Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU HYDROXYPROLINU SPEKTROFOTOMETRICKY 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení obsahu hydroxyprolinu v živočišných tkáních spektrofotometrickou metodou. 2 Princip Hydroxyprolin se stanoví po kyselé hydrolýze vzorku, následné oxidaci hydrolyzátu chloraminem B a po reakci s p-dimethylaminobenzaldehydem spektrofotometricky při vlnové délce 558 nm. 3 Chemikálie Používají se pouze chemikálie analytické čistoty, pokud není uvedeno jinak. 1 Voda (deionizovaná, demineralizovaná nebo destilovaná). 2 Kyselina sírová, H2SO4, koncentrovaná, = 1,84 g/ml. 3 Kyselina sírová, H2SO4, 30% roztok. Příprava: Do 1000ml odměrné baňky s asi 800 ml vody (1) se přidá 104 ml kyseliny sírové (2), roztok se promíchá, vytemperuje na laboratorní teplotu a doplní vodou (1) po značku. 4 Hydroxid sodný, NaOH. 5 Hydroxid sodný, NaOH, roztok, c(naoh) = 10 mol/l. Příprava: Do 1000ml kádinky se naváží se 400 g hydroxidu sodného (3) a rozpustí se v asi 800 ml vody (1) za stálého míchání a chlazení. Po ochlazení se kvantitativně převede do 1000ml odměrné baňky a doplní vodou (1) po značku. 6 Kyselina chloristá, HClO4, = 1,67 g/ml. Bezpečnostní upozornění: Kyselina chloristá je v koncentrovaném stavu a za horka velmi silné oxidační činidlo. Může způsobit požár a explozi. Způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí. Doporučuje se, aby reakce prováděl zkušený analytický chemik. Při práci je nezbytné používat ochranný oděv, rukavice a ochranné brýle či obličejový štít. 7 Kyselina chloristá, HClO4, roztok, c(hclo4) = 3 mol/l. Příprava: Do 1000ml odměrné baňky s asi 800 ml vody (1) se přidá 253 ml kyseliny chloristé (4), roztok se promíchá, vytemperuje na laboratorní teplotu a doplní vodou (1) po značku.
Strana 2 8 Kyselina octová, koncentrovaná, CH3COOH. 9 1-propanol (propylalkohol), CH3CH2CH2OH. 10 2-propanol (isopropylalkohol), (CH3)2CHOH. 11 Kyselina citronová, monohydrát, C6H8O7. H2O. 12 Octan sodný trihydrát, C2H3O2Na. 3H2O. 13 4-dimethylaminobenzaldehyd, (CH3)2NC6H4CHO. 14 Chloramin B. 15 Chloroform nebo toluen pro konzervaci pufru. 16 Citrát-acetátový pufr. Příprava: Do 600ml kádinky se naváží 50 g monohydrátu kyseliny citronové (11), 12 ml kyseliny octové (8), 120 g trihydrátu octanu sodného (12) a 34 g hydroxidu sodného (4) se smísí, rozpustí ve vodě (1) a doplní do objemu 1000 ml. Výsledné ph pufru je 6. Pufr je vhodné konzervovat několika kapkami toluenu či chloroformu (15). Při uchování v tmavé lahvi při 4 C je pufr stálý nejdéle 2 měsíce. 17 Oxidační činidlo. Příprava: Do 250ml kádinky se naváží 1 g chloraminu B (14) a rozpustí se ve 20 ml vody (1), přidá se 50 ml citrát-acetátového pufru (16) a 30 ml 1-propanolu (9). Oxidační činidlo se připravuje vždy čerstvé. 18 Vybarvovací činidlo. Příprava: Do 250ml kádinky se naváží 5 g 4-dimathylaminobenzaldehydu (13) a rozpustí se ve 100 ml 2-propanolu (10). Vybarvovací činidlo se připravuje vždy čerstvé. 19 4-hydroxyprolin, standardní látka. 20 Základní standardní roztok 4-hydroxyprolinu, c = 1000 mg/l. Příprava: Do 100ml odměrné baňky se naváží 100 mg 4-hydroxyprolinu (19) s přesností na 0,1 mg a mícháním se rozpustí se v dostatečném množství vody (1). Roztok se poté doplní vodou (1) po značku a opět promíchá. Při uchování při asi 4 C lze roztok základního standardního roztoku použít po dobu 1 měsíce. 21 Pracovní standardní roztok 4-hydroxyprolinu, c = 50 mg/l. Příprava: Do 100ml odměrné baňky se odpipetuje 5 ml základního standardního roztoku 4- hydroxyprolinu (20) a doplní se vodou (1) po značku. Pracovní roztok se připravuje vždy čerstvý.
