UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE (tvrdé desky obal) Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie RIGORÓZNÍ PRÁCE Mgr. Lucia Rambousková Hradec Králové 2016
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Ovlivnění kontrakce močového měchýře reaktivátory acetylcholinesterasy Rigorózní práce Vedoucí rigorózní práce: PharmDr. Marie Vopršálová, CSc. Školitel specialista: npor. PharmDr. Vendula Šepsová, Ph.D. Hradec Králové 2016 Mgr. Lucia Rambousková
Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Tato práce nebyla použita k získání jiného či stejného titulu. V Hradci Králové -------------------------------------- Podpis autora
Poděkování Velmi ráda bych poděkovala konzultantce mé práce npor. PharmDr. Vendule Šepsové, Ph. D. za odborné vedení v laboratoři, konzultace a pomoc v průběhu celé realizaci mé rigorózní práce. Dále bych ráda poděkovala také vedoucí mojí práce PharmDr. Marii Vopršálové, CSc. Mé díky patří i všem zaměstnancům Katedry toxikologie a vojenské farmakologie Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Brně za to, že mi umožnili realizovat tuto práci a také mé rodině, která mně velmi podporovala. Mgr. Lucia Rambousková
ABSTRAKT Kandidát: Mgr. Lucia Rambousková Název rigorózní práce: Ovlivnění kontrakce močového měchýře reaktivátory acetylcholinesterasy Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Vedoucí práce: PharmDr. Marie Vopršálová, CSc. Školitel specialista: npor. PharmDr. Vendula Šepsová, Ph.D Hlavním mechanismem účinku reaktivátorů acetylcholiesterasy (AChE) je vytěsnění organofosfátů z vazby enzymu a tím obnovení jeho funkce. Bylo zjištěno, že oximy vykazují také vlastní antinikotinový a antimuskarinový účinek na cholinergních receptorech. Ve většině těchto případů tímto účinkem přispívají k zabránění nadměrné stimulaci receptorů nahromaděným acetylcholinem. Cílem této práce bylo zhodnotit účinek reaktivátorů K 203 a K 027 na kontrakci hladké svaloviny močového měchýře prostřednictvím muskarinových a purinergních receptorů. K testování byly použity izolované stripy močového měchýře v orgánové lázni. Byly použity tři typy stimulace elektrický proud (EFS), agonista muskarinových receptorů metacholin (MCh) a agonista purinergních receptorů adenosintrifosfát (ATP). Bylo zjištěno, že látka K 027 měla tendenci kontrakci snižovat (při stimulaci EFS a MCh) a zvyšovat při stimulaci ATP. Odpovědi oximu K 203 nebyly statisticky významné. Jen při nižších frekvencích EFS stimulace docházelo ke zvýšení odpovědi. Můžeme předpokládat vyrovnané parasympatomimetické a parasympatolytické působení testovaných látek mechanismem inhibice presynaptických M 2 /M 4 receptorů nebo inhibice acetylcholinesterasy.
ABSTRACT Candidate: Mgr. Lucia Rambousková Title of thesis: The effect of acetylcholinesterase reactivators on urinary bladder contraction Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Supervisor: PharmDr. Marie Vopršálová, CSc. Consultant specialist: npor. PharmDr. Vendula Šepsová, Ph.D Acetylcholinesterase (AChE) reactivators major mechanism is attributed to their ability to reactivate phosporylated enzyme, AChE. It has been thought that oxime might have additional direct pharmacological effect, other than AChE reactivation. The oximes may exert effects by interaction with cholinergic receptors. The most of them have antiniconitic or antimuscarinic properties, thus they protect against higher concentration of acetylcholine. The aim of this study was to evaluate the effect of reactivators K 203 and K 027. A contraction study on the rat urinary bladder has been chosen to investigate effect on muscarinic and purinergic receptors. Isolated strips of urinary bladder in the organ bath were used. There were three types of stimulation electric stimulation (EFS), muscarinic receptor agonist methacholine (MCh) and purinergic receptor agonist adenosine triphosphate (ATP). In conclusion oxime K 027 has tendency to reduce the contraction (during EFS and MCh stimulation), however it increased contraction during ATP stimulation. Oxime K 203 response were not statistically significant. Only in low frequency EFS stimulation were the responses increased. This might be due to inhibition of M 2 /M 4 presynaptic receptors or AChE inhibition.
OBSAH 1. Seznam použitých zkratek... 1 2. Úvod a cíl práce......2 3. Teoretická část. 4 3.1. Anatomie a fyziologická funkce močového měchýře...4 3.1.1 Anatomie močového měchýře....4 3.1.2 Inervace dolních cest močových....6 3.1.3 Cholinerní (acetylcholinové) receptory.. 8 3.1.3.1 Nikotinové receptory (nachr).. 8 3.1.3.2 Muskarinové receptory (machr).. 9 3.1.4 Purinergní receptory.. 11 3.1.5 Receptory močového měchýře..13 3.1.6 Fyziologie mikce...14 3.2 Nejčastější nemoci močového měchýře...16 3.2.1 Hyperaktivní močový měchýř (močová inkontinence).16 3.2.2 Poruchy vyprazdňování (retence moči)..20 3.3 Cholinergní systém....21 3.3.1 Acetylcholin.21 3.3.2 Acetylcholinesterasa (AChE).22 3.3.3 Inhibitory acetylcholinesterasy (AChEI) 24 3.3.3.1 Krátkodobé, reverzibilní AChEI..26 3.3.3.2 Dlouhodobé, ireverzibilní AChEI 27 3.3.3.3 AChEI jako insekticidy.. 28 3.3.3.4 Nervově paralytické látky (NPL)...29
3.3.4 Profylaxe a terapie otrav AChEI..30 3.4 Reaktivátory acetylcholinesterasy.32 3.4.1 Struktura oximů.32 3.4.2 Mechanismus účinku oximů.35 3.4.3 Anticholinergní účinky reaktivátorů AChE..37 4. Experimentální část.39 4.1 Princip použité metody 39 4.2 Příprava základních roztoků.. 40 4.3 Princip měření kontrakce močového měchýře... 42 4.3.1 Postup měření 44 4.4 Zpracování výsledků 46 5. Výsledky.. 47 5.1. Odpovědi vyvolané EFS. 48 5.2 Odpovědi vyvolané MeCh..51 5.3 Odpovědi vyvolané ATP 54 6. Diskuse.. 57 7. Závěr.. 63 8. Seznam tabulek.. 64 9. Seznam obrázků..65 10. Použitá literatura 66
1. Seznam použitých zkratek Acetyl-CoA AČR ACh AChE AChEI ATP BuChE ChAT CNS EFS HEB ICS machr MeCh MM nachr NPL OAB OF acetylkoenzym A Armáda České republiky acetylcholin acetylcholinesterasa inhibitory acetylcholinesterasy adenosin 5 - trifosfát butyrylcholinesterasa cholinacetyltransferasa centrální nervová soustava stimulace elektrickým proudem hematoencefalická bariéra Mezinárodní společnost pro močovou kontinenci muskarinové receptory metacholin močový měchýř nikotinové receptory nervově paralytické látky hyperaktivní močový měchýř organofosfáty
2. Úvod a cíl práce Acetylcholinesterasa je enzym ze skupiny serinových hydroláz, který má životně důležitou úlohu v přenosu nervového vzruchu na cholinergních receptorech. Hydrolyzuje neuromediátor acetylcholin uvolněný z nervových zakončení, čím ukončuje jeho působení přenos signálu. V močovém měchýři savců se vyskytují muskarinové receptory typu M 2 a M 3. Po navázání ACh na tyto receptory dochází k jejich stimulaci, která způsobuje kontrakci hladké svaloviny detrusoru. Tato kontrakce společně s dalšími mechanismy vede k vyvolání mikce. V oblasti uretrálního sfinkteru jsou lokalizovány nikotinové receptory, a jejich podráždění vede k jeho relaxaci. Patologické ovlivnění cholinergní transmise na úrovni močového měchýře má za následek poruchy mikce retenci moči pokud jsou receptory blokované nebo naopak inkontinenci pokud je stimulace nadměrná. V močovém měchýři byla popsána řada dalších receptorů podílejících se na mikci. Například purinergní receptory, vyskytující se především v aferentních nervech stěny močového měchýře odpovídají na působení ATP kontrakcí. Organofosfátové sloučeniny jsou látky, které zasahují do cholinergního nervového systému cestou snížení aktivity AChE její inhibicí. Tyto látky našly uplatnění v medicíně (terapie demencí, myasthenie gravis, atonie močového měchýře), zemědělství (insekticidy), průmyslu (hydraulické kapaliny) a jako potenciální vysoce toxické bojové otravné látky (nervově paralytické látky sarin, soman, tabun). Po zablokování účinku AChE nemůže dojít k degradaci acetylcholinu. Ten se pak hromadí v synaptické štěrbině, což způsobuje dlouhodobé a nadměrné dráždění cholinergních receptorů. Klinickými projevy tohoto dráždění jsou muskarinové, nikotinové a centrální klinické příznaky. Účinky inhibitorů AChE lze podle délky působení rozdělit na reverzibilní a ireverzibilní. Reverzibilní inhibitory se uplatňují v medicíně, ireverzibilní inhibitory mají význam toxikologický insekticidy, bojové chemické látky. 2
Při akutních intoxikacích organizmu ireverzibilními inhibitory je spontánní reaktivace AChE velmi pomalá, stejně jako syntéza AChE de novo. Reaktivaci je možné urychlit látkami, které se nazývají reaktivátory. Reaktivátory AChE vytěsněním inhibitoru z vazby obnovují její fyziologickou funkci. Mezi nejznámější reaktivátory AChE patří oximy odvozené od pyridinu - pralidoxim, obidoxim, a methoxim. Bylo zjištěno, že kromě již zmíněné reaktivace AChE vykazují oximy také účinky na muskarinové a nikotinové receptory. Tento vedlejší mechanismus působení může hrát důležitou roli v léčbě intoxikací organofosfáty. Cílem této rigorózní práce bylo zjistit ovlivnění kontraktility hladké svaloviny močového měchýře vybranými reaktivátory AChE. Úkolem bylo zjistit účinek dvou reaktivátorů K 203 a K 027 na muskarinové a purinergní receptory přítomné v močovém měchýři. Snahou bylo také objasnit, jakým mechanismem tyto reaktivátory ovlivňují cholinergní procesy. 3
3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Anatomie a fyziologická funkce močového měchýře 3.1.1. Anatomie močového měchýře Močový měchýř (MM) (Obr. 1) je dutý svalový orgán uložený v malé pánvi. Jeho kapacita je asi 400-600 ml. Stěnu močového měchýře tvoří sliznice, podslizniční vazivo a svalovina. Svalovina (m.detrusor vesicae) je uspořádána do tří vrstev. Ve vnitřní a vnější vrstvě probíhají svalová vlákna podélně, zatím co ve střední vrstvě jsou svalová vlákna orientována příčně. Na spodině močového měchýře leží tzv. trigonum, které je vymezeno vnitřním ústím močové trubice a oběma ústími močovodů. Není zde vyvinuto podslizniční vazivo. Kontrakcí detrusoru v mikční fázi dochází k mikci a vyprázdnění močového měchýře. Obrázek č. 1: Močový měchýř muže Upraveno podle: http://baodaklak.vn/channel/3490/201210/tieu-tien-thuong-xuyendau-hieu-cua-nhieu-loai-benh-2196422/ 4
U mužů tvoří střední cirkulární vrstva hladké svaloviny preprostatický sfinkter a distálněji splývá s prostatou a prostatickým pouzdrem. Hlavním úkolem tohoto sfinkteru je zabraňovat svou kontrakcí retrográdní ejakulaci. U žen je hladká svalovina orientovaná spíše šikmo a podélně a přechází do stěny močové trubice, kde se pravděpodobně podílí na udržení kontinence (Kawaciuk, 2000). Močový epitel (urotel) je typ vrstevnatého přechodného epitelu, který vystýlá vylučovací cesty vedoucí z ledvin (obr. 2) (Junquiera,1997). Obrázek č. 2: Močový epitel Převzato z: http://www.mh-hannover.de19193.html Skládá se ze tří základních buněčných vrstev. Vrstva bazální je vrstvou zárodečnou (o průměru 5-10 μm), nad ní je střední vrstva, která má kolem 20 μm. Povrch urotelu tvoří vrstva krycích buněk. Jsou to největší epiteliální buňky v těle, měří 100 200 μm a mají schopnost se smršťovat a natahovat podle náplně močového měchýře. Povrchové buňky obaluje membrána, na níž lze pozorovat tenčí části, tzv. plaky, a části širší. V placích jsou ukotvena aktinová filamenta. V nenaplněných močových cestách se membrána řasí a její širší části vystupují směrem do lumina, což umožňuje zvětšení močového měchýře při jeho naplnění. Membrána obsahuje fosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin a cerebrosidy. Díky svému složení je odolná vůči působení detergentů. Sliznice měchýře produkuje tzv. vnitřní faktor, který má antibakteriální účinky. 5
Sfinkterový mechanismus měchýřového hrdla tvoří svěrač vnitřní (lisosfinkter) a vnější (rhabdosfinkter), který je pravděpodobně odpovědný za kontinenci (Trávníčková, 1996). Jeho buňky jsou přeplněné mitochondriemi a tukovými kapénkami, což je typický mikroskopický vzhled pro vlákna schopných udržet tonus po dlouhou dobu. 3.1.2. Inervace dolních cest močových Nervová kontrola dolních cest močových je komplexní a složitý děj zajišťovaný různými mechanismy na několika úrovních nervového systému. Základní inervační osa zahrnuje - šedou kůru mozkovou - mikční centrum umístněné ve Varolově mostu - sakrální mikční centrum - periferní autonomní nervy - somatické nervy Na korové kontrole mikce a kontinence se podílí zejména frontální lalok. Korová centra v zásadě zajišťují inhibici nebo aktivaci centra lokalizovaného v oblasti mozkového kmene. Toto tzv. pontinní mikční centrum hraje roli jakéhosi přepínače mezi jímací a evakuační fázi mikčního cyklu a má důležitou úlohu v procesu vzájemné synergii detrusoru a sfinkteru. Somatická inervace odstupuje ze sakrální míchy v úrovni křížových obratlů S 2 -S 4 a inervuje svaly pánevního dna cestou nervus pudendus (Hanuš, 1982). Aktivuje zevní svěrač uretry. Aferentní inervace vychází z volných zakončení aferentních axonů ve stěně měchýře. Volné nervové zakončení může odpovídat na mechanické, tepelné nebo bolestivé impulsy. 6
Sympatická nervová vlákna vycházejí z hrudní a lumbální míchy ve výši Th 10 L 2 a cestou nervus hypogastricus sestupují k plexus pelvicus a paravezikálních ganglií na obou stranách hrdla močového měchýře. Postgangliová vlákna inervují zejména oblast trigona, hrdla močového měchýře a proximální uretry. Právě v těchto strukturách se nachází největší počet alfa-adrenergních receptorů, které po podráždění svými neurotransmitery noradrenalinem a serotoninem reagují kontrakcí. Ve fundu měchýře jsou převážně beta-adrenergní receptory, jež na aktivaci reagují relaxací. Sympatikus má převážně funkci inhibiční a zajišťuje skladovací funkci měchýře. Parasympatická inervace pánve zajišťuje ovlivnění motoriky močového měchýře, čímž se uplatňuje především při jeho vyprazdňování. Parasympatická vlákna vychází ze sakrálního segmentu míchy S 2 -S 4 kde vytvářejí plexus pelvicus. Tyto pelvické parasympatické nervy v cílovém orgánu způsobí kontrakci detrusoru a relaxaci hladké svaloviny vnitřního svěrače. Postganglionické parasympatické neurony jsou krátké a nemyelinizované. Jejich zakončení vytváří neuromuskulární ploténky se svalovými buňkami detrusoru. Při uvolnění acetylcholinu na neuromuskulární ploténce dochází k jeho vazbě na muskarinové receptory buněčné membrány detrusoru, což aktivuje fosfolipasu C. Tento enzym pak zvyšuje intracelulární syntézu inositol-3-fosfatasy, jenž způsobuje uvolnění vápníku ze sarkoplazmatického retikula s následnou kontrakcí svalové buňky detrusoru. Acetylcholin se váže rovněž na nikotinové cholinergní receptory lokalizované především v oblasti uretrálního sfinkteru, a jejich podráždění vede k relaxaci. Při aktivaci parasympatiku dochází také k uvolnění oxidu dusnatého. Oxid dusnatý vzniká společně s L-citrullinem z L-argininu působením enzymu NO-syntasy, která byla identifikována v parasympatických gangliích. Oxid dusnatý aktivuje enzym guanylátcyklasu, čím dochází ke zvýšení koncentrace cgmp v buňce a následné relaxaci detrusoru. Studie prokázali, že účinek NO na hladkou svalovinu svěrače močového měchýře nemá zásadní význam a jeho aktivita se uplatňuje spíš v relaxaci sfinkteru močové trubice, čím se podílí na regulaci mikce (Mamas, 2003), jak je uvedeno níže. 7
3.1.3 Cholinergní (acetylcholinové) receptory Rozlišujeme dva základní typy cholnergních receptorů nikotinové a muskarinové. Jejich označení je odvozeno od látek, které je aktivují. 3.1.3.1 Nikotinové receptory (nachr) Jsou součástí nadrodiny iontových kanálů otevíraných ligandem, kam patří také kanály aktivované glutamátem (NMDA a AMPA receptory), serotoninové receptory, kanály aktivované glycinem či extracelulárním ATP. Přirozeným neurotransmiterem pro nachr je acetylcholin (ACh). ACh je syntetizován v cytoplazmě neuronů z Acetylkoenzymu A a cholinu velmi specifickým enzymem cholinacetyltranferasou (ChAT, 2.3.1.6). V parasympatických nervových zakončeních je skladován především ve vezikulách, které vznikají vchlípením presynaptické membrány. Akční potenciál, který dosáhne nervového zakončení, iniciuje vstup iontů vápníku do cytoplazmy nervového zakončení napěťově řízenými kalciovými kanály. Vápníkové ionty aktivují splynutí membrány vezikul se synaptickou membránou, což vede k synchronizovanému vylití obsahu vezikul do synaptické štěrbiny. ACh uvolněný akčním potenciálem reaguje s nikotinovým receptorem na postsynaptické membráně tak, že dvě molekuly ACh se navážou na dvě podjednotky α, čím dochází ke změnám konformace, otevření kanálu a vstupu kationtů sodíku a draslíku do buňky. Prostup Na + iontů do buňky způsobí depolarizaci nervosvalové ploténky, a tím v její okolí vyvolá akční potenciál, který se pak šíří dále. Molekula ACh se uvolňuje a prostřednictvím acetylcholinesterasy (AChE, 3.1.1.7.) se rozkládá v průběhu několika málo milisekund na cholin a acetát. Rozlišujeme dva typy nikotinových receptorů muskulární (svalové) a neuronální. Oba typy se skládají z pěti glykoproteinových podjednotek. Muskulární typ receptoru se skládá z dvou podjednotek α1, dále β1, γ, δ (ε) (Role & Berg, 1996). U neuronálního typu jsou možné kombinace z devíti typů podjednotky α (α 2 α 10 ). Vyskytuje se i více typů podjednotek β (β 2 - β 4 ) (Jürgensen & Ferreira, 2010). Každou jednotlivou podjednotku tvoří proteinové vlákno, které ve formě alfa šroubovice čtyřkrát prochází membránou. 8
ACh může aktivovat nachr i na presynaptických neuronech. V tomto případě dochází opět přes kationty vápníků k uvolnění dalšího ACh ze synaptické štěrbiny. Obrázek č. 3: Nikotinový receptor Upraveno podle: http://inqu.uprm.edu/blog/news/268 3.1.3.2 Muskarinové receptory U savců bylo doposud izolováno 5 subtypů muskarinových receptorů (M 1 -M 5 ), přičemž každý z typů je kódován jiným genem (Jones, 1993). Všechny subtypy patří do skupiny transmembránových receptorů vázaných na G protein, jsou však strukturně i farmakologicky odlišné. Receptorový protein představuje peptidový řetězec, který ve formě alfa šroubovice (α-helixu), sedmkrát prochází fosfolipidovou vrstvou buněčné membrány. Extracelulárně se nachází N-konec a tři kličky, intracelulárně se vyskytují taky tři kličky a C-konec. Právě třetí intracelulární klička receptoru zasahující do cytoplasmy interaguje s G-proteinem. Na rozdíl od nikotinových receptorů, patří muskarinové receptory do velké skupiny receptorů spojených s efektorem pomocí proteinu, který váže guanylnukleotid, 9
