UIVERZITA KARLVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLVÉ KATEDRA BILGICKÝCH A LÉKAŘKÝCH VĚD VYHDCEÍ AKTIVITY PTECIÁLĚ ATIFUGÁLÍCH LÁTEK PMCÍ MIKRDILUČÍ BUJÓVÉ METDY. VIII. DIPLMVÁ PRÁCE Vypracovala: Vedoucí diplomové práce: tudijní obor: Lenka Kvítková Doc. RDr. Vladimír Buchta, Cc. Farmacie Hradec Králové 2007
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením Doc. RDr. Vladimíra Buchty, Cc. s použitím uvedené literatury. V Hradci Králové dne 2
Děkuji Doc. RDr. Vladimíru Buchtovi, Cc. za odborné vedení, cenné rady a připomínky. Dále děkuji paní laborantce Idě Dufkové za pomoc při experimentální práci. Poděkovaní patří také Doc. PharmDr. Martinu Doležalovi, Ph.D., RDr. Veronice pletalové, Ph.D. a Mgr. Martě Chlupáčové za pomoc při shromažďování potřebných podkladů. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat i svým rodičům a příteli, kteří mě po celou dobu studia podporovali. 3
BAH 1. EZAM ZKRATEK... 6 2. ÚVD... 7 3. TERETICKÁ ČÁT... 8 3.1 PTAVEÍ A VÝZAM HUB V PŘÍRDĚ... 8 3.2 HUBVÁ BUŇKA, RŮT A RZMŽVÁÍ HUB... 8 3.3 HUBY PATGEÍ PR ČLVĚKA... 9 3.4 MYKTICKÁ EMCĚÍ... 10 3.4.1 MYCETIMY... 10 3.4.2 MYKTXIKÓZY... 10 3.4.3 MYKALERGIE... 11 3.4.4 MYKÓZY... 11 3.5 ATIMYKTIKA... 12 3.5.1 DEZIFICIECIA A ATIEPTIKA... 13 3.5.2 ATIFUGÁLÍ ATIBITIKA A CHEMTERAPEUTIKA... 14 3.6 PPI KMEŮ HUB PUŽITÝCH PŘI TETVÁÍ... 18 3.6.1 KVAIKY... 18 3.6.2 VLÁKITÉ HUBY... 19 3.7 TETVÁÍ ATIFUGÁLÍ AKTIVITY LÁTEK I VITR... 21 3.7.1 DIFÚZÍ AGARVÁ METDA... 21 3.7.2 DILUČÍ METDY... 22 3.7.3 TET TAVEÍ MIIMÁLÍ FUGICIDÍ KCETRACE (MFC)... 23 3.7.4 FAKTRY VLIVŇUJÍCÍ TETVÁÍ ATIMYKTIK... 23 3.8 VZTAH MEZI ÚČIKEM A TRUKTURU LÉČIV... 24 4. EXPERIMETÁLÍ ČÁT... 26 4.1 PŘÍPRAVA PKUU... 26 4.1.1 PŘÍPRAVA MÉDIÍ... 26 4.1.2 PŘÍPRAVA KMEŮ HUB K IKULACI... 27 4.1.3 PŘÍPRAVA RZTKŮ TETVAÝCH LÁTEK... 28 4.2 VLATÍ PRVEDEÍ PKUU... 29 4
4.3 DEČÍTÁÍ A ZPRACVÁÍ VÝLEDKŮ... 30 4.4 ZJIŠŤVÁÍ HDT LG P... 30 4.5 PŘEHLED KUPI TETVAÝCH LÁTEK... 31 5. VÝLEDKY... 32 6. DIKUE... 70 6.1 DERIVÁTY (E)-1-PYRAZI-2-YLETHA-1--THIEMIKARBAZU (TAB. 3 A 4)... 71 6.2 DERIVÁTY (E)-1-PYRAZI-2-YLETHA-1--,-DIMETHYLTHIEMIKARBAZU (TAB. 5)... 71 6.3 PYRAZIVÉ AALGY CHALKŮ (TAB. 6 9)... 72 6.4 ADUKTY PYRAZIVÝCH AALGŮ CHALKŮ THILY (TAB. 10)... 74 6.5 ADUKTY CHALKŮ THILY (TAB. 11)... 74 6.6 CHALKY (TAB. 12)... 74 6.7 DERIVÁTY 5-(1-PYRAZI-2-YLETHYLIDE)-2-THIX-1,3-THIAZLIDI-4-U (TAB. 13 15)... 75 6.8 ARYLAMIDERIVÁTY PYRAZI-2-KARBXAMIDU (TAB. 16)... 75 6.9 DERIVÁTY 3-AMIPYRAZI-2,5-DIKARBITRILU (TAB. 17 A 18)... 76 6.10 AILIDY PYRAZI-2-KARBXYLVÉ KYELIY (TAB. 19 27)... 77 6.11 DERIVÁTY THIAZL-2-YLAMIDU PYRAZI-2-KARBXYLVÉ KYELIY (TAB. 28 A 29)... 78 6.12 DERIVÁTY 2-FEYLULFAYLPYRAZIU (TAB. 30)... 79 6.13 DERIVÁTY CHILIU (TAB. 31 A 32)... 79 6.14 DERIVÁTY 2-TYRYLCHILIU(TAB. 33 A 34)... 80 6.15 AMIDY CHILI-7-KARBXYLVÉ KYELIY (TAB. 35)... 81 6.16 TATÍ TRUKTURY (TAB. 36)... 81 7. ZÁVĚR... 82 8. UHR... 84 9. PUŽITÁ LITERATURA... 86 10. EZAM GRAFŮ A TABULEK... 87 5
1. EZAM ZKRATEK AC Absidia corymbifera AF Aspergillus fumigatus CA Candida albicans CG Candida glabrata CK Candida krusei CT Candida tropicalis DM dimethylsulfoxid HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie IC 80 inhibiční koncentrace zastavující růst houby z 80 % Log P veličina udávající poměr lipofilních a hydrofilních vlastností molekuly MFC minimální fungicidní koncentrace MIC minimální inhibiční koncentrace MP 3-morfolinpropan-1-sulfonová kyselina M r RPMI GA TA TM relativní molekulová hmotnost tekuté tkáňové médium s glutaminem abouraudův glukózový agar Trichosporon asahii Trichophyton mentagrophytes 6
2. ÚVD Vývoj nových protiinfekčních látek je nutný z mnoha důvodů. Hledají se látky účinnější, specificky toxické pro mikroby a zároveň bezpečnější pro pacienty, pokud jde o výskyt závažných a nepříjemných nežádoucích účinků. Při hledání nových účinných látek hraje také významnou roli otázka rezistence na stávající antiinfektiva. a skupinu antimykotik se začala upírat pozornost teprve poměrně nedávno. Houby jako infekční agens mají nižší invazivitu než bakterie, nejsou do takové míry přizpůsobeny parazitickému způsobu života a podmínkám, které poskytuje lidský organismus. Většina mykotických onemocnění probíhá pouze lokálně na povrchu těla (kůže a kožní deriváty, sliznice), menší procento mykotických onemocnění tvoří infekce systémové, které se však vyznačují vysokou mortalitou, zvláště při nákazách nozokomiálních. Frekvence výskytu těchto závažných systémových mykóz však v poslední době rapidně narůstá a to především z důvodu zvyšujícího se počtu imunoalterovaných pacientů (pacienti léčení imunosupresivy, po transplantacích, pacienti s AID apod.). Aktuálnost vývoje nových antimykotik také roste v souvislosti s uvědoměním si rozvoje rezistence na současně používaná léčiva. oučasné spektrum antifungálních látek neskýtá dostatečnou možnost výběru optimální terapie. Převážnou většinu lze použít pouze lokálně, použití některých systémově podávaných látek je limitováno jejich toxicitou. Druhové spektrum účinku mnohých antimykotik je poměrně úzké, což, vzhledem k obtížnosti diagnostiky invazivních mykóz, omezuje jejich použití jako empirické terapie. Předmětem předložené diplomové práce bylo laboratorní testování antifungální aktivity nově syntetizovaných léčiv připravených na Katedře farmaceutické chemie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové Univerzity Karlovy v Praze. Látky byly hodnoceny mikrodiluční bujónovou metodou stanovením minimální inhibiční koncentrace na souboru typických představitelů potenciálně patogenních hub pro člověka. 7
3. TERETICKÁ ČÁT 3.1 Postavení a význam hub v přírodě Houby tvoří jednu z pěti samostatných říší živých organismů, která se nazývá Fungi. Jsou to jedno a vícebuněčné, eukaryotické organismy, které se vyživují převážně saprotroficky. Tyto tzv. chemoheterotrofní organismy jsou metabolicky uzpůsobeny k získávání energie a intermediátních sloučenin z látek organického původu. Vedle primárního je pro houby charakteristický také sekundární metabolismus, kterým produkují velký a různorodý počet látek (např. toxinů), jejichž funkce není vždy zcela zřejmá. V přírodě fungují jako destruenti rozmanitých látek organického původu, jako je celulóza, lignin, keratin apod. Jen malá část, asi 0,5%, z více než 300 000 odhadovaného počtu druhů hub se adaptovala k parazitismu rostlin a živočichů a může způsobovat např. nemoci rostlin a zvířat, degradaci potravin, léků a chemických produktů a také negativně působí na zdraví lidské populace. Vedle hub, které náš život ovlivňují nežádoucím způsobem, existují i takové, které nachází uplatnění při průmyslové výrobě potravin (pivo, víno, sýry), léků (antibiotika, cyklosporin, alkaloidy), organických látek (kyseliny, vitamíny, alkohol, enzymy), a mohou se využít i pro genetické a metabolické studie (Buchta, 1998). 3.2 Houbová buňka, růst a rozmnožování hub Houbové buňky jsou eukaryotické stavby, takže se podobají více buňkám savců než buňkám bakterií. Tato podobnost znamená relativní nedostatek odlišných struktur a je jednou z hlavních překážek při vývoji nových, selektivně působících antifungálních látek s nízkou toxicitou pro člověka. Většina antimykotik používaných v současné době využívá při mechanismu působení důležitý rozdíl, kterým je hlavní sterol plazmatické membrány. U hub je tímto sterolem ergosterol zatímco savčí plazmatická membrána obsahuje převážně cholesterol. Základní stavební jednotkou stélky hub jsou trubicovitá vlákna rostoucí vrcholovým růstem, která se obvykle větví a splétají v mycelium. dborný název tohoto vlákna je hyfa. Vedle hub s typickou vláknitou strukturou existují také houby s redukovanou jednobuněčnou stélkou, které označujeme jako kvasinky. Kvasinky rostou pučením a za určitých podmínek okolního prostředí mohou vytvářet pseudomycelium, někdy dokonce i pravé mycelium (Buchta, 1998). 8
ěkteré houby mají schopnost růst dle podmínek prostředí buď ve formě vláknitého mycelia nebo kvasinek. Tento jev se nazývá dimorfismus. Můžeme se s ním setkat jak u primárně nepatogenních, tak u patogenních druhů hub, u kterých se uplatňuje jako virulenční faktor. Mezi pravé dimorfní houby patří např. Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Paracoccidioides, porothrix. Teplota je podstatným faktorem ovlivňujícím směr morfogenní konverze těchto hub. Ve formě vláknité se vyskytují v přírodě či v laboratorní kultuře při teplotě 25 C. aproti tomu forma kvasinková je považována za parazitickou, vyskytuje se při napadení tkáně hostitele a také v laboratorní kultuře při 37 C. pačnou strategii dimorfismu ve vztahu k parazitismu vykazuje Candida albicans, u níž je invazivní parazitickou formou pseudomycelium či vláknité mycelium (Buchta, 2002). Do vyšších taxonomických jednotek se houby zařazují dle základních kriterií, kterými jsou zejména způsob rozmnožování, velikost, tvar a typ reprodukčních struktur. Při sexuální reprodukci pravých hub (Eumycota) vznikají exospory (basidium = stopka, odtud basidiospory) a endospory (ascus = vřecko, odtud askospory). U askomycetů a basidiomycetů je vývoj pohlavních spor spojen s tvorbou plodnic. U spájivých hub (Zygomycetes) je pohlavní proces uskutečněn spojením dvou specializovaných hyf za vzniku zygospory. V případě asexuální reprodukce vznikají rovněž endospory či exospory, které se označují jako konidie. Konidie hrají podstatnou roli v identifikaci imperfektních hub, u kterých nejsou známa sexuální stadia (Buchta, 1998). 3.3 Houby patogenní pro člověka Prakticky všechny druhy hub potenciálně patogenních pro člověka patří mezi pravé houby: EUMYCTA (stélku tvoří hyfy, pseudomycelium nebo jen blastospory, buněčná stěna složená z chitinu a glukanů, rozmnožování pohlavní i nepohlavní), které se dělí na: Zygomycetes (houby spájivé) Mucorales Rhizomucor, Rhizopus, Absidia Entomophthorales Basidiobolus, Conidiobolus Ascomycetes (houby vřeckovýtrusé) Talaromyces, Eurotium, Arthroderma, Ajellomyces, accharomyces, Claviceps Basidiomycetes (houby stopkovýtrusé) Agaricales Amanita, Boletus, Inocybe, Tricholoma 9
Fungi Imperfecti (Deuteromycetes) Blastomycetes Candida, Cryptococcus, Malassezia, Rhodotorula, Trichosporon Hyphomycetes Alternaria, Aspergillus, Blastomyces, Epidermophyton, Fusarium, Geotrichum, Histoplasma, Microsporum, Penicillium, Trichophyton 3.4 Mykotická onemocnění Rozeznáváme čtyři základní způsoby poškození zdraví člověka houbami: 1. Mycetismy 2. Mykotoxikózy 3. Mykoalergie 4. Mykózy 3.4.1 Mycetismy Mycetismy jsou alimentární otravy, ke kterým dochází následkem přímého požití celých plodnic vyšších hub a intoxikací jejich toxiny. Původce nalezneme především mezi jedovatými stopkovýtrusými houbami. V ČR jde nejčastěji o druhy Amanita phalloides, A. pantherina, A. muscaria, Entoloma lividum, Inocybe patouillardi či poměrně vzácný Boletus satanas. Mykotoxiny kloboukatých hub se dělí do dvou skupin. Vysoce toxické jsou cytotoxiny (phalloidin, amanitin) méně nebezpečné pak neurotoxiny (muskarin) (Buchta 1998). 3.4.2 Mykotoxikózy Jsou to otravy toxiny a jinými toxickými látkami produkovanými sekundárním metabolismem hub. Po požití potravy kontaminované těmito látkami dochází k intoxikaci. Vzácněji k ní může dojít také kontaktem či inhalací. Hlavními producenty mykotoxinů jsou vláknité houby rodu Aspergillus, Penicillium a Fusarium. Pro lidské zdraví představují mykotoxiny významný rizikový faktor. Vyvolávají jak akutní, tak chronické toxikózy. Řada vykazuje potenciální karcinogenní a teratogenní schopnosti. Mezi nejvýznamnější mykotoxiny patří aflatoxiny a námelové alkaloidy (Buchta 1998). 10
3.4.3 Mykoalergie Mykoalergie jsou hypersenzitivní reakce imunitního systému predisponovaného jedince na antigenní stimulaci houbovým alergenem, který je představován nejčastěji sporami. Mezi alergická onemocnění vyvolaná houbami patří: alergická rhinitis a astma, alergická alveolitis (farmářská plíce), chronická bronchitis, toxický syndrom reakce na organický prach (vedle spor hub obsahuje prach i bakterie, endotoxiny apod.) Mezi nejvýznamnější a nejčastěji se vyskytující alergenní houby patří hyfomycety rodu Cladosporium, Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, dále basidiomycety, některé kvasinky a zygomycety (Rhizomucor, Rhizopus) (Buchta 1998). 3.4.4 Mykózy Většinu mykotických infekcí způsobují houby, jež se vyskytují jako saprofyty v prostředí. ěkteré kvasinky jsou komenzály člověka, to znamená, že jsou přirozenou součástí jeho mikroflóry, a vyvolávají proto endogenní infekce v případě porušení rovnováhy, vnímavosti a rezistence. Rozeznáváme tři základní typy mykóz a to: povrchové, podkožní a systémové. Povrchové mykózy jsou nejběžnější a ve světě všeobecně rozšířené. Postihují kůži, vlasy, nehty a sliznice. Infekce vyvolané dermatofyty (rody Microsporum, Epidermophyton a Trichophyton) napadají keratinovou tkáň vlasů a nehtů a rohovou vrstvu kůže a nazýváme je dermatomykózy, či také latinským tinea. Vyskytují se u lidí i zvířat. V mírném klimatickém pásmu tvoří 75% všech dermatomykóz tinea pedis někdy spojená s postižením nehtů a slabin, která se šíří na veřejných koupalištích a v hromadně používaných sprchách. Dalšími původci povrchových mykóz jsou kvasinky. Tyto patogeny napadají kůži, nehty a sliznici úst a pochvy. Většinou jde o druhy rodu Candida, především C. albicans, která bývá přirozenou součástí mikroflóry člověka. Kvasinka Malassezia furfur způsobuje kožní infekci pytiriasis versicolor, Trichosporon asahii pak bílou piedru. Tato onemocnění jsou poměrně častá, ne však příliš závažná, nepříjemná je v některých případech nutnost poměrně dlouhodobé léčby (Greenwood 1999). Podkožní mykózy postihují kůži, podkoží a kosti. Pomalu se šíří v místě infekce. Vyskytují se hlavně v tropech a subtropech. Vznikají mechanickým porušením pokožky a vnesením saprofytických hub z půdy nebo tlejících rostlin do podkoží. ejvýznamnější jsou mycetom, chromoblastomykóza a sporotrichóza (Greenwood 1999). ystémové mykózy jsou onemocnění postihující jeden nebo více orgánů. Mohou diseminovat a přejít do septického stavu, zvláště u pacientů se sníženou imunitní odpovědí. 11
ystémové mykózy lze rozdělit na primární a sekundární dle míry patogenity vyvolávajících agens. Primární systémové mykózy jsou způsobeny houbami, které jsou schopny vyvolat onemocnění i u lidí s nenarušenou imunitou, pokud vstoupí do endemických oblastí jejich výskytu. Původci těchto infekcí jsou především dimorfní houby (Blastomyces, Coccidioides, Histoplasma, Paracoccidioides) a někdy také kvasinka Cryptococcus neoformans, která se vyznačuje afinitou k centrální nervové soustavě (Buchta 1998). ekundární (oportunní) systémové mykózy jsou způsobené příležitostnými patogeny, druhy rodu Aspergillus, Candida a Cryptococcus a také zygomycetami. Tyto infekce se vyskytují se zvýšenou frekvencí u pacientů imunoalterovaných nemocí nebo léčbou (dlouhodobější terapie širokospektrými antibiotiky, krevní malignity, hyperglykémie, AID, imunosupresivní terapie apod.). U pacientů po transplantaci jsou onemocnění způsobená těmito houbami nejčastější příčinou úmrtí pro infekci (Greenwood 1999). Pro zdravého, imunokompetentního člověka nepředstavují tyto oportunní houby reálné nebezpečí. ejčastěji se s nimi setkáváme jako s nozokomiálními nákazami. Jsou obtížně diagnostikovatelné, často je nutná empirická antimykotická terapie, charakteristická je také vysoká mortalita. K terapii těchto velice závažných onemocnění máme k dispozici jen velice omezenou škálu antimykotik: amfotericin B, flukonazol, ketokonazol, itrakonazol a flucytosin, který se však, pro značný výskyt rezistence, používá prakticky jen v kombinaci s amfotericinem B. Problémem jsou pak k flukonazolu rezistentní kmeny kandid (C. krusei a C. glabrata), které se vyskytují sice podstatně méně než C. albicans, v poslední době se však rozšiřují a to převážně u pacientů s AID (Buchta 1998). 3.5 Antimykotika K léčbě mykotických onemocnění se používá, ve srovnání s antibakteriální terapií, poměrně málo látek. Důvodem je vysoká podobnost buněk hub a buněk savců. Jednotlivá antimykotika mají rozdílné spektrum účinnosti. Přibližně 12% kvasinek izolovaných z klinických onemocnění je rezistentních k flucytosinu a rezistence se objevuje ještě během terapie. Většina antimykotik je určena k zevnímu použití a jen některá se používají celkově (perorálně a parenterálně) (Greenwood 1999). Začátek chemoterapie dermatomykóz byl typický používáním prostředků, které likvidovaly původce infekce a současně způsobily sloupání vrchní části pokožky, zatímco houby, které pronikly hlouběji měly být eliminovány jen imunitními reakcemi organismu. Používány byly v převážné míře sloučeniny s dezinfekčním nebo antiseptickým účinkem. 12
Určitou přechodnou skupinu mezi dezinficiencii a antifungálními chemoterapeutiky tvoří lokálně zevně používaná antimykotika. V této indikaci se používají léčiva odvozená od dezinficiencií, jejichž molekula po vhodné modifikaci vykazuje zvýšený antifungální účinek. Další skupinu antimykotik potom tvoří látky podávané vnitřně, které musí vyhovovat všem požadavkům na chemoterapeutika infekčních onemocnění. Tyto látky jsou vhodné pro terapii systémových mykóz a dermatomykóz, kterých přibývá jako následek rozšířeného používání širokospektrých antibiotik, kdy dochází k poruše mikrobiální rovnováhy v organismu, a nárůstem počtu imunoalterovaných pacientů (Hartl a Palát 1992). 3.5.1 Dezinficiencia a antiseptika Dezinficiencia jsou látky, jejichž toxicita je pro mikroorganismus jen velmi málo selektivní a jsou proto toxické i pro makroorganismus. Používají se k usmrcení mikrobů ve vnějším prostředí (infekční materiál, na předmětech apod.), kde jejich toxicita není rozhodující. Musí působit mikrobicidně, mikrobistatický účinek není postačující. aproti tomu antiseptika jsou antimikrobně účinné látky, která jsou lokálně dobře snášena a prakticky se neresorbují. Často účinkují pouze mikrobistaticky. Používají se např. na ošetření sliznic, kůže a někdy i otevřených ran. Jejich toxicita pro člověka je nižší, ale jejich aplikace nezbaví tkáně všech mikroorganismů (Hartl a Palát 1992). Dezinficiencia a antiseptika se používají v humánní terapii mykóz už jen v omezené míře, nacházejí však uplatnění i ve veterinární medicíně. Ke starším antimykotikům patří látky ze skupiny trifenylmethanových barviv a to především methylrosanilin (krystalová violeť), dále také brilantová zeleň či methylová violeť. Používání těchto látek je problematické pro jejich nestabilní účinek u hloubkových mykóz a onychomykóz a také z důvodu intenzivní barevnosti a značné dráždivosti. Používají se také různé organické kyseliny, jejich soli a některé funkční deriváty. ejčastěji je používána kyselina undecylenová. Z aromatických kyselin se potom uplatňuje kys. benzoová, kys. salicylová, která je sice účinná až ve vyšších dávkách, ale pro svůj keratolytický efekt je přidávána do kombinovaných přípravků, a také některé deriváty kys. salicylové, které se vyznačují vyšší antifungální aktivitou. Fenoly mají nevhodné vlastnosti, především leptavost a toxicitu. Proto se používají opatrně v nízkých koncentracích. Účinnost fenolu roste jeho chlorací a nitrací (prakticky se používá např. 2-chlor-4-nitrofenol), významný je také hexachlorofen (Melichar 1987). 13
3.5.2 Antifungální antibiotika a chemoterapeutika Účinek antimykotik se projevuje buď inhibicí růstu houby (fungistatické působení) nebo jejím usmrcením (efekt fungicidní). Kvantitativní vnímavost mikrobiální populace se obvykle vyjadřuje minimální inhibiční koncentrací (MIC) (Buchta 1998). Antimykotika lze z klinického hlediska dělit na systémová (amfotericin B, flucytosin, ketokonazol, mikonazol, flukonazol, itrakonazol, griseofulvin, terbinafin) a lokální (nystatin, natamycin, ekonazol, tiokonazol, klotrimazol, terkonazol, ciklopiroxolamin, tolnaftát, tolciklát, amorolfin). Lokální antimykotika se používají buď jako doplněk systémové terapie nebo samostatně v léčbě méně závažných dermatomykóz. 3.5.2.1 Polyenová antimykotika Jsou to antibiotika mikrobiálního původu se širokým spektrem účinku. Používají se parenterálně (amfotericin B) i lokálně (natamycin, nystatin). e systémovým podáním jsou spojeny časté a závažné toxické účinky (Buchta 1998). Amfotericin B je makrolidové polyenové (heptaen) antimykotikum se systémovým účinkem. Je dostupný i v přípravcích na lipidovém nosiči, jejichž farmakologické vlastnosti jsou klinicky výhodnější (především nižší nefrotoxicita). Je dosud nejúčinnějším antimykotikem s nejširším spektrem účinku a nejmenším výskytem rezistencí. Amfotericin B se indikuje u invazivních infekcí ohrožujících život v případě, že je dobře snášen pacientem, dále se podává profylakticky nemocným po protinádorové léčbě a pacientům po transplantaci orgánu. Molekula amfotericinu B je amfoterní, prakticky nerozpustná ve vodě. Mechanismus fungicidního účinku spočívá ve vazbě na ergosterol buněčné stěny hub a následném rozrušení její integrity. pektrum účinnosti amfotericinu B je široké, mezi citlivé patří kandidy, kryptokoky, aspergily, mukory a dimorfní houby. Převážně rezistentní jsou kmeny Pseudallescheria boydii (cedosporium spp.), získaná rezistence byla zjištěna u Candida tropicalis, C. parapsilosis, C. lusitaniae. Může existovat zkřížená rezistence s ostatními polyenovými antimykotiky. ežádoucí účinky jsou akutní (třesavka, horečka, nauzea a zvracení, průjem apod.) a chronické (nefrotoxicita s následnou elektrolytovou dysbalancí). Mezi lokální polyenová antimykotika patří nystatin a natamycin. ystatin má fungistatický až fungicidní účinek. Do spektra jeho účinku patří především kvasinkové mikroorganismy rodů Candida, Rhodotorula a Trichosporon, dobře působí i na mikromycety rodu Aspergillus. Je používán u povrchových kandidóz a k doplnění léčby při poševní kandidóze. atamycin má fungistatický účinek proti širokému spektru hub, terapeuticky lze 14
však využít pouze účinek proti kandidám a Trichomonas vaginalis. Používá se např. při kandidóze ústních koutků, kandidové vulvitidě, paronychii a onychomykóze (Lincová 2002). 3.5.2.2 Azolová antimykotika Jsou připravená synteticky. Mají široké spektrum účinku. Většina je dostupná pouze pro lokální léčbu, několik pro parenterální aplikaci (mikonazol, ketokonazol, flukonazol, itrakonazol). Jsou to buď deriváty imidazolu (klotrimazol, mikonazol nebo ketokonazol) nebo triazoly (itrakonazol, flukonazol). Rozlišujeme 3 generace: první je zastoupena imidazolovými deriváty (mikonazol, a lokální ekonazol, klotrimazol). Druhá generace zahrnuje další topické preparáty (oxikonazol, terkonazol, bifonazol, tiokonazol, isokonazol atd.) s podobným účinkem a klinickým použitím. Dále sem patří perorální ketokonazol, který se dnes používá prakticky už jen k léčbě povrchových mykóz. kutečným průlomem v moderní terapii mykóz bylo až uvedení třetí generace triazolových derivátů flukonazolu a itrakonazolu do praxe (Buchta 1998). V nedávné době se vytvořila ještě 4. generace azolových antimykotik, jejímiž hlavními zástupci jsou vorikonazol a posakonazol. Mechanismus fungistatického účinku azolových antimykotik je společný a spočívá v inhibici enzymů konečné fáze syntézy ergosterolu. Klíčovým krokem účinku azolových antimykotik je blokáda cytochromu P450. pecifita účinku na fungální cytochrom P450 souvisí s výskytem nežádoucích účinků při léčbě těmito antimykotiky. Inhibicí syntézy membránových struktur azolová antimykotika blokují u dimorfních hub morfogenezi z kvasinkové do myceliální formy. Antimikrobní spektrum azolových antimykotik zahrnuje Candida spp., dimorfní houby, dermatofyty. U kryptokokových infekcí je účinek nestabilní. U aspergilózy jsou s výjimkou itrakonazolu, vorikonazolu a posakonazolu neúčinné. Rezistence na azolová antimykotika se postupně stává klinickým problémem tak, jak se zvyšuje jejich používání v klinické praxi. Závažnější nežádoucí účinky jsou popisovány u mikonazolu a ketokonazolu. U mikonazolu se vyskytují již během aplikace (GIT potíže, alergické reakce až anafylaktický šok) a byly tak časté a významné, že vedly k postupnému ústupu používání mikonazolu ve prospěch flukonazolu a itrakonazolu.tolerance flukonazolu a itrakonazolu je velmi dobrá. Mikonazol se v současné době používá převážně jen lokálně. Ketokonazol se významně akumuluje v kůži, kde přetrvává depot až 5 dní po vysazení léčby. Indikací jsou proto především infekce kůže, vlasů a nehtů způsobené dermatofyty nebo kvasinkami za předpokladu, že tyto infekce nelze léčit topicky pro jejich rozsáhlost, nedostupné umístění apod. Další indikací jsou kvasinkové infekce trávicího ústrojí. 15
Flukonazol se od ostatních azolových antimykotik liší farmakokinetikou (je hydrofilní), má nejvyšší terapeutický index, nejméně nežádoucích účinků a lékových interakcí. Primárně rezistentní je C. krusei, vysoká incidence získané rezistence je pozorována u C. glabrata. Je neúčinný u aspergilózy a zygomykózy. Používá se i k primární profylaxi u rizikových pacientů. Vykazuje synergický účinek s flucytosinem a mikonazolem. Itrakonazol je systémové triazolové antimykotikum. Je účinný i proti aspergilům, avšak v této indikaci jde až o látku druhé volby po vorikonazolu a amfotericinu B. Lokální azolová atimykotika jsou důležitými léčivy při terapii dermatologických a gynekologických houbových onemocnění. Ekonazol a klotrimazol působí fungistaticky až fungicidně na proliferující kvasinky a plísně, nepůsobí na spory. Účinkují také na většinu grampozitivních bakterií včetně Propiniobacterium acnes. Primárně rezistentní kmeny jsou vzácné, sekundárně odolné kmeny se vyvíjejí pomalu. Indikacemi jsou dermatofytózy, kandidózy a keratomykózy, pityriasis, erythrasma. Podobné vlastnosti má i fentikonazol. Tiokonazol je určen výlučně k léčbě kandidových vulvovaginitid, stejně jako oxikonazol a terkonazol (Lincová 2002). Vorikonazol vykazuje vyšší specifitu k mikrobiálnímu cytochromu P450. Je velmi účinný a proto i lékem první volby u invazivní aspergilózy, působí i na rody cedosporium a Fusarium. Vykazuje účinnost i proti flukonazol rezistentním kandidám. 3.5.2.3 Allylaminové deriváty Jsou to širokospektrá chemoterapeutika s nízkou toxicitou pro perorální a lokální podání k léčení kožních a slizničních mykóz. Mezi nejdůležitější patří terbinafin a naftifin, který se používá jen lokálně (Buchta 1998). Terbinafin blokuje biosyntézu ergosterolu inhibicí aktivity enzymu skvalen-epoxidázy. Antimikrobní spektrum zahrnuje dermatofyty, kvasinky, Aspergillus, dimorfní houby. Terbinafin je vysoce lipofilní a keratofilní a postupně se koncentruje v tukové tkáni, v kůži a jejích adnexech. Terbinafin je indikován v léčbě tineí a kvasinkových infekcí způsobených zástupci rodu Candida, při onychomykóze vyvolané dermatofyty. Vzhledem k farmakokinetice není terbinafin vhodný pro léčbu systémových mykotických infekcí (Lincová 2002). 3.5.2.4 Antimetabolity Flucytosin (5-fluorcytosin) je systémové antimykotikum s úzkým spektrem účinku, které je jediným zástupcem antimetabolitů. Chemicky se jedná o fluorovanou pyrimidinovou bázi. Je aktivně transportován do buňky mikromycet, kde je deaminován na vlastní účinnou 16
látku 5-fluoruracil, který je inkorporován do RA s výslednou inhibicí syntézy nukleových kyselin. V menší míře blokuje 5-fluorcytosin syntézu DA jako antagonista cytosinu. V terapeutických dávkách působí fungistaticky, v nižších blokuje adhezivní schopnosti kandid na sliznice. Antimikrobní spektrum obsahuje především kandidy, kryptokoky, jen v kombinaci je účinný proti aspergilům. Vyskytuje se častá sekundární rezistence. V monoterapii je indikován jen zcela výjimečně (Lincová 2002). 3.5.2.5 statní antimykotika Griseofulvin je benzofuranové antibiotikum, které se používá systémově. Je lipofilní, špatně rozpustný ve vodě. Mechanismus jeho fungistatického účinku spočívá v denaturaci proteinového cytoskeletu, po jehož dezintegraci se buňka nemůže dělit. Funkčně jde o inhibici proteosyntézy a syntézy mra, a zejména o narušení stavby buněčné stěny, morfologicky pak o blokádu proliferace hyf (resp. pokud se vytvoří, jsou deformované, nefunkční). Antimikrobní spektrum účinku je úzké, působí pouze na dermatofyty. Rezistence vzniká velmi vzácně. Kumuluje se v kůži a jejích adnexech. Griseofulvin vykazuje zkříženou alergii s penicilinem (Lincová 2002). Lokální antimykotikum ciklopiroxolamin je aminoetanolová sůl cyklohexyl-hydroxymethylpyridonu., která působí fungicidně proti všem relevantním patogenům odpovědným za plísňové infekce nehtů. Vykazuje také výrazný účinek sporocidní a protizánětlivý. Penetruje snadno do kůže a proniká i celou tloušťkou nehtové ploténky. Působí prostřednictvím inhibice proteosyntézy (Lincová 2002). Tolnaftát je lokální tiokarbamátové antimykotikum, které je účinné při zevní léčbě povrchních houbových infekcí kůže, perorální aplikace není účinná. Vykazuje selektivní fungistatickou aktivitu proti dermatofytům. Zcela neúčinný je např. proti C. albicans. Mechanismem účinku je inhibice syntézy ergosterolu interferencí se skvalen-epoxidázou (Lincová 2002, Buchta 1998). Amorolfin je morfolinový derivát pro lokální aplikaci s dobrým průnikem do nehtu. Jeho účinek je fungistatický až fungicidní, působí inhibičně na syntézu ergosterolu. pektrum účinku je poměrně úzké, působí na dermatofyty, kvasinky a M. furfur. Používá se tedy k terapii dermatomykóz včetně onychomykóz a proti pityriáze (Buchta 1998). Kaspofungin je novější preparát, jehož mechanismem účinku je inhibice syntézy β-(1,3)-d-glukanu, který je složkou buněčné stěny mnoha vláknitých hub a kvasinek. Kaspofungin je polosyntetická lipopeptidová sloučenina izolovaná z produktu fermentace Glarea lozoyensis. Do spektra účinku této látky patří kandidy, včetně non-albicans Candida 17
druhů, a dále četné druhy rodu Aspergillus, např. A. fumigatus, A. flavus, A. niger. Podává se parenterálně. Výhodou tohoto preparátu je jeho účinnost i proti druhům rezistentním vůči amfotericinu B, itrakonazolu a flukonazolu (AILP). 3.6 Popis kmenů hub použitých při testování patogenními houbami se v mykologické laboratoři setkáváme jednak ve formě kvasinkovité, jednak ve formě vláknité. 3.6.1 Kvasinky Kvasinky jsou většinou jednobuněčné. Většina z nich se množí nepohlavně tzv. pučením, při němž se na buňce vytvoří výrůstek, který se zvětšuje a poté oddělí. ěkteré kvasinky vytvářejí pseudomycelium, některé druhy dokonce pravé mycelium (Greenwood 1999). Vyskytují se geopolitně v přírodě, především v kvasících ovocných šťávách, na ovoci a v půdě. ěkteré z nich našly uplatnění v průmyslu, jiné mohou vyvolávat onemocnění člověka a zvířat. Kvasinky jsou součástí přirozené mikroflóry člověka, nacházíme je především na kůži a v trávicím traktu. nemocnění vyvolávají při přemnožení (např. po terapii širokospektrými antibiotiky) či u imunoalterovaných jedinců (Fragner 1984). Candida albicans se ve volné přírodě vyskytuje pouze ojediněle a to především ve výkalech zvířat a v půdě. aopak v lidském materiálu se vyskytuje ze všech kvasinek nejčastěji. Způsobuje 80-90% všech kandidóz. Vyvolává především onemocnění kůže, nehtů a sliznic (soor v dutině ústní, vulvovaginitidy). Je také původcem střevní kandidózy. ebezpečná je u imunitně oslabených jedinců, kde způsobuje sepse a fungémie, endokarditidy a meningitidy (Fragner 1984). Je to aerobní, růstově nenáročná polymorfní kvasinka. a abouraudově glukózovém agaru (GA) roste dobře při 37 C i 25 C. Kolonie jsou smetanově bílé, hladké, mírně vyklenuté s mazlavou konzistencí a kvasnou vůní. kraj kolonie je kruhovitý, nevláknitý (Buchta 2002). Candida glabrata se nachází převážně v lidském materiálu a to v dutině ústní, jícnu, na kůži a nehtech, můžeme ji nalézt i ve sputu a vaginálním sekretu. Je příčinou vaginálních a močových infekcí, vzácně (především u oslabených jedinců) může vyvolávat fungémie a sepse, endokarditidy a různá systémová onemocnění. Špatně reaguje na léčbu ketokonazolem a flukonazolem. 18
Kolonie jsou poměrně nízké, mírně vyklenuté, hladké a vysoce lesklé. Mají bělavě krémovou barvu, uprostřed bývají tmavší. kraj je kruhovitý či slabě laločnatý, nevláknitý. etvoří hyfy ani pseudohyfální struktury. Bývá patrné ovocné aroma (Fragner 1984). Candida krusei se hojně vyskytuje při kysání zelí. Dále ji můžeme objevit v jogurtu, datlích, kvasícím kakau, ovocných šťávách a různých přírodních substrátech. U člověka se vyskytuje ve sputu, stolici, na nehtech. ebývá příliš nebezpečná, pro myši je dokonce nepatogenní. ejčastějším onemocněním, které vyvolává jsou vaginální fluory u žen, způsobuje však i jiné slizniční infekce. Léčba je komplikována necitlivostí k široce používanému flukonazolu (Fragner 1984). Candida krusei tvoří typicky zploštělé a matné kolonie, které mívají šedo-béžový odstín. Charakteristická je častá acetonová vůně. kraj bývá mohutně vláknitý (Buchta 2002). Candida tropicalis se vyskytuje na shnilém ovoci a dřevě, kyselém zelí, kefíru, lisovaném droždí. Je po C. albicans druhým nejčastějším původcem kandidóz, zvláště u onkologických pacientů. Vyvolává kožní infekce, paronychie, onychomykózy, otomykózy a vaginální infekce. Závažnější jsou pak oční onemocnění, sepse, endokarditidy a také systémová onemocnění (Fragner 1984). Mikroskopicky i makroskopicky je velmi podobná C. albicans. Její kolonie na GA jsou však obvykle drsné, krajkovité, s okrajem vrostlým do agaru. Kultury mají příjemnou, slabě ovocnou vůni nebo i nepříjemně páchnou (Buchta 2002). Trichosporon asahii se objevuje v půdě, odpadních vodách, dřevovině při výrobě papíru, slupce pomeranče, mléce, u člověka potom převážně v močových cestách, dále pak na nehtech, kůži, v dutině ústní, ve sputu. V tropických oblastech je původcem onemocnění zvaného bílá piedra, které postihuje vlasy, vousy a chlupy. K vyléčení obvykle postačí oholení postižených oblastí. V našich klimatických podmínkách se podílí na různých kožních chorobách, převážně na onychomykózách a interdigitálních erozích rukou. Kolonie jsou bělavé, nízké s vyvýšeným středem, který se leskne, zatímco okolní část je matná. kraj je kruhovitý nebo laločnatý, jemně a dlouze vláknitý (Fragner 1984). Tento taxon byl revidován a reklasifikován, podle starší nomenklatury byl označován jako Trichosporon beigelii (Gueho et al.1994). 3.6.2 Vláknité houby značují se také jako myceliové houby nebo plísně. Jejich stélka je složena z vícebuněčných hyf. Plísně se rozmnožují pomocí spor, které jsou jedním z nejdůležitějších identifikačních znaků těchto hub. Jsou v přírodě značně rozšířeny (Greenwood 1999). 19
Mezi vláknité houby se řadí především mikroskopické askomycety. ěkteré z těchto hub jsou dimorfní. K primárně patogenním dimorfním houbám patří Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides a Paracoccidioides. Keratofilní houby napadající hlavně kůži se označují jako dermatofyty (Trichophyton, Microsporum a Epidermophyton). K patogenním vláknitým houbám se také řadí zástupci řádu Mucorales (Rhizopus, Rhizomucor a Absidia) (Buchta 1998). Absidia corymbifera se vyskytuje na různém rostlinném materiálu a to převážně na seně, pšenici, rýži, sojových bobech a v mouce, na hrachu a v arašídové mouce (Fragner 1984). Je vzácným původcem nozokomiálních nákaz u silně imunoalterovaných pacientů (nekontrolovaný diabetes, leukémie, rozsáhlé popáleniny). Při kultivaci tvoří Absidia vysoké, aerální, vatovité mycelium, zpočátku bělavé, které při sporulaci šedne (Buchta 2002). Aspergillus fumigatus je rozšířen po celém světě. Druhy rodu Aspergillus se vyskytují v půdě, účastní se rozkladných procesů v přírodě. ěkteré druhy mají také průmyslový význam. K produktům jejich sekundárního metabolismu patří některá antibiotika (která ale nenašla praktické využití), ale také nebezpečné toxiny (aflatoxin, ochratoxin). Aspergillus fumigatus produkuje alkaloidy festuklavin a fumigaklaviny A a B (Fragner 1984). Je původcem alergických a infekčních onemocnění. Vyvolává také otomykózy a onychomykózy, u traumatizovaných a imunoalterovaných jedinců je hlavní klinickou formou pulmonální aspergilóza, vzácněji aspergilom, keratitida, endokarditida a další (Buchta 1998). Při kultivaci na Czapek-Doxově agaru získáme tmavě zelené (zbarvení podle mikrokonidií), jemně zrnité kolonie, které jsou nízké, jen uprostřed mírně vyvýšené. kraj je bezbarvý, dlouze vláknitý, daleko se paprsčitě rozbíhající (Fragner 1984). Trichophyton mentagrophytes je nejednotný druh. Do pokusů byl použit T. mentagrophytes var. mentagrophytes, který patří k nejčastějším původcům dermatomykózy člověka. Vyskytuje se převážně na lidském či živočišném materiálu (kůže, chlupy). Patří mezi zoofilní dermatofyty (Fragner 1984). Klinické projevy dermatofytóz se označují latinským tinea. Často bývá postižena kůže na nohách a rukou (tinea pedum et manuum), vlasy (tinea capitis), třísla (tinea cruris), hladká kůže těla (tinea corporis) a nehty (tinea unguium) (Buchta 1998). Léze se liší podle místa infekce. nemocnění se projevuje suchým olupováním, hyperkeratózou, častěji drážděním, zčervenáním, tvořením puchýřků, které prosakují, pustulami a ulcerací (Greenwood 1999). 20
Kultury jsou jasně bílé, uprostřed s lehkým žlutavým nádechem, hrubě zrnité. třed mají mírně zdvižený nebo vmáčklý. kraj je bílý, hrubě zrnitý, paprsčitě rozbíhavý v jemná, různě dlouhá, bezbarvá vlákna (Fragner 1984). 3.7 Testování antifungální aktivity látek in vitro ledování citlivosti hub k antifungálně působícím látkám je v současnosti nezbytné hned z několika důvodů. Jedním je snaha o rozšíření možností při terapii hledáním nových antimykotik. Tato snaha je podporována zvyšující se incidencí mykotických onemocnění. utné je také porovnání jejich účinku před klinickým použitím. Dalším důvodem je výskyt rezistentních kmenů hub a proto potřeba hledat a používat preparáty, které si zachovaly účinnost in vitro. Důležité je také odhalování primární rezistence. Získané výsledky však vždy vedou jen k relativním závěrům o klinické použitelnosti (tčenášek 1990). Kvalitativní metody rozdělují testované kmeny hub podle růstu v přítomnosti antimykotika na citlivé, intermediátní a rezistentní. aproti tomu kvantitativní testy poskytují konkrétní hodnotu stupně citlivosti či rezistence daného kmene k příslušnému antimykotiku. Tato hodnota se nejčastěji vyjadřuje jako minimální inhibiční koncentrace (MIC) dané látky. Jako MIC se hodnotí nejnižší koncentrace z testované škály, při které nedochází k makroskopicky pozorovanému růstu testovaného mikrobiálního kmene. MIC může být definována relativně jako úplná 100 % nebo částečná (např. 50 % či 80 %, označovaná jako IC 50 resp. IC 80 ) inhibice růstu houby v porovnání s kontrolní jamkou, která obsahuje médium bez antifungálně působící látky. Při testování antimykotik (zvláště při zjišťování účinnosti proti kvasinkám) se používá hodnota IC 80, protože většina těchto látek růst hub zcela nezastavuje, ale jen zpomaluje a hranice pro odečítání (tzv. end-point) jsou potom neostré (Buchta 2002). Vedle MIC se někdy používá také minimální fungicidní koncentrace (MFC). Čím je MIC/MFC nižší, tím je daný kmen rezistentnější (Buchta 1998). 3.7.1 Difúzní agarová metoda Pod pojem difúzní agarová metoda se řadí diskový test a E-test. 3.7.1.1 Diskový test a povrch naočkované agarové půdy se pokládají disky impregnované určitým množstvím antimykotika, které postupně difunduje z disku do okolí a vytváří koncentrační gradient, který brání testovanému kmenu houby v jejím růstu. Tato inhibice závisí na citlivosti daného kmene. Po inkubaci se měří průměr inhibiční zóny (udává se v mm). Je tím větší, čím je testovaný kmen citlivější. 21
Výhodou této metody je její jednoduchost, rychlost a také možnost zkoušení více látek najednou přiložením více disků napuštěných různými látkami na jednu zkušební misku s inokulovaným agarem, nevýhodou je různá difuzní schopnost testovaných látek, což snižuje přesnost výsledků (Buchta 2002). 3.7.1.2 E-test E-test neboli gradientová difúzní metoda je kvantitativní test pro stanovení MIC na agarové plotně. Princip je podobný jako u diskového testu, ale na agar se přikládá kalibrovaný proužek, který obsahuje diskontinuitní gradient koncentrací testovaného antibiotika. Po přilnutí proužku na povrch agaru antimykotikum difunduje do okolí a vytváří kontinuální gradient podél a kolmo směrem od proužku. Inhibiční zóna při použití této metody má většinou oválný tvar a v místě, kde se dotýká proužku, se odečítá hodnota MIC. Výhodou E-testu je jednoduchost, naopak nevýhodami jsou finanční náročnost a nejednoznačné odečítání MIC (např. u částečné inhibice růstu u kvasinek) (Buchta 2002). 3.7.2 Diluční metody Jsou to kvantitativní fungistatické testy, které umožňují určit minimální inhibiční koncentraci testované látky. 3.7.2.1 Agarová diluční metoda Používají se Petriho misky naplněné standardním objemem agarové půdy, které jsou odstupňované dle koncentrace testovaného antimykotika. a povrch plotny se bodově naočkuje 30 až 40 kmenů. Po inkubaci se pozoruje nárůst kolonií na jednotlivých miskách. Tato metoda je precizní, výhodou je také snadnost odečítání (vhodná pro testování azolových antimykotik), na druhé straně je ale časově i materiálně náročná a proto se nehodí pro rutinní testování, nelze také určit MFC. Výsledek je závislý na rozpustnosti a disperzitě testované látky v agaru. (tčenášek 1990). 3.7.2.2 Diluční bujónové metody Patří k nejčastěji používaným. Praktické provedení spočívá v naředění (obvykle geometrickou řadou) testovaného antimykotika ve vhodném tekutém médiu. aředěná koncentrace antimykotika se může rozplňovat buď do zkumavek, pak mluvíme o makrodiluční bujónové metodě, nebo do jamek mikrotitrační destičky, pak se jedná o mikrodiluční bujónový test. Metoda destičková je v současnosti nejvíce upřednostňována. Lze ji používat pro testování rozsáhlejších souborů kmenů i většího počtu antimykotik, způsob přípravy zaručuje 22
vysokou standardnost provedení včetně možnosti automatizace, inokulace destiček je jednoduchá, lze při ní využít multipipet, je nižší spotřeba testovaných látek, inokula i kultivačních půd, což znamená nižší finanční náklady. aopak nevýhodou může být znehodnocení celé testované série při chybě v přípravě testovací půdy či v ředění testované látky. Pro zlepšení standardnosti a objektivnosti odečítání výsledků se používá např. kolorimetrické určení MIC, turbidimetrické nebo spektrofotometrické měření růstu hub (Buchta 2002). 3.7.3 Test stanovení minimální fungicidní koncentrace (MFC) Tímto testem se stanovuje nejnižší koncentrace antimykotika potřebná k usmrcení testovaných agens. Používá se obsah zkumavek či jamek destiček použitých v diluční bujónové metodě, ve kterých již nebyl pozorován nárůst, tento obsah se vyočkuje na tuhé médium v Petriho miskách bez antimykotika. Jako MFC se hodnotí koncentrace antifungálně aktivní látky v 1. zkumavce (1. jamce), po jejímž vyočkování nedošlo k nárůstu žádných nebo ne více než tří kolonií (tčenášek 1990). 3.7.4 Faktory ovlivňující testování antimykotik Pro zavedení do praxe musí mít každá metoda vypracovaný standardizovaný postup tak, aby poskytovala reprodukovatelné výsledky. tandardizace jednotlivých kroků metody umožňuje její použití v kterékoli laboratoři a měla by zajistit srovnatelnost dosažených výsledků. V tomto pohledu je situace uspokojivá v bakteriologii, ale u antifungálních látek byla metodologie standardizována teprve v 90. letech a stále se potýká s celou řadou problémů. Metodologické faktory základem je, že čím je daná metoda náročnější, tím je nižší možnost uspokojivé standardizace laboratorního postupu. Výsledky testování mohou být ovlivněny výběrem testu nebo parametru hodnotícím antifungální aktivitu, či způsobem odečtu výsledků. apř. jen částečná inhibice růstu hub resp. tzv. trailing effect se řeší zavedením relativního inhibičního parametru růstu (IC 80 ). Faktory podmíněné testovanou látkou zde záleží především na rozpustnosti a stabilitě testované látky. Může se stát, že paradoxně v jamkách s nižší koncentrací antimykotika dojde na rozdíl od jamek s vyšší koncentrací k inhibici růstu houby. Tento jev se nazývá Eagle efekt. Látka se ve vyšší koncentraci může vysrážet a snížit tak množství účinné rozpuštěné formy. Jiným aspektem jsou vlastnosti antimykotika, které mohou ovlivňovat jeho interakci s houbou (Buchta 2002). 23
Faktory podmíněné testovacím systémem může docházet k interferenci se samotným antimykotikem, nebo vytvoření více či méně vhodného prostředí pro růst dané houby. Uplatňuje se především složení testovacího média (např. aktivita 5-fluorcytosinu je antagonizována přítomností nukleosidů i jednotlivých bazí v médiu) a jeho ph (např. ve výrazněji kyselém prostředí ztrácí některá azolová antimykotika účinnost), teplota a délka inkubace (čím je delší, tím je vyšší rezistence, patrně z důvodu mutačních změn) (tčenášek 1990). Faktory podmíněné houbou v první řadě se jedná hlavně o velikost inokula (čím je větší inokulum, tím větší je MIC). Velikost inokula výrazně ovlivňuje výsledky např. u azolových chemoterapeutik, zatímco u polyenových antibiotik je závislost minimální. (tčenášek 1990). Dalším faktorem může být i stadium růstové fáze testované houby. Fyziologicky aktivní buňky jsou zranitelnější k zásahu antimykotik než klidová stadia. Proto musí být inokulum připraveno z čerstvých kultur, kde převládají buňky v exponenciální fázi růstu nad buňkami stacionárními či mrtvými (Buchta 2002). 3.8 Vztah mezi účinkem a strukturou léčiv truktura je nositelem chemických a fyzikálních vlastností molekuly. Chemické vlastnosti léčiva jsou často základním předpokladem účinku na základě schopnosti interagovat s příslušným partnerem (receptorem apod.) v organismu. Tato léčiva se označují jako strukturně specifická. Fyzikální vlastnosti ovlivňují distribuci léčiva v organismu, jeho vstřebávání, transport na místo působení a vylučování. emalý význam z hlediska účinku má také velikost, tvar a prostorové uspořádání molekuly. Velikost molekuly ovlivňuje především fyzikální a fyzikálně-chemické vlastnosti jako jsou skupenství, rozpustnost, schopnost pronikat tkáněmi, rychlost transportu aj. Jako léčiva se převážně uplatňují látky, jejichž molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí 100 až 1000 g.mol -1, což je dáno tím, že léčiva musí po podání překonat velké množství biologických bariér (buněčné membrány, sliznice, epitel cév apod.), aby dosáhla místa účinku. To je umožněno pouze molekulám, které mají dostatečnou schopnost difúze. U příliš velkých molekul může být difúze zpomalena, někdy i znemožněna. Zvětšení molekuly léčiva může mít za následek změnu v jeho vylučování, případně může ovlivnit délku jeho účinku. Tvar a prostorové uspořádání jsou pak faktorem, který sehrává důležitou roli při vlastním účinku. Umožňuje totiž snazší přístup k reaktivním místům a zakotvení na stereospecifických centrech receptorů. 24
Celý vývoj léčiv je typický postupným přechodem od látek obsahujících organismu cizí, často toxické prvky především ionty těžkých kovů (např. rtuť, stříbro, měď, zlato) či arsen, antimon, bismut k méně toxickým organickým sloučeninám těchto prvků. Tato léčiva pak byla nahrazována sloučeninami sestavenými pouze z biogenních prvků. oučasná léčiva jsou převážně organickými sloučeninami obsahujícími kromě uhlíku a vodíku dusík, kyslík, halogeny, popř. síru. Z fyzikálně-chemických vlastností, které jsou pro účinek léčiva nejdůležitější, můžeme jmenovat především bazicitu a kyselost, schopnost adsorpce a také rozpustnost léčiva ve vodě a v lipidech. Rozpustnost ve vodě a tucích se uplatňuje ve vzájemném vztahu. Jsou to veličiny nepřímo úměrné, tj. čím větší je rozpustnost ve vodě, tím menší je v tucích a naopak. Rozdělovací koeficient P vyjadřuje poměr celkové koncentrace látky rozpuštěné v lipidech (c L ) k celkové koncentraci léčiva rozpuštěného ve vodné fázi (c V ): V praxi se častěji setkáváme s hodnotou log P. Biologická aktivita nejrůznějších sérií organických látek vykazuje korelaci s hodnotou jejich log P. Proto se také log P stal jedním z hlavních parametrů kvantitativních vztahů mezi strukturou a aktivitou, známých pod jménem QAR (Quantitative tructure Activity Relationships). Popisují souvislost mezi intenzitou daného biologického účinku a chemickou strukturou většinou uvnitř řady příbuzných sloučenin. nahou je optimalizovat účinek pomocí cílených obměn struktury. ejvýznamnější používané metody jsou Hanschova a Free-Wilsonova. Rozdělovací koeficient je důležitou veličinou nejen při hledání žádaného účinku, ale i při posuzování bezpečnosti látek s možnou biologickou aktivitou. Vystupňování účinku zvýšením lipofility totiž přináší riziko větší zátěže metabolického systému, zpomaleného vylučování a tím následně kumulace látky v organismu. Z tohoto hlediska jsou bezpečnější léčiva s dostatečným účinkem při co nejnižší hodnotě log P. aopak vyšší rozpustnost léčiva ve vodě má zpravidla za následek nejen rychlé vstřebávání, ale i vylučování, což se projevuje krátkodobým účinkem (Hartl, Palát 1998). 25
4. EXPERIMETÁLÍ ČÁT Experimenty reprezentují screeningovou metodu, na výsledky proto, z hlediska reálné antifungální aktivity, musíme nahlížet jen jako na orientační. Pro kvalitnější posouzení antifungální aktivity testovaných látek by byly nutné mnohé další testy, především na rozsáhlejších souborech houbových kmenů a za modifikovaných podmínek, aby se simulovaly situace, které mohou nastat v lidském organismu. V další fázi by pak musely proběhnout také testy toxikologické a stabilitní. evíme, zda se látka v průběhu kultivace nerozkládá či nemodifikuje. Důležité by také bylo stanovení farmakokinetických vlastností léčiva (absorpce, distribuce, metabolismus, exkrece). ásledoval by také vývoj vhodné lékové formy. Pro stanovení aktivity potenciálně antifungálních látek byl používán mikrodiluční bujónový test, to znamená, že se medium s testovanými látkami rozplňuje do mikrotitrační destičky. ámi použitá metoda vychází z mezinárodního standardu M-27A, ve kterém je specifikováno použití média RPMI pufrovaného pomocí MP na ph 7,0, standardizované inokulum a vizuální určení MIC po 48-hodinové inkubaci při teplotě 35 C. Tento standard byl vypracován mezinárodní skupinou ational Commitee for Clinical Laboratory tandards (dnes Clinical Laboratory tandard Institute). 4.1 Příprava pokusu ejprve je nutné připravit si média, suspenze kmenů hub, kterými budeme inokulovat, a převést dodané testované látky do roztoku dané koncentrace, pak teprve můžeme přistoupit k vlastnímu provedení experimentu. 4.1.1 Příprava médií K provedení pokusu jsme používali dva druhy médií: abouraudův glukózový agar a tkáňové médium RPMI 1640 s glutaminem. abouraudův glukózový agar (GA) je tuhá půda, kterou jsme používali pro pěstování testovacích kmenů hub. kládá se z glukózy (námi použitá je od dodavatele Lachema), neopeptonu (od firmy Difco) a destilované vody. Postup přípravy je poměrně jednoduchý. mísí se 20,0 g glukózy, 10,0 g neopeptonu a 1000,0 ml vody, směs se rozvaří a sterilizuje v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 C. Tkáňové médium RPMI 1640 s glutaminem jsme používali při vlastním pokusu jako tekutou půdu pro kultivaci testovacích kmenů hub v prostředí s antifungální látkou. Médium 26