Strana 3 4 Přístroje a pomůcky 1 Spektrofotometr s příslušenstvím, kyveta 10mm, vlnová délka 558 nm. 2 ph metr. 3 Mlýnek na maso. 4 Laboratorní sušárna pro nepřetržitý provoz po dobu 24 h, s regulací teploty, asi 105 C. 6 Vodní lázeň, s regulací teploty, asi 60 C. 7 Analytické váhy s přesností 0,0001 g. 8 Suchý skládaný filtr střední hustoty. 9 Chladnička, asi 4 C, 10 Mrazicí box, asi 18 C. 5 Postup 5.1 Úprava vzorku Pokud je vzorek v obalu, kvantitativně se vyjme z obalu společně s tekutinou, rosolem, tukem či jakoukoli jinou složkou, která se vydělila ze vzorku během skladování a dokonale se zhomogenizuje, např. se umele dvakrát na mlýnku na maso. V případě, že některé části vzorku byly před homogenizací odstraněny (kůže, kosti), je nutné tuto skutečnost uvést do Protokolu o zkoušce. Vzorek se do doby hydrolýzy uchovává v lednici, pro případné opakování analýzy se zamrazuje. Pokud je pro analýzu použit zmrazený materiál, ponechá se před provedením hydrolýzy asi 2 h v lednici při teplotě asi 4 C. 5.2 Kalibrace Příprava kalibračních roztoků Do série 100ml odměrných baněk se pipetuje (2,0; 4,0; 6,0; 10,0; 20,0) ml pracovního standardního roztoku 4-hydroxyprolinu (21), doplní se po značku vodou (1) a promíchá. Tyto roztoky odpovídají koncentracím (1; 2; 3; 5; 10) mg/l 4-hydroxyprolinu. Kalibrační řada se připravuje vždy čerstvá v den analýzy. Příprava kalibračních roztoků k měření Do sady zkumavek se odměří po 1 ml z každého roztoku kalibrační řady a přidá se po 1 ml oxidačního činidla (17). Směs se promíchá a nechá stát 20 min při laboratorní teplotě ve stojánku. Poté se přidá 1 ml ředěné kyseliny chloristé (7) a po promíchání ještě 1 ml vybarvovacího činidla (18). Směs se opět promíchá a stojánek se zkumavkami se vloží do vodní lázně předem vyhřáté asi na 60 C. Do kontrolní zkumavky se stejným objemem vody se vloží teploměr. Jakmile teplota v kontrolní zkumavce dosáhne 60 C, zkumavky se temperují 20 min.
Strana 4 5.3 Hydrolýza a příprava vzorku pro stanovení 4-hydroxyprolinu Do 100ml konické baňky se naváží asi 3 g zhomogenizovaného vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 30 ml roztoku kyseliny sírové (3) a varné keramické střepy. Baňka se uzavře vhodným uzávěrem (např. alobalem) a vloží se do sušárny vyhřáté asi na 105 C. Po dosažení této teploty se obsah hydrolyzuje 14 h (nejlépe přes noc). Po vyjmutí ze sušárny a ochlazení se obsah konické baňky převede do 50ml odměrné baňky (V1). Objem se po vytemperování doplní vodou (1) po značku, promíchá a zfiltruje. Alikvotní podíl 5 ml (V2) se převede do kádinky, přidá se asi 20 ml vody (1) a použitím (3 5) ml roztoku hydroxidu sodného (5) se upraví ph na hodnotu 5 až 8. Takto upravený vzorek zneutralizovaného filtrátu se kvantitativně převede do 50ml odměrné baňky (V3). Objem se doplní po značku vodou (1). Připravený roztok vzorku se použije pro spektrofotometrické stanovení. Slepý pokus zahrnuje stejný postup, avšak místo kalibračního roztoku se použije voda (1). 5.4 Příprava vzorků k měření Do zkumavky se odměří 1 ml zneutralizovaného hydrolyzátu vzorku (V4) a přidá se 1 ml oxidačního činidla (17). Směs se promíchá a nechá stát 20 min při laboratorní teplotě. Poté se přidá 1 ml roztoku kyseliny chloristé (7) a po promíchání ještě 1 ml vybarvovacího činidla (18). Směs se opět promíchá a vloží do vodní lázně předem vyhřáté asi na 60 C. Do kontrolní zkumavky se stejným objemem vody se vloží teploměr. Jakmile teplota v kontrolní zkumavce dosáhne 60 C, zkumavky se temperují 20 min. 5.5 Měření obsahu 4-hydroxyprolinu Po vyjmutí zkumavek z lázně a rychlém ochlazení pod tekoucí vodou a následném vytemperování na laboratorní teplotu se přístroj nastaví podle doporučení výrobce. Měří se absorbance kalibračních roztoků a analyzovaných vzorků v kyvetě o optické délce 10 mm při vlnové délce procházejícího světla λ = 558 nm. Zbarvení je stálé po dobu 60 min. Výsledky se vyhodnocují metodou kalibrační křivky. Koncentrace měřených vzorků musejí být upraveny tak, