porodnost test fototoxicity stanovení, zda sluneční záření způsobí zvýšení toxicity dané látky toxikokinetika sledování absorpce, distribuce, biotransformace, exkrece dané látky akutní a chronické oční a kožní dráždivost pozorování, zda daná látka dráždí a leptá kůži nebo oko
OECD guidelines
OECD guidelines
OECD guidelines
OECD guidelines
Akutní testy toxicity velmi často používané provádí se jako první nejčastěji testované organizmy: myš, potkan, králík (relativně nízká cena a krátká generační doba) zkušební skupina zvířat x kontrolní skupina zvířat možnost i druhé kontrolní skupiny chované mimo laboratoř neznámý koncentrační rozsah testované látky aplikace rozdílných dávek více testovaným skupinám pro reprodukovatelnost: stejné podmínky (výživa, teplota, osvětlení, )
Akutní testy toxicity dle způsobu podání: orální, inhalační, dermální (akutní toxicita orální, akutní toxicita inhalační, akutní toxicita dermální) další způsoby podání látky: intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární
Akutní testy toxicity po provedení akutní toxicity: vztažení dat = patologické změny jedinců ke kontrolní skupině a vyhodnocení LD50 (lethal dose) většinou za 24 hodin. další veličina LCT50 (lethal concentration time): při ní jsou zvířata vystavena po dobu 4 hodin různým dávkám toxické látky LCT50 = jde o koncentraci látky způsobující úhyn 50 % jedinců během dvou dnů po expozici nedojde-li po 24 hodinách akutní TT k pozorovaným změnám, odstaví se zvířata a pozoruje se jejich fyziologický stav
Akutní testy toxicity hlavní pozorované znaky: lokomoce, zvláštní reakce, hlasové reakce, citlivost k bolesti, citlivost ke zvuku a doteku, sociální vztahy mezi jedinci, agresivita, tonus svalstva, paralýza, křeče, posturální reflexy, poškození oka, reflex rohovky, chvění a fotofobie.
Akutní orální toxicita: vztahuje se na nepříznivé účinky které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 h. Střední smrtná dávka (LD50): takové množství látky, které způsobí úhyn 50% pokusných zvířat během definovaného období po jednorázové aplikaci
OECD guideline 423 Akutní orální toxicita Acute toxic class preferovaný hlodavec: potkan (randomizace, 8-12 týdnů) aplikace látky žaludeční sondou pokus sestává z 2-4 kroků v prvním kroku je 3 zvířatům (stejné pohlaví, samice) stejného pohlaví podána jedna z dávek 5, 50, 300 nebo 2000 mg/kg podle reakce na první dávku experiment pokračuje stejná dávka zvířatům opačného pohlaví vyšší nebo nižší dávka zvířatům stejného pohlaví experiment končí výsledkem testu není přesné určení LD 50, pouze zařazení látky do třídy toxicity
žaludeční sonda podání látky sondou přímo do žaludku zajišťuje enterální aplikaci celé dávky látka se nemůže vstřebat parenterálně např. na sliznici pod jazykem látka neobchází játra (first pass effect)
Akutní orální toxicita Up and down procedure OECD guideline 425 preferovaný hlodavec: potkan (randomizace, 8-12 týdnů, samice) v prvním kroku je 1 zvířeti podána dávka odpovídající kvalifikovanému odhadu LD 50 pokud v 1 kroku zvíře zemře (vykazuje zřetelné projevy akutní intoxikace) je dalšímu zvířeti podána dávka nižší a naopak (změny dle faktoru 3,2) experiment pokračuje do nalezení hraničních dávek - z nich je proveden přesnější odhad LD 50 výsledkem testu je přesný odhad LD 50
Akutní orální toxicita Fixed dose method OECD guideline 420 Orientační studie každá z fixních dávek 5, 50, 300 a 2000 mg/kg podána jednomu zvířeti v oblasti mezi netoxickou a smrtelnou dávkou možno provést zpřesnění cílem je stanovit iniciální dávku (vyvolávající prokazatelné tox. účinky, ale ne smrt) pro hlavní studii Hlavní studie Pro každou každou vyšetřovanou úroveň dávky 5 zvířat (stejné pohlaví) na základě projevů intoxikace se pokračuje s vyšší nebo nižší dávkou nesleduje se počet úmrtí, ale projevy toxického účinku