tzv. G-regulační protein. Podle typu G-receptoru dochází buď k aktivaci, nebo inhibici efektoru. Receptory typu M 1, M 3 a M 5 aktivují protein G q/1 a stimulací fosfolipasy C nebo fosfolipasy D vedou ke vzniku nitrobuněčných poslů inositol-1,4,5-trifosfátu (IP 3 ) a diacylglycerolu (DAG) (Obr. 4). IP 3 mobilizuje vápníkové ionty z nitrobuněčných zásob, zatímco DAG aktivuje proteinkinasu C (PKC). Receptory M 2 a M 4 prostřednictvím G-inhibičního proteinu (G i/0 ) snižují aktivitu adenylátcyklasy, inhibují kalciový kanál a tímto mechanismem dochází k inhibičním účinkům acetylcholinu v tkáních (negativně inotropní a chronotropní působení na srdce). Kromě postsynaptických M receptorů působí ACh i na receptory presynaptické, např. na zakončení parasympatiku snižuje stimulace presynaptických M 2 receptorů výdej ACh z nervového zakončení. Receptory M 1 (neuronální) jsou nejrozšířenějším subtypem vyskytujícím se v CNS (mozková kůra, hipokamp, mozkový kmen). Na periferii byly popsané v různých typech žláz, např. parietálních buňkách žaludku, kde stimulací receptorů dochází ke zvýšení sekrece HCl v žaludku. Přítomny jsou také v cévním endotelu. Receptory M 2 (kardiální) se vyskytují především v srdci, kde jejich aktivace způsobí bradykardii. V hladké svalovině žaludku, trachey a močového měchýře navozují společně s M 3 receptory kontrakci. Receptory M 3 se vyskytují především v žlázách a hladkých svalech zažívacího, vylučovacího a dýchacího systému, kde jejich aktivací dochází ke kontrakci hladké svaloviny, dále pak jsou zodpovědné za kontrakci cirkulární svaloviny v oku a kontrakci cév kosterních svalů. Receptory M 4 jsou presynaptické autoreceptory pro acetylcholin. Jsou hodně zastoupené především ve striatu. Aktivace těchto receptorů inhibuje uvolnění acetylcholinu a ovlivňuje také dopaminergní transmisi (Tzavara, 2004). 10
Receptory M 5 jsou nejmíň prozkoumané muskarinové receptory. Byly popsané v CNS (Weiner, 1990), hladké svalovině jícnu (Preiksaitis, 2000) a v srdeční tkáni (Wang, 2001). Experimentálně bylo zjištěno, že aktivace těchto receptorů snižuje hladinu camp (Yamada, 2003) a inhibuje účinek proteinkinasy A. Jejich aktivace vede pravděpodobně ke zvýšení sekreci kyseliny chlorovodíkové v žaludku (Aihara, 2005). Obrázek č. 4 : Aktivace proteinu G q/1 receptory typu M 1, M 3 a M 5. Po navázání agonistu na M 1, M 3 nebo M 5 receptor dochází k aktivaci G-stimulačního proteinu a spuštění signalizační kaskády druhých poslů prostřednictvím fosfolipasy C. To má za následek otevření draslíkového kanálu a šíření nervového impulsu. Upraveno podle: https://www.cnsforum.com/educationalresources/imagebank/ dementia_ cholinergic/rcpt_sys_mus_ag 3.1.4 Purinergní receptory Purinergní neboli purinové receptory tvoří relativně velkou a různorodou skupinu proteinů, které k signalizaci využívají extracelulární nukleotidy (ATP, UTP a produkty jejich degradace: ADP, UDP a adenosin). Dělí se do dvou hlavních podskupin, označovaných jako P1 adenosinové a P2 nukleotidové receptory (Fredholm, 2001). 11
Jejich přítomnost byla popsána v CNS (korová centra, hipokamp, mozeček, mícha) (Kanjhan, 1999), v hladké svalovině (močový měchýř, cévy), v intersticiálních a gliových buňkách. P1 receptory jsou spřaženy s G-proteinem. Rozlišujeme subtypy A 1, A 2A, A 2B a A 3. Zatím co receptory A 1 a A 3 patří do rodiny G i/0 -proteinů, které inhibují tvorbu cyklického adenosinmonofosfátu (camp), subtypy A 2A a A 2B prostřednictvím G s - proteinu tvorbu camp zvyšují. Jsou složeny ze sedmi transmembránových domén, přičemž N-konec směřuje do extracelulárního prostoru, C-konec do intracelulárního prostoru (Fields, 2006). Subtyp A 1 je nejrozšířenější v mozku a kardiovaskulárním systému. Receptory A 2A se vyskytují v oblastech mozku s dopaminergní inervací (striatum, čichový lalok). Receptory A 2B jsou přítomny v celém lidském těle, ale jejich exprese v mozku a páteřní míše je nízká. Subtyp A 3 nalézáme ve velké míře v plicích, játrech, ledvinách a přítomen je také v mozku. P2 receptory zahrnují dvě rodiny zástupců: metabotropní P2Y receptory spřažené s G-proteiny a ionotropní P2X receptory, které jsou ligandem ovládané iontové kanály. Nervový systém savců exprimuje sedm typů P2Y receptorů (P2Y 1 7 ) a osm typů P2X receptorů (P2X 1, 2, 4 6, 11-14 ) (Abracchio,2009). P2X receptory jsou kationtové kanály aktivované ATP a jeho analogy, např. nikotinamidadenindinukleotidem (NAD+) nebo adenosin-5-difosfát ribosou (ADPR) (Westfall, 1997). Aktivace P2X receptorů vede k rychlým tokům Na +, K + a Ca 2+ a tím k depolarizaci buňky. Každá podjednotka má dvě hydrofobní transmembránové domény (TM1 a TM2) navzájem oddělené extracelulární smyčkou - ektodoménou. Ektodoména obsahuje deset konzervovaných zbytků cysteinu, které mohou tvořit disulfidické vazby a přispívat k tvorbě terciární struktury receptoru (Ennion, 2002). Hrají důležitou roli v kontrole buněčných funkcí, jako jsou neurotransmise, sekrece hormonů, regulace transkripce a proteosyntéza (Chen,1995). P2Y receptory spřažené s G-proteinem se rozdělují na P2Y 1,2,4,6 a 11 receptory, které jsou primárně spřaženy s G q/g11 proteinem a cestou aktivace fospolipasy C, přes IP 3 dochází k uvolnění vápníkových iontů do cytoplasmy. P2Y 11 receptor je kromě toho spřažen s G s proteinem, což vede k aktivaci adenylycyklasové aktivity a tím ke zvýšení 12
koncentrace cyklického adenosinmonofosfatu (camp). P2Y 12, 13 a 14 jsou spřaženy s G i/0 proteinem a adenylátcyklasu inhibují (Abracchio,2006). Vyskytují se v endoteliálních buňkách, v hepatocytech, v pankreatických β-buňkách jsou zapojeny do sekrece insulinu, dále se podílejí na myelinizaci Schwannových buněk nebo jsou také přítomny v různých oblastech ledvin - glomeruly, tubuly a sběrné kanálky. Receptory P2Y jsou také zapojeny do signalizace endokrinních buněk a do sekrece hormonů. Mají silné zastoupení i v mozku, v presynaptických místech a v buňkách glií (Chen, 1995). 3.1.5 Receptory močového měchýře Močový měchýř savců exprimuje velké množství různých typů receptorů. Kontrakce MM je primárně závislá na aktivaci muskarinových receptorů. V buněčných membránách lidského detrusoru byly prokázány M receptory subtypu M 2 a M 3 (Hegde et al, 1997). Kontraktilitu detrusoru zajišťují M 3 receptory, byť tvoří jen asi 25% z celkového počtu (Wang, 1995). Početnější M 2 receptory pravděpodobně pouze zesilují účinek M 3 receptorů a nepřímo se na kontrakci podílejí také inhibicí účinku relaxačně působících β-adrenergních receptorů (Hedge, 1997). Muskarinové receptory se nevyskytují pouze v buňkách detrusoru, ale i v uroteliálních buňkách a v buňkách parasympatických a sympatických nervových zakončení (presynaptické muskarinové receptory). V hladké svalovině močového měchýře byla popsána také přítomnost mrna pro M 5 receptory. Jejich funkce pravděpodobně úzce souvisí s účinkem M 3 receptoru, avšak z důvodu, že dosud nebyl objevený žádný selektivní antagonista pro M 5 receptor, není možné ho odlišit od subtypu M 3 (Eglen a kol., 2000). V MM byla popsána přítomnost purinergních ionotropních receptorů P2X, které se vyznačují rychlou transmisí, a u kterých byla prokázána exprese jak na eferentních, tak zejména na aferentních nervech stěny MM, kde převládajícím subtypem jsou právě receptory P2X 1 (O Reilly, 2001). Uvolnění ATP z nervových zakončení vede ke kontrakci MM (Theobald, 1996). Kontrakce je vyvolaná krátkodobým působením ATP na P2X receptory mobilizací iontů 13
vápníku a sodíku (Benham,1987). Kromě toho ATP v MM indukuje syntézu prostaglandinů (PGE 2, PGF 2α ), která vede také ke kontrakci (Husted, 1983). ATP jako takový se obvykle recykluje vždy po své hydrolýze na ADP či AMP. Část těchto nukleotidů podléhá rozkladu na nukleosid adenosin (Schaufele, 1995). Tento metabolit ATP, který stimuluje relaxační P1 (A1) adenoreceptory, se pravděpodobně podílí na relaxaci močového měchýře (Burnstock, 1972). Močový měchýř člověka exprimuje oba typy adrenoreceptorů. Je známo, že uvolnění noradrenalinu na sympatických nervových zakončeních působí relaxaci vláken hladké svaloviny detrusoru a zároveň kontrakci vláken svěrače, což přispívá k udržení kontinence. V MM převládá subtyp α1, který se podílí na kontrakci sfinkteru u mnoha živočišných druhů (Andersson, 2007). Noradrenalin také snižuje uvolnění acetylcholinu stimulací α2 adrenergních receptorů na presynaptické membráně (Mattiasson, 1987). Za normálních okolností v měchýři převažují β-adrenergní receptory nad α- adrenergními. β-adrenergní zprostředkovávají relaxaci detrusoru během jímací fáze mikčního cyklu. Přestože byly izolovány β 1 - a β 2 - adrenergní agonisté (např. dobutamin), při jejich použití in vitro nedošlo k relaxaci vláken detrusoru. Na základě novějších studií se zdá, že za relaxaci detrusoru je zodpovědná aktivita β 3 - adrenergního receptoru (Igawa, 2001). Dalšími významnými skupinami receptorů, které se podílejí na kontrole mikčního cyklu jsou vaniloidní receptory (TRPV) (Szallasi, 1993), bradykininové receptory B1 a B2 (Rhaleb, 1991) a receptory skupin p75 (Vaidyanathan, 1998), které jsou stimulované nervovým růstovým faktorem (NGF). Významnou úlohu v regulaci kontraktility detrusoru hrají nejspíše iontové kanály, především vápníkové a draslíkové. 3.1.6 Fyziologie mikce Na počátku mikce se kontrahuje detrusor, dále pak i bránice a svaly stěny břišní, zvyšuje se intraabdominální tlak (Šottner, 2014). Uvolněním přední části m.pubococcygeus a kontrakcí jeho zadní části se otevře proximální uretra a klesá uretrovesikální junkce a baze měchýře. Relaxuje rovněž uretrální sfinkter. Následně je 14
potlačena inhibice sakrálního mikčního centra z mozkové kůry a parasympatikus cestou nervi pelvici vyvolá kontrakci detrusoru a příbuzných svalových vláken v močové trubici. Potom rychle klesá intrauretrální tlak, moč naplňuje proximální uretru, intraabdominální tlak naopak stoupá a ve chvíli, kdy se vyrovnají, začíná mikce. Během ní trvá vysoký tlak v měchýři, snižuje se napětí jeho stěny a se zkrácením svalových vláken roste efektivita kontrakce detrusoru, takže síla potřebná k mikci se snižuje. Postgangliová vlákna ve stěně měchýře uvolňují acetylcholin, který spouští kontrakci detrusoru působením na muskarinové M 3 receptory. Aktivací parasympatického nervového systému dochází i k uvolnění ATP, které působí na P 2 X purinergní receptory a jejich aktivací také způsobuje kontrakci. Pelvický plexus vede parasympatická vlákna inervující i oblast hrdla močového měchýře a uretry. Při excitaci dochází na jejich zakončení k uvolnění oxidu dusnatého, který se váže na nikotinové receptory s následnou relaxací svalových buněk ve výtokové části dolních močových cest. Tímto mechanismem dochází při podráždění parasympatiku k současné kontrakci detrusoru a relaxaci uzávěrového mechanismu (Hampel, 2004). Na konci mikce probíhá děj opačně: pánevní dno, externí a interní svěrače močové roury se kontrahují, báze měchýře se zvyšuje, tok moči je přerušen ve střední třetině uretry. Nálevkovité rozšíření uretry mizí odspodu nahoru, obsah moči v horní třetině je vypuzen zpět do měchýře a je obnovena kortikální inhibice sakrálního mikčního centra. Mikce je za normálních okolností volně iniciována, ovládána a je možné ji přerušit. V případě, že je narušen některý z regulačních mechanismů těchto dějů, dochází k poruchám mikce. Rozlišuje poruchy jímací funkce (kontinence) a poruchy vypuzovací funkce (retence moče). 15
3.2 Nejčastější nemoci močového měchýře Dolní močové cesty (močový měchýř a uretra) vykonávají dvě protichůdné činnosti. Na jedné straně jímání moči a na straně druhé její vyprazdňování. Oba tyto děje jsou navzájem inhibovány reflexními mechanizmy. U zdravých jedinců je reflex močení aktivován po zvýšení tlaku v močovém měchýři, přesáhne-li jeho objem 400 500ml. Poté nervové signály postupují míchou do mikčních center v mozku (mozková kůra, Varolův most). Pokud to okolní situace umožňuje, nastává vůlí ovladatelná série kontrakcí abdominálních svalů a svalů močového měchýře, která vede k mikci. Proud moči je konstantní a urgence na močení je v noci přirozeně potlačená. Poruchy kteréhokoliv z funkcí močového měchýře i jejich vzájemné interakce vedou k dysfunkci dolních močových cest. Klasifikace podle ICS (International Continence Society) rozděluje dysfunkce dolních močových cest na poruchy detrusoru (hyperaktivní nebo hypoaktivní detrusor) a poruchy sfinkteru (hyperaktivní nebo hypoaktivní sfinkter). Buď se jedná o poruchy jímací funkce způsobeny hyperaktivitou detrusoru nebo hypoaktivitou sfinkteru (inkontinence) nebo o poruchy funkce vyprazdňování, zapříčiněnou hypoaktivitou detrusoru nebo hyperaktivitou sfinkteru (retence moči). Obecně se tyto poruchy označují anglickou zkratkou LUTS (Lower urinary tract symptoms neboli symptomy dolních močových cest). 3.2.1 Hyperaktivní močový měchýř (močová inkontinence) Hyperaktivní močový měchýř (overactive bladder OAB) je syndrom charakterizovaný kombinací symptomů urgence, časté nucení k mikci a urgentní inkontinence jež vzniká na základě různé etiologie. V evropské populaci je prevalence OAB 17% nad 40 let věku. Ve věku nad 75 let je postiženo 31 42 % populace (Milsom, 2001). 16
Na základě různých příčin nekontrolovaného úniku moči byla inkontinence dle ICS rozdělena do několika druhů a kategorií. Stresová inkontinence únik více než 50 ml moči při náhlém zvýšení intraabdominálního tlaku, např. při kašlání, kýchaní, smíchu. Příčinou může být ochablé svalstvo pánve, věk, nedostatek estrogenu u žen atd. Urgentní inkontinence únik moči po náhlém silném nutkání na močení, vyvolaný mimovolnou kontrakcí detrusoru. Pacient není schopen zastavit močení po jeho započetí. Jedná se o nejčastější typ inkontinence ve stáří. Urgentní inkontinence se odlišuje od stresové tím, že se moč vylučuje kdykoli, nejen po námaze. Příčinou mohou být cystitidy, neurologická onemocnění, ledvinové kameny nebo nádory. Funkční inkontinence mimovolné, nepředvídatelné vyloučení moči. Definována je jako inkontinence, která přetrvává následkem fyzických anebo duševních poruch. Reflexní inkontinence mimovolné močení vyskytující se v pravidelných intervalech po dosažení určitého objemu močového měchýře. Noční inkontinence nekontrolovaný únik moči v průběhu spánku, tzv. noční pomočování. Inkontinence z přetečení každý nekontrolovaný únik moči způsobený přetečením měchýře (např. z důvodu zablokování jeho svěračů). Smíšená inkontinence nekontrolovaný únik moči při fyzické námaze, kýchání, smíchu, kašli, spojený s pocitem nutkání na močení. Inkontinence moče jako nežádoucí účinek některých léčiv Alfa-adrenergní blokátory - využívají se v léčbě mírné a střední hypertenze a periferních vazospastických onemocnění. Snižují subvezikální výtokový odpor. Samy o sobě ke vzniku inkontinence vedou jen výjimečně, preexistující stresovou inkontinenci však mohou výrazně zhoršit (Menefee, 1998). 17
ACE-inhibitory - jsou často předepisovány k léčbě všech stupňů esenciální hypertenze, renální a renovaskulární hypertenze a srdeční insuficience. Jako závažný nežádoucí účinek bývá popisován úporný suchý dráždivý kašel, který nastupuje několik dnů po zahájení léčby. Mechanizmus jeho vzniku není objasněn, u žen však může vést k manifestaci stresové inkontinence (Casanova, 1990). Myorelaxancia - mohou vést výjimečně ke vzniku nebo zhoršení preexistující inkontinence na podkladě relaxace svalového dna pánevního (Flamant, 1995). Inhibitory AChE stimulace muskarinových receptorů MM nahromaděním ACh (donepezil, galantamin, rivastigmin, intoxikace organofosfáty nebo NPL) Konzervativní léčba OAB zahrnuje kombinaci farmakoterapie a úpravy životního stylu, včetně životosprávy, zamezení příjmu látek dráždících svalovinu močového měchýře (káva, alkohol, nikotin, kořeněná jídla), redukce tělesné hmotnosti, cviky na posílení pánevního dna apod. Pro farmakologickou léčbu je k dispozici velké množství léčiv s rozdílným působením na různých cílových místech. Mezi nejvíce používané léky patří anticholinergika a tricyklická antidepresiva. Anticholinergika (antagonisté muskarinových receptorů) působí inhibici funkci detrusoru, tlumí vnímání náplně měchýře a zlepšují jímací příznaky (urgence, frekvence) a kapacitu měchýře, ale neovlivňují normální mikční funkci. Mezi nevýhody patří výskyt nežádoucích účinků (sucho v ústech, poruchy akomodace, zácpa), které jsou způsobené blokádou muskarinových receptorů mimo urogenitální trakt (oxybutinin, propiverin, trospium). Výskyt těchto nežádoucích účinků je nižší u selektivních antagonistů muskarinových receptorů, blokující M 2 a M 3 receptory močového měchýře (tolterodin, solifenacin, darifenacin) (Artibani, 2002, Berghmans, 2000). V tomto ohledu se jako slibné ukazuje také použití retardovaných forem a jiné cesty aplikace (transdermálně, intravezikálně) při zachování jejich účinnosti. Z tricyklických antidepresiv se v praxi používá imipramin. Zlepšuje jímací funkci močového měchýře a jeho účinek je výsledkem kombinace relaxačního efektu na detrusor a posílení činnosti vnitřního svěrače uretry. Jeho jasná účinnost při léčbě OAB ale není spolehlivě prokázána. 18
Z nefarmakologických metod se využívá reflexní léčba (elektrostimulace, neuromodulace) a operační metody (cystoplastiky nebo výjimečně cystektomie s vytvořením náhrady močového měchýře). Léčivá látka Léčivo Mechanizmus účinku Oxybutinin Ditropan Uroxal Antagonista M 1 /M 3 rec. Antagonista vápníku Lokálně anestetický účinek Propiverin Mictonetten Mictonorm Neselektivní antagonista muskarinových receptorů Antagonista vápníku Trospium Spasmed Kompetitivní antagonista M 1 /M 3 receptorů Nižší afinita k M 2 receptorům Tolterodin Detrusitol SR Kompetitivní antagonista M 2 /M 3 receptorů močového měchýře Solifenacin Vesicare Selektivní inhibitor M 3 receptorů MM Imipramin Melipramin Inhibitor zpětného vychytávání serotoninu a adrenalinu Neselektivní antagonsta muskarinových a H1 histaminových receptorů Tabulka č. 1: Standardně používaná léčiva OAB a jejich mechanizmus účinku 19
3.2.2 Poruchy vyprazdňování (retence moči) Poruchy vyprazdňovací funkce jsou způsobeny hypoaktivitou detrusoru nebo hyperaktivitou sfinkteru. Manifestují se jako zpomalení startu mikce, slabý a přerušovaný proud moči, nutnost tlačit při močení a pocit nedostatečného vyprázdnění MM. Souhrnně se tento stav nazývá močová retence. Poruchy vyprazdňování MM mohou mít neurogenní nebo non-neurogenní etiologii. Nejčastěji se jedná komplikaci při benigní hyperplazii prostaty, ale může být způsobena také infekcí, traumatem (poškozením míchy), cevní mozkovou příhodou, neurodegenerativním onemocněním (Parkinsonova nemoc, roztroušená skleróza) nebo jako nežádoucí účinek některých léčiv anticholinergika, sympatomimetika, blokátory kalciových kanálu, diuretika, opioidní analgetika. Anticholinergně působící léky mohou přímo blokovat muskarinové receptory detrusoru a tým ovlivňovat průběh mikce. Nejvýraznější anticholinergní efekt byl popsán u antiparkinsonik, antiemetik, antipsychotik, antidepresiv, anxiolytik, antihistaminik, antihypertenziv a dalších (Seggev, 1994). K farmakoterapii funkčních poruch detrusoru neurogenně i non-neurogenně podmíněných a k terapii i profylaxi atonie močového měchýře nebo uretry se používají cholinergně působící látky. Cholinergika agonisticky působící na muskarinových a/nebo na nikotinových receptorech zvyšují intravezikální tlak a snižují kapacitu močového měchýře (Suchopár, 2009). Díky tomu, že jejich účinek na močový měchýř není selektivní, mají řadu nežádoucích účinků jako je hypotenze, zvýšené pocení, nevolnost, zvracení, průjmy, zvýšená sekrece bronchů a možnost poruchy srdečního rytmu. Agonisté ACh karbachol kromě muskarinových receptorů částečně stimuluje i gangliové cholinergní N-receptory. Betanechol, metacholin jsou syntetické látky rezistentnější k působení AChE než karbachol. Používají se k terapii funkčních poruch detrusoru (včetně neurogenně podmíněných), k terapii a profylaxi atonie močového měchýře nebo uretry. U nás se v praxi již nepoužívají (Hynie, 1997). 20
Inhibitory AChE distigmin, neostigmin, pyridostigmin zvyšují intravezikální tlak a snižují kapacitu MM. V současné době se praxi používá pouze distigmin (Ubretid ) k terapii pooperačních atonií. 3.3 Cholinergní systém 3.3.1 Acetylcholin Acetylcholin (ACh) je neurotransmiterem všech nervosvalových plotének obratlovců, všech presynaptických neuronů v autonomním nervovém systému, stejně jako všech postgangliových neuronů parasympatiku. ACh je ester cholinu a acetátu. Je syntetizován v cytoplazmě neuronů z cholinu a acetylkoenzymu A (acetyl-coa) velmi specifickým enzymem ChAT. Acetyl-CoA vzniká v mitochondriích v axonálních zakončeních z pyruvátu. Cholin je do cytoplazmy aktivně přijímán z extracelulárního prostoru vysokoafinitním přenosovým systémem závislým na Na +. V nervových zakončeních je skladován ve vezikulách, které vznikají vchlípením presynaptické membrány. Množství uvolněného acetylcholinu je regulované množstvím kalciových iontů, které vstoupí do cytoplazmy nervového zakončení z presynaptických receptorů. Přestup iontů je iniciován akčním potenciálem. Uvolněný acetylcholin reaguje s cholinergními receptory na postsynaptické ale i presynaptické membráně cílových tkání. Molekula acetylcholinu je rychle hydrolyzována acetylcholinesterasou na acetát a cholin (rychlostí 10 4 až 10 5 molekul za sekundu). Jeho účinek je tedy velmi rychlý a krátký v porovnání s ostatními neurotransmitery. Většina cholinu je přenesena zpět do presynaptického zakončení a opět použita při syntéze ACh. 21
3.3.2 Acetylcholinesterasa Ukončení cholinergní transmise zajišťuje enzym ze skupiny serinových hydrolas acetylcholinesterasa (AChE). Monomer AChE (G1) má molekulovou hmotnost okolo 60000. Prostorovým tvarem je AChE elipsoidní molekula veliká přibližně 45 60 65 Å. Skládá se z dvanácti centrálně stočených beta skládaných listů, které jsou obklopené čtrnácti alfa helixy (Patočka, 2004). AChE patří dle enzymové nomenklatury do 3. třídy, kterou představují hydrolázy. Má enzymové číslo EC 3. 1. 1. 7. Obrázek č. 5: Struktura acetylcholinesterasy Hydrolyzuje především acetylcholin (obr. 6) uvolněný nervovou stimulací do synaptické štěrbiny, a uvnitř nervových zakončení odpovídá za rozklad cytoplazmatického ACh. AChE se skládá z několika hlavních domén: aktivního centra, aromatické štěrbiny a periferního anionického místa. Aromatická štěrbina je lemována čtrnácti aromatickými zbytky, které tvoří cca 70 % povrchu štěrbiny (Silman, 2008). Aromatické zbytky hrají velmi důležitou roli ve stabilizaci celého komplexu díky elektrostatickým a hydrofobním interakcím se substrátem. Ve spodní části štěrbiny se nachází aktivní centrum (Patočka, 2004). Aktivní centrum AChE je lokalizováno ve středu molekuly enzymu. Skládá se z pěti vazebních míst. 22
1. Tzv. katalytická triáda, tvořená aminokyseliny Ser200, His440 a Glu327 představující esteratické místo. V této části dochází k rozpoznání a navázání ACh. Serin je v průběhu hydrolýzy ACh acetylován. 2. Oxyanionová díra, která je součást esteratického místa se skládá ze dvou glycinů a alaninu, jejichž úkolem je stabilizace navázané acetylové skupiny. 3. Hydrofóbní oblast obklopující esteratické místo, označuje se také jako acetylové místo enzymu, se skládá se ze dvou molekul fenylalaninu. Na toto místo se váže acetylová skupina ACh. 4. Anionické místo (cholin-vázající, aromatické místo) je negativně nabité. Tato část je tvořena aminokyselinami Trp80, Phe330 a Phe331. Na anionickou část se váže kvartérní skupina acetylcholinu a tím dochází ke správné prostorové orientaci acetylcholinu. 5. Okrajové místo aktivního centra slouží jako místo, kde se selektivně váží arylové substráty (Patočka 2004, Giacobini, 2000, Štepánková, 2008). Obrázek č. 6: Schematické znázornění hydrolýzy acetylcholinu AChE Převzato a upraveno z: http://www.proteopedia.org/wiki/index.php/ Human_Acetylcholinesterase 23
Velmi rychlé ukončení účinku ACh je životně důležité. Při nedostatečném rozkladu hrozí kumulace ACh a akutní cholinergní krize (Lincová, 2002). Strukturálně i funkčně podobná butyrylcholinesterasa (BuChE, EC 3. 1. 1. 8.) se liší především v substrátové specifitě a citlivosti vůči inhibitorům (Tőugu, 2001 ). Je též známá jako pseudocholinesterasa a vyskytuje se zejména v krevní plazmě, játrech, ledvinách a v srdci (Barnard, 1974). Hydrolyzuje butyrylcholin, ale také se podílí na hydrolýze ACh. Vazba organofosfátů na tuto esterasu nevyvolává na rozdíl od inhibice AChE žádné klinické příznaky intoxikace. Působí tedy jako vychytávač (scavenger) organofosfátů, které vstoupily do vnitřního prostředí intoxikovaného organizmu (Patočka, 2004b). Literatura uvádí profylaktické použití různých druhů cholinesteras (AChE, BuChE). Jeví se jako velmi efektivní bioscavengery a bez nežádoucích účinků (Bajgar, 2005). 3.3.3 Inhibitory acetylcholiesterasy (AChEI) K inhibici AChE může dojít působením celé řady látek přírodního nebo syntetického původu. Jednotlivé AChEI se liší chemickou strukturou a fyzikálněchemickými vlastnostmi. Na fyzikálně-chemických vlastnostech závisí schopnost látek pronikat membránami (např. schopnost prostupovat do CNS). Na chemické struktuře inhibitoru a jím vyvolané chemické reakce závisí trvání jeho účinku a s chemickou strukturou souvisí i schopnost některých inhibitorů přímo stimulovat určitý typ cholinergních receptorů. Podle chemické struktury ACHEI rozdělujeme na: 1. Jednoduché primární alkoholy s kvarterním dusíkem (edrofonium) 2. Estery kyseliny karbamové s alkoholy, tzv. karbamáty (s terciálním nebo kvarterním dusíkem, např. fyzostigmin, neostigmin) 3. Organické sloučeniny kyseliny fosforečné (organofosfáty, např. paraoxon) Na základě mechanizmu účinku rozdělujeme AChEI na dvě skupiny látek. První z nich tvoří tzv. reverzibilní inhibitory, které vytváří s enzymem slabší reverzibilní 24
interakce (donepezil, pyridostigmin, huperzin A, galantamin, takrin). Některé z nich slouží jako léčiva závažných onemocnění jako je Alzheimerova choroba či myasthenia gravis. Tyto látky inhibují AChE krátkodobě. Druhou skupinou jsou tzv. ireverzibilní inhibitory. Mezi tyto inhibitory patří organofosfátové sloučeniny, které se v molekule AChE vážou silnou kovalentní vazbou na OH skupinu serinu. Inhibice enzymu může probíhat jak na aniontovém, tak i na aktivním centru enzymu, nebo na obou místech zároveň. Princip účinku všech inhibitorů je stejný, avšak jednotlivé AChEI se rozlišují na základě rychlosti uvolňování (deacylaci) enzymu. Organofosfáty reagují pouze s aktivním místem enzymu. Tyto látky fosforylují či fosfonylují hydroxyskupinu serinu v esteratické části enzymu. Stabilní kovalentní konjugáty mohou být následně hydrolyzovány (spontánní reaktivace) nebo dealkylovány (stárnutí enzymu; aging) (obr č. 7.) Právě proto, že spontánní reaktivace inhibovaného enzymu je pomalá a v případě stárnutí k ní dokonce prakticky nedochází, hovoříme o těchto látkách jako o ireverzibilních inhibitorech AChE (Patočka, Kuča, Jun 2004). Obrázek č. 7: Inhibice, spontánní reaktivace a stárnutí AChE (Weisner, 2005) Organofosfáty se využívají jako insekticidy, v průmyslu jako změkčovadla, hydraulické kapaliny nebo látky pro nehořlavé úpravy (inhibitory hoření, těžko vznětlivé tlakové kapaliny apod). Díky své struktuře se do skupiny organofosfátových inhibitorů řadí také nervově paralytické látky (NPL), které jsou nejvýznamnější skupinou bojových chemických látek (Bajgar, 1985). 25