Akutní inhalační toxicita OECD guideline 403 preferované zvíře potkan zvíře umístěno v inhalační komoře (jen hlava nebo celé tělo) testovaná látka: plyny, páry, aerosoly Střední smrtná dávka LD50
Akutní dermální dráždivost OECD guideline 404 nejčastěji používán albinotický králík účinek látky na depilovanou pokožku, depilace 24 hodin před aplikací látky pozorované změny reversibilní nebo ireversibilní na 6 cm2 depilované kůže se nanese 0,5 g nebo 0,5 ml testované látky, po 4 h se látka smyje vodou a hodnotí se změny v místě aplikace pozorování se provádí po 1 h; 1; 2; 3 nebo až 14 dnech poškození se hodnotí podle dohodnuté stupnice
Akutní dermální toxicita OECD guideline 402 u testovaných látek, u nichž je předpokládána významná kožní expozice aplikace dermálně počáteční krok k vytvoření dávkovacího schématu v subchronické a jiné studii může poskytnout informace o kožním vstřebávání a způsobu toxického působení látky touto cestou střední (smrtná) dávka LD 50
Akutní dermální toxicita potkan, králík, morče randomizace zvířat do skupin 24 hodin před aplikací je srst depilována (neporanit kůži, což by mohlo změnit její prostupnost) (hřbetní oblast) depilovaný prostor max. 10 % povrchu těla zabránit pozření látky zvířetem (zvíře fixováno) každá skupina obsahuje nejméně 5 zvířat stejného pohlaví (většinou samice) aplikovaná látka: 24 h, pozorování zvířete nejméně: 14 dní
Akutní dráždění oka OECD guideline 405 nejčastěji používán albinotický králík Anestezie, aplikace látky do spojivkového vaku oka zvířete, aplikuje se 0,1 g nebo 0,1 ml látky, druhé oko slouží jako kontrola po 24 h se oko vymyje vodou a pozorují se změny pozorování se provádí po 1, 24, 48 a 72 h poškození se hodnotí podle dohodnuté stupnice k vyhodnocení lze použít optické přístroje - binokulární lupa, štěrbinová lupa, mikroskop
Subakutní a subchronické testy toxicity Doba trvání subchronický TT: 90 dní Subakutní TT: 28 dní Aplikace látky orální, dermální, nebo inhalační cestou (méně častá intravenózní) 3 skupiny zvířat pokusná skupina kontrolní volně držená
Subakutní a subchronické testy toxicity Vyhodnocované znaky: hmotnost, úmrtnost, spotřeba potravy a vody, chování. metabolismus, mechanismus a rychlost vylučování, biochemická vyšetření, reprodukční schopnost hematologické vyšetření (hematokrit, leukocyty, erythrocyty, hemoglobin), chemické složení krve, analza moči (ph, protein, glukóza, bilirubin, ), hmotnost (tělesná, játra, ledviny, srdce, štítná žláza, slezina)
Chronické testy toxicity Provádí se po většinu doby života laboratorních zvířat Kombinované se speciálními testy, kdy je potřeba pro prokázání specifického účinku dostatečně dlouhá doba (teratogenita, karcinogenita, mutagenita)
in vitro leptání kůže: transkutání elektrická rezistence (TER) OECD guideline 430 sleduje se nevratné poškození kůže, které se projeví jako viditelné nekrózy pokožky zasahující do škáry Zadní boční kůže se ze zvířete (potkan) odstraní, zbaví se tuku, použije se kožní disk o průměru 20 mm používá se pozitivní i negativní kontrola (10M HCl a destilovaná voda) tři kožní disky + kontrola na test, nanesení kapalné látky do komory, pevné látky na kožní disk po dobu 24 h, promytí vodou,
in vitro leptání kůže: transkutání Detekce integrity kožního disku Látka neleptá kůži: elektrická rezistence (TER) je-li střední hodnota TER pro zkoušenou látku větší než 5 kohm Je-li střední hodnota TER menší nebo rovna 5 kohm, a kožní disk nevykazuje žádné zjevné poškození, a zabarvení kůže je výrazně nižší než u kožního disku 10M HCl pozitivní kontroly Látka se považuje za žíravou pro kůži: v případě, že střední hodnota TER je menší nebo rovna 5 kohm a kožní disk je viditelně poškoz střední hodnota TER je menší nebo rovna 5 kohm, a kožní disk nevykazuje žádné zjevné poškození, ale zbarvení je větší než/nebo roven zbarvení kůže v 10M HCl pozitivní kontroly
Děkuji za pozornost