3.3.3.1 Krátkodobé, reverzibilní AChEI Svou strukturou se více či vzdáleně podobají ACh. Jsou to estery, které mají ve své molekule kvarterní (většina) či terciální dusík. Látky s kvarterním dusíkem mají zesílený účinek na nervosvalovém spojení (význam při léčbě myasthenie gravis). Látky s terciálním dusíkem lépe pronikají hematoencefalickou bariérou (HEB) a mají tedy účinky centrální. Při dlouhodobé stimulaci centrální nervové soustavy (CNS), mohou být účinky vystupňovány až ke křečím a následně útlumu CNS s bezvědomím, selháním dechu aj. Všechny tyto látky obsahují ve své molekule skupinu karbamové kyseliny. Chemicky se jedná o estery kyseliny karbaminové nebo karbamidové. Primární kontakt nastává vždy mezi kationickým dusíkem a anionickým centrem enzymu. V průběhu hydrolytické reakce se kyselá skupina esteru kovalentně váže na AChE. Esterasa se při hydrolýze ACh acetyluje, stejným mechanizmem při hydrolýze inhibitoru přijímá karbaminovou skupinu. Teprve po ztrátě navázané kyselé skupiny je AChE opět schopna další funkce. Potřebný interval je po navázání karbaminové skupiny podstatně delší (hodiny, minuty) než po acetylaci (milisekundy). Proto karbamáty snižují aktivitu enzymu, vážou se jako falešné substráty a snižují tak obrat ACh. Obecně lze konstatovat, že toxicita pro necílové organismy je vyšší než u organofosfátů, protože látky nevyžadují metabolickou aktivaci. Ústup otravy je rychlejší kvůli rychlejší regeneraci karbamylované AChE. Krátkodobé AChEI se užívají k prevenci a léčbě pooperačních atonií trávicího ústrojí a močových cest (distigmin), k vyvolání miózy a snížení nitroočního tlaku při glaukomu (fysostigmin), jako antidota periferních kompetitivních myorelaxancií, k léčbě myasthenia gravis (neostigmin, pyridostigmin). Látky s centrálním účinkem (např. rivastigmin, donepezil, galantamin) jsou využívané k symptomatické léčbě u mírných a středně těžkých forem Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby a některých dalších typů demencí. Karbamáty se používají také jako insekticidy (karbofuran, karbaryl, pirimicarb). 26
3.3.3.2 Dlouhodobé, ireverzibilní AChEI Pro svou vysokou toxicitu se terapeuticky nevyužívají, mají však význam toxikologický. Patří sem dvě hlavní skupiny látek. Insekticidy, které se v civilním sektoru uplatňují především v zemědělství a vysoce toxické NPL se smrtícím účinkem, které můžou být použity k bojovému nasazení proti živým organizmům a jsou často předmětem teroristického zneužití. Organofosfáty mají vysokou lipofilitu, velmi snadno se vstřebávají a pronikají všemi branami vstupu (inhalace, ingesce) včetně neporušené kůže, tzv. kontaktní jedy (Kassa, 2003). Pro velmi pevnou vazbu na molekulu AChE přetrvává jejich účinek dlouhodobě (dny, týdny) a mohou se objevit i pozdní, zejména neurotoxické komplikace vyplývající z důsledku inhibice AChE (polyneuritidy, demyelinizace, aj.) V klinickém obrazu akutní intoxikace dominují příznaky způsobené nadměrnou stimulací cholinergního nervového systému v důsledku inhibice AChE (akutní cholinergní krize). Podle druhu a lokalizace rozeznáváme muskarinové, nikotinové a centrální příznaky (Bajgar, 1985). Otrava se zpočátku projevuje postižením orgánů inervovaných parasympatikem (zvýšená sekrece žláz, průjem, inkontinence moči, bradykardie, pokles krevního tlaku, mióza) a rovněž centrálními příznaky (bolesti hlavy, úzkost, zmatenost, závratě, deprese dechových a kardiovaskulárních center v oblasti prodloužené míchy). Bez léčení mohou vést tyto mechanizmy k úmrtí živých organismů. Jestliže v důsledku otravy koncentrace ACh dále stoupá, dochází k nadměrné stimulaci nikotinových receptorů. Následkem je pak blokáda přenosu v gangliích. Na nervosvalových ploténkách vede dlouhodobá stimulace vysokými koncentracemi ACh k depolarizaci receptorů, což vyvolává svalovou ochablost, třes a záškuby jednotlivých příčně pruhovaných svalů, které se postupně rozšiřující na všechny kosterní svaly těla. Vzniká nebezpečí periferní obrny dýchacího svalstva (bronchospasmus). Klinické potíže můžou přetrvávat i několik dnů až měsíců po akutní intoxikaci. Především se jedná o neurologické a neuropsychické příznaky (zvýšená únava, poruchy spánku, úzkostné až depresivní stavy, poruchy paměti). 27
Velice nebezpečný je pozdní neurotoxický efekt, který se manifestuje více dnů či týdnů po expozici, která nemusí být klinicky diagnostikována. Je charakterizován motorickými a senzorickými poruchami, histologickými změnami v periferních neuronech, inhibicí a později dealkylací tzv. neurotoxické esterasy (Patočka, 2004c). Projevuje se svalovými křečemi, progresivní ztrátou šlachových reflexu, brněním a mravenčením kůže. Období rekonvalescence bývá velmi dlouhé (roky). 3.3.3.3 AChEI jako insekticidy Organofosfátové insekticidy můžeme klasifikovat jako vysoce, středně a mírně toxické pro lidský organizmus. Vysoce toxické sloučeniny se používají především pro zemědělské účely, sloučeniny se střední toxicitou se používají jako insekticidy pro zvířata a insekticidy s nízkou toxicitou pro savce se užívají jako spreje v zahradách a domácnostech. Každým rokem na otravu organofosfáty celosvětově umírá přibližně 200 000 lidí (Eddleston, 2008). Otravy spojené s pesticidy jsou časté v rozvojových zemích, především u zemědělců porušujících pravidla správného užívání, neznalých všech rizik těchto látek, nedodržujících bezpečnost práce, apod. (Bronstein, 2011, Roberts, 2005). V České republice byly od roku 2000 zaznamenány pouze 4 smrtelné případy otravy organofosfáty (Vodvářka, 2008). Ve vyspělých zemích patří k nejčastějším příčinám akutní intoxikace organofosfáty zejména sebevražedné pokusy (Ševela, 2002). Předností organofosfátů používaných v zemědělství je, že mají velmi silné insekticidní účinky a po použití se díky své nestabilní chemické struktuře rychle rozpadají na neškodné radikály během několika dnů, takže zemědělské produkty jsou poživatelné již za krátkou dobu po ošetření. Insekticidní účinek je vyvolán stejným molekulárním mechanizmem jako toxicita pro teplokrevné živočichy. Riziko akutní otravy u necílových organizmů může nastat v průběhu aplikace, požitím kontaminované vody nebo ošetřené rostliny, kontaktem s kontaminovanou vodou a půdou nebo přímým požitím granulovaného pesticidu. 28
V současné době je celosvětově používáno více než 200 organofosfátových sloučenin (Pouzar, 2014), např. parathion (E605), malathion, fenthion, paraoxon, trichlorfon, chlorpyrofos aj. Používají se ve formě postřiků (roztoky, emulze, gely) nebo jako enkapsulované preparáty. Výhodné by bylo syntetizovat AChEI s vysokou selektivitou vůči hmyzí AChE oproti lidské AChE, čím by se zvýšila bezpečnost pracovníků, kteří přichází do styku s insekticidy každý den. 3.3.3.4 Nervově paralytické látky (NPL) Další skupinu ireverzibilních inhibitorů AChE představují nervově paralytické látky. Podle fyzikálně-chemických vlastností se dělí na: G látky tabun (O-ethyldimethylamidokyanofosfát), sarin (Oisopropylmethylfluorofosfonát), cyklosin (cyklohexylmethylfluorofosfonát) a soman (Opinakolylmethylfluorofosfonát). Jsou to bezbarvé kapaliny podobné vodě bez výraznějšího zápachu, relativně rozpustné ve vodě a dobře v organických rozpouštědlech. Je pro ně charakteristická vysoká těkavost, takže nejpravděpodobnější branou vstupu jsou dýchací cesty. V látky látka VX (O-ethyl-S-/2-diisopropyl-aminoethyl/-methylthiofosfonát). Je pro ně charakteristická velmi nízká těkavost takže ve vodě a v terénu vydrží velmi dlouhou dobu (týdny až měsíce). Ve vodě jsou špatně rozpustné, v organických rozpouštědlech jsou rozpustné velmi dobře. Analogem látky VX je látka VR (S-/2-dietylamino/-etyl-O- /isobutyl/-metylfosfonotionát) vyvíjená v Rusku. V látky jsou toxičtější než G látky zvláště při intoxikaci přes kůži. Látka VX doposud dosáhla největšího vojenského významu. Zvláště toxická je při intoxikaci přes kůži. Střední smrtelná dávka při zamoření nechráněné kůže se pohybuje kolem 0,07 mg.kg -1 hmotnosti exponovaného jedince. Látka se střední těkavostí označována jako GP nebo GV. Svým chemickým složením se pohybuje mezi G a V látkami (dimethyamido-o-/2-dimethylamino-ethyl/- fluorofosfonát). 29
3.3.4 Profylaxe a terapie otrav ireverzibilními AChEI S přihlédnutím k bezprostřednímu ohrožení života v případě závažných intoxikací musí být terapie zahájena co nejdříve. Důležité je zabránit dalšímu vstřebávání látky a opuštění zamořeného prostoru. Pokud je to nutné, je potřeba zabezpečit základní životní funkce (řízené dýchání, nepřímá masáž srdce, stabilizovaná poloha při bezvědomí). Základem terapie otravy NPL je antidotní terapie. Celosvětově se jako lék volby, který antagonizuje účinek ACh, používá anticholinergikum atropin. Blokuje účinek nahromaděného AChE především na periferních muskarinových receptorech. Méně ovlivňuje centrální příznaky, neboť obtížně prochází hematoencefalickou bariérou (Patočka, 2004). Patří mezi tzv. funkční antidota. Právě vzhledem k nedostatečným centrálním antimuskarinovým účinkům se používá současně s anticholinergikem benaktyzinem, které HEB prostupuje podstatně lépe. Atropin se podává i.m. nebo i.v v dávce 2-4 mg opakovaně v 10-30 minutových intervalech. Výhodné je podávání v infuzi. Tolerance organizmu otráveného NPL k atropinu je vysoká, podávání je možné až do prvních příznaků atropinizace (mydriáza, zčervenání kůže, tachykardie). Celková dávka může dosáhnout až 100 mg za 24 hod. Atropin se v klinické praxi jako antidotum používá už více než 50 let (Sivagnanam, 2002). Přesto po podání této standardní atropinové léčby dochází až k 20 % úmrtí léčených (Eddleston, 2008), což se vysvětluje chybějícím antinikotinovým účinkem atropinu (Tobin, 1991). Jako kauzální antidota se používají reaktivátory acetylcholinesterasy. Obnovují aktivitu inhibované AChE tak, že přímo vytěsní navázaný organofosfát, a tím obnoví její normální fyziologickou funkci. Základní antidotní terapie (podání anticholinergika a reaktivátoru AChE) je obvykle doplněna antikonvulzivní terapií z důvodu zabránění excitačním pochodům v CNS, které vedou k tonicko-klonickým generalizovaným křečím a následnému 30
poškození některých struktur CNS. Lékem volby je diazepam, lze použít také klonazepam nebo alprazolam. V případě závažné intoxikace vedoucí k akutní respirační insuficienci je třeba počítat s umělou ventilací spojenou s oxygenoterapií, farmakologickou podporou ventilace (Syntophyllin) a regulaci acidózy (infuze s bikarbonátem sodným). Jako terapeutické antidotum, po zasažení NPL má Armáda České republiky (AČR) k dispozici přípravek ANTIVA s obsahem reaktivátoru HI-6 nebo autoinjektor COMBOPEN s obsahem atropinu a obidoximu. Jako antikonvulzivum se používá autoinjektor s diazepamem. Vzhledem k vysoké toxicitě a rychlosti účinku NPL nabývají na významu ochranná a preventivní opatření s cílem zabránit průniku noxy do organizmu. AČR je před účinky NPL zajištěna protichemickými a zdravotnickými opatřeními, z nichž nejdůležitějšími jsou prostředky individuální ochrany, dekontaminace zasažené kůže a farmakologická profylaxe. K farmakologické profylaxi proti NPL se používá reverzibilní inhibitor AChE karbamát pyridostigmin ve směsi s anticholinergiky s převahou centrálního účinku benaktyzinem a trihexyfenidylem. Toto profylaktikum, označované PANPAL, slouží k preventivnímu podání před předpokládanou expozicí NPL. Snižuje intenzitu příznaků intoxikace a zlepšuje celkové výsledky léčby otravy. Je určeno pro osoby při hrozícím nebezpečí zasažení nervově paralytickými látkami, zvláště somanem a pro osoby, které mají být vyslány do míst zamořených nervově paralytickými látkami ke zvýšení jejich ochrany v případě selhání použitých prostředků individuální ochrany. Nástup účinku je během 15-30 minut, účinek trvá 8 hodin (Patočka, 2004c). Dalším typem profylaktického antidota je transdermální náplast TRANSANT. Balení obsahuje dva kusy adhezivních náplastí, lahvičku s lyoflizovaným oximem HI-6 (0,8 g), ampulku s pufrem a injekční stříkačku s jehlou. HI-6 se aplikuje na polštářek náplasti těsně před nalepením. Účinná profylaxe antidota je 8 hodin. V současné době je snaha vyvinout látku s co nejsilnějším reaktivačním účinkem proti všem nejpoužívanějším NPL (sarin, soman, tabun, látka VX). Zároveň by mělo být bezpečné i její profylaktické použití. 31
3.4 Reaktivátory acetylcholinesterasy První reaktivátory AChE byly připraveny v padesátých letech minulého století. V roce 1955 byl syntetizován pralidoxim, o tři roky později trimedoxim a pak obidoxim. V šedesátých letech následoval metoxim a oxim HI-6. Od té doby bylo publikováno více než 2000 různých struktur oximů, nicméně do klinické praxe se dostalo pouze prvních pět uvedených. 3.4.1 Struktura oximů Reaktivátory bývají velmi často označovány jako oximy, jelikož součástí jejich molekuly je oximová skupina. Prvním syntetizovaným oximem byl mono-pyridinový pralidoxim (2-pyridiniumaldoxim-N-methyljodid), s oximovou skupinou v poloze 2 pyridinového kruhu (tabulka č. 2). Po pralidoximu následovali obidoxim a trimedoxim, bispyridinové deriváty s oximovou skupinou na pozici 4 na obou pyridinových kruzích lišící se pouze spojovacím řetězcem. Další nově syntetizované oximy vykazují výraznou strukturální diverzitu, kterou je možné rozdělit podle následujících kritérií: 1. mono- nebo bicyklické systémy s nábojem nebo bez náboje 2. kruhy nesoucí jednu nebo víc symetrických či asymetrických oximových skupin v polohách 2, 3 nebo 4 3. alifatický nebo aromatický postranní řetězec připojený ke kruhu 4. různé spojovací řetězce mezi kruhy (alkylén, xylén, esterový můstek) Ze závislosti struktury a účinku vyplývá, že účinnější oximy jsou ty, které - ve své molekule obsahují 2 pyridinové kruhy - mají oximovou skupinu navázanou v poloze 2 nebo 4 dusíkatého jádra - mají ve své struktuře kladný náboj (kvartérní dusík) 32
Všechny tyto rysy jsou důležité nejen pro reaktivační účinnost oximu, ale také pro jeho distribuci v organizmu. Z uvedeného vyplývá, že nejúčinnějšími reaktivátory jsou bispyridinové oximy. Oximová skupina je při ph lidské krve částečně disociována. Procesem částečné disociace vzniká oximátový anion. Oximátový anion, jako velmi silný nukleofil, má schopnost uvolnit OF z aktivního místa cholinesteras tím, že reaguje s atomem fosforu v molekule OF sloučeniny za uvolnění hydroxylu aktivního serinu (Stojilkovič, Jokanovič, 2006). Přítomnost kvartérního dusíku v molekule oximu je důležitá pro jeho afinitu k enzymu. Zvýšená afinita kvartérních látek k AChE je přisuzována jejich interakci s anionickými místy enzymu (Kuča, 2005). Dalším strukturním faktorem ovlivňujícím reaktivační schopnost reaktivátorů AChE je, u biskvarterních zástupců, tvar a délka spojovacího řetězce mezi oběma kvartérními dusíky. Délka a tvar spojovacího řetězce sice nezasahují přímo do reaktivace, ovlivňují však významně reaktivační schopnost (Kuča 2005, Kuča 2003, Pang 2003). Tato závislost byla testována na AChE inhibované tabunem, cyklosarinem, sarinem a látkou VX. Ze závislosti vyplývá, že optimální délka spojovacího řetězce je v tomto případě tři až čtyři methylenové skupiny (Kuča 2006, 2007). 33
Název Označení Chemická struktura Chemický název N-methyljodid Trimedoxim TMB-4 Obidoxim Pralidoxim 2-PAM 2-pyridiniumaldoxim- bis-4/- pyridiniumaldoxim-nmethyl/eter dichlorid Metoxim MMB-4 N,N - trimetylen bis-/4- pyridiniumaldoxim/dic hlorid Asoxim HI-6 4-carbamoyl-1-[({2- [(E)-(hydroxyimino) metylpyridinium-1- yl}methoxy)metyl]pyrid inium dichlorid Tabulka č. 2: Přehled současně používaných reaktivátorů 34
3.4.2 Mechanismus účinku oximů Po navázání reaktivátoru svým pozitivně nabitým dusíkem na aniontové centrum esterasy se aldoximový postranní řetězec oximů dostává do bezprostřední blízkosti fosforylovaného esteratického centra. Následuje přesun esterické vazby fosfátu a uvolnění cholinesterasy (defosforylace) (obr. č. 8.). Účinek oximů nastupuje velmi rychle. Aktivita motorických nervů se obnovuje po i.v. podání za několik minut. Méně výrazně než na nervosvalovém spojení se účinek oximů projevuje na efektorových místech parasympatiku a v CNS je jejich účinek nevýznamný. Prostupnost oximu HEB je v současné době předmětem výzkumu (Lorke 2007, Procházka 2008). Obrázek č. 8: Mechanismus účinku reaktivátorů AChE Oximy musí být podané co nejdříve po intoxikaci, protože jakmile komplex AChE s organofosfátem zestárne nejsou oximy schopné enzym reaktivovat. Při této reakci dochází ke spontánní dealkylaci, kdy konjugací inhibitoru s esterasou vzniká oxyanion, a pak již není možné OF vytěsnit z aktivního místa enzymu. Nejrychlejšímu stárnutí podléhá AChE inhibována somanem. V současné době je ve světě v léčbě intoxikací NPL za zlatý standard považován pralidoxim. V České republice a dalších 35
evropských státech se používá také obidoxim. Mnohé potencionální látky jsou v současnosti předmětem studií. Snahou je najít účinnou sloučeninu, která by vykazovala silný reaktivační účinek na široké spektrum NPL s co nejnižší toxicitou. V České republice bylo syntetizováno několik mono a bispyridinových oximů (tzv. K-oximy) s různými spojovacími řetězci alkánovým, alkénovým, xylénovým a fenylénovým stejně tak s různou substitucí pyridinového kruhu. V současné době jsou předmětem in vivo a in vitro testování. Několik těchto oximů vykazuje slibné výsledky. Oxim K 027 (1 - (4 - hydroxyiminometylpridinium) 3 - (4 - karbamoylpyridium) propan dibromid) byl poprvé syntetizován v roce 2003. Jedná se o sloučeninu s nízkou toxicitou (LD 50 > 1200mg/kg u potkana). V několika studiích tato látka prokázala slibné účinky na reaktivaci AChE inhibovanou organofosfátovými insekticidy, čím by se v budoucnu mohla stát vhodným kandidátem pro léčbu tohoto typu intoxikací, kde by mohla nahradit doposud používaný obidoxim (Petroianu 2006, 2007). Co se týče účinku na AChE inhibovanou NPL v doposud provedených in vitro experimentech, je oxim účinný vůči tabunu, sarinu a látce VX (v koncentraci 10-5 M). Nepůsobí však proti somanu a cyklosarinu, a to ani při vyšších koncentracích (10-3 M) (viz. tabulka č. 3) (Kuča, 2010). Inhibitor Reaktivace (%) 10-5 M 10-3 M Tabun Sarin Cyklosarin Soman VX VR (ruská VX) Paraoxon DDVP Metylchlorpyrifos 1 2 0 0 7 3 21 5 23 11 22 0 6 70 39 59 26 45 Tabulka č. 3: Reaktivace NPL a pesticidy inhibované AChE oximem K 027 (Kuča, 2010) 36
Oxim K 203 (1 - (4 - hydroxyimino-metylpyridinium) - (4 - karbamoylpyridinium) but-2-en dibromid) byl syntetizován v roce 2008 především z důvodu, že doposud neexistoval žádný vhodný oxim adekvátně působící proti tabunu (Kassa, 2010). Obtížná antagonizace tabunu vyplývá z jeho chemické struktury, která je odlišná od dalších NPL. Jednou z nejdůležitějších odlišností je přítomnost dimethylamidové skupiny (CH 3 ) 2 N- místo methylové CH 3 -. Pro reakci látek typu oximu, resp. oximátového aniontu, který je účinnou formou reaktivátoru, je nezbytný elektronový deficit ve vazbě, která má být štěpena. Právě přítomnost volného elektronového páru lokalizovaného na amidovém dusíku tabunu velmi ztěžuje nukleofilní zásah do struktury inhibovaného enzymu (Cabal, 1999). Ve studiích s tabunem dosahovala látka K 203 výborných výsledků a stává se tak slibnou sloučeninou, která by mohla nahradit doposud používané reaktivátory (Kassa, 2010). Nicméně její účinek není univerzální, ve studiích se somanem a sarinem se jevila jako slabší inhibitor. Nevýhodou je také její nízká prostupnost HEB, tedy nedostatečný účinek na centrální projevy akutní toxicity NPL. Tato nevýhoda by v budoucnu mohla být eliminována použitím v kombinaci s anticholinergikem. 3.4.3 Anticholinergní účinky reaktivátorů AChE Ačkoliv primární účinek oximů je vytěsnění organofosfátu z vazby na inhibovaný enzym, bylo zjištěno, že tyto látky mají i vlastní anticholinergní účinky na muskarinové a nikotinové receptory. Tyto účinky jsou obecně mnohem slabší než antagonistický účinek atropinu, nicméně hrají důležitou roli v léčbě intoxikací OF. Antimuskarinové účinky jsou pravděpodobně způsobeny alosterickou tj. nekompetitivní inhibicí receptoru (Soukup 2008, 2010a), zatím co blokáda nikotinového receptoru může být kompetitivní i nekompetitivní (Helden, 1996). Byly prokázány také účinky na nikotinové receptory nervosvalové ploténky i receptory ve vegetativních gangliích (Alkondon, 1988). Účinky reaktivátorů na machr byly doposud studovány na různých tkáních, které exprimují především subtypy receptorů M 2 a M 3. Jsou to například srdeční síně, bránice, hladká svalovina močového měchýře nebo mozek. Na základě těchto studií se 37
zjistilo, že antagonizace machr je subtypově specifická, a to ve prospěch M 2 receptorů (Soukup 2013, van Helden et al. 1996). Dále bylo zjištěno, že oximy kromě inhibičního účinku na machr jsou ve vyšších koncentracích schopny také inhibovat účinek AChE (Sepsova et al., 2013). Jak již bylo zmíněno, v močovém měchýři se vyskytují dva typy muskarinových receptorů. Za kontrakci hladké svaloviny detrusoru zodpovídají M 3 receptory, jejichž účinek je facilitován receptory typu M 2. V dosavadních studiích byly zjištěny selektivní antagonistické účinky na M 2 receptory např. u obidoximu, HI-6 a K112 (Soukup 2010a,b, Soukup 2008). 38
4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Princip použité metody Pokus byl prováděn klasickou ex-vivo farmakologickou studii na stripech močových měchýřů laboratorních potkanů ponořených v orgánové lázni. Po přidání testovaných látek do roztoku byla jejich schopnost ovlivnit kontrakci měřena třemi různými typy stimulace - elektrickým proudem různé frekvence, agonistem muskarinových receptorů metacholinem (MeCh) a agonistem purinergních receptorů - adenosin - 5 - trifosfátem (ATP), a to při různých koncentracích. 39
4.2 Příprava základních roztoků a) Krebsův roztok Před každým měřením bylo připraveno 5 litrů roztoku rozpuštěním následujících látek v destilované vodě 34,48 g NaCl, 1,71 g KCl, 0,78 g KH 2 PO 4, 0,69 g MgSO 4, 10,50 g NaHCO 3 a 4,96 g glukosy. Po rozpuštění bylo přidáno ještě 0,92 g CaCl 2 (všechny suroviny Sigma Aldrich). b) Acetyl β metylencholin chlorid (metacholin - MeCh) Mr (MeCh) = 195,69. Dle vzorce m = c. M. V. bylo spočítáno, že je potřeba navážit 0,19569 g metacholinu (Sigma Aldrich) a rozpustit v 5ml destilované vody, čím se získal roztok o koncentraci 10-3 M. Z tohoto roztoku byl odpipetován 1,0 ml a přidán k 9,0 ml destilované vody. Ze vzniklého roztoku se odpipetoval také 1,0 ml a přidal k dalším 9,0 ml vody. Tímto způsobem byla připravena koncentrační řada 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 a 10-8 M. c) Adenosin 5 - trifosfát (ATP) Mr (ATP) = 551,14. Podle stejného vzorce m = c. M. V. byla vypočítaná navážka 2,7557g ATP (Sigma Aldrich). Toto množství se rozpustilo v 5,0 ml horké vody, čím vznikl roztok o koncentraci 5x10-3 M. Přidáním 1,0 ml takto připraveného roztoku k 4,0 ml destilované vody vznikl roztok o koncentraci 10-3 M, který se následně ředil až do koncentrace 10-7 M odpipetováním vždy 1 ml o řád koncentrovanějšího roztoku k 9 ml destilované vody. d) Oxim K 203 1-(4-hydroxyimino-metylpyridinium)- (4-karbamoylpyridinium) but-2-en dibromid M r (K 203) = 458,15. Dle vzorce m = c. M. V. bylo vypočítáno, že je potřeba navážit 0,2746 g K 203 a rozpustit ve 3,0 ml destilované vody. Tímto způsobem se získal roztok o koncentraci 10-3 M, který se následně ředil, čím se připravila řada roztoků o koncentracích 10-4, 10-5, 10-6 a 10-7 M a to tak, že se vždy z roztoku s vyšší koncentrací odpipetovalo 100 μl a přidalo k 900 μl destilované vody. e) Oxim K 027 1-(4-hydroxyimino-metylpyridinium)-3-(karbamoylpyridinium) - propan dibromid Mr (K 027) = 446,14. Podle stejného vzorce m = c. M. V. bylo vypočítáno, že se musí navážit 0,26768 g K 027. Testované roztoky se připravili stejným způsobem jako u oximu K 203, v koncentrační řadě 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 a 10-7 M. Připravené roztoky oximů K 203 a K 027 se uchovávaly v lednici, roztok MeCh a roztok ATP v mrazničce. 40
Označení Strukturní vzorec Molekulová hmotnost K 203 458,15 K 027 446,14 Tabulka č. 4: Označení, struktura a relativní molekulová hmotnost testovaných reaktivátorů 41
4.3 Princip měření kontrakce močového měchýře Pokus probíhal metodou ex-vivo na stripech močových měchýřů samců laboratorních potkanů kmene Wistar (hmotnost 250 320 g). Potkani byli usmrceni oxidem uhličitým, jejich močový měchýř byl vypreparován (stripy o velikosti 2 x 6 mm) a následně napnut mezi dvě elektrody, z nichž jedna byla upevněna pevně a druhá volně nastavitelná. Tyto elektrody byly ponořeny do orgánové lázně s objemem 25 ml (obrázek č. 10, 11). Orgánová lázeň byla naplněna Krebsovým roztokem s hodnotou ph 7,4 a vytemperovaným na teplotu 37 C. Roztok byl po celou dobu okysličován směsí 95 % kyslíku a 5 % oxidu uhličitého. Stripy byly ponechány 45 minut v klidu, napnuté tahem 5 mn opakovaným oddalováním volně nastavitelné elektrody. V jednom cyklu se každá testovaná látka zkoušela na 4 stripech, tzn. ve 4 orgánových lázních najednou. Každý den byly vypreparovány nové stripy. Každá látka v každé koncentraci se měřila na celkem osmi stripech a z každého zvířete byly získány 2 stripy. K experimentu byl použit systém BIOPAC (Goleta, USA). Systém BIOPAC umožňuje svou hardwarovou a softwarovou vybaveností snímat, zaznamenávat a hodnotit základní fyziologické funkce. Díky možnostem tohoto systému můžeme měřit širokou škálu nejen elektrobiologických signálů, ale i fyziologických veličin, v našem případě elektricky a chemicky vyvolanou kontrakci hladké svaloviny. Za nejdůležitější součást systému BIOPAC se považuje MP systém, který získává data z přídavných modulů a následně je zpracovává. Námi naměřená data byla zaznamenána systémem MP100WSW a jeho softwarovou součástí programem AcqKnowledge. Tento program umožňuje sběr dat z MP systému a provádí matematické a statické analýzy ze získaných dat. Principem této metody je stanovit míru kontrakce svaloviny v mn po přidání testovaných látek elektrostimulací a v přítomnosti agonistů machr a purinergních receptorů vyskytujících se v hladké svalovině močového měchýře, čím se zjistí, jaký účinek na tyto receptory mají. 42
Obrázek č. 9: Preparace močového měchýře Obrázek č. 10: Orgánová lázeň Biopac a MP systém Obrázek č. 11: Strip močového měchýře natažený mezi dvě elektrody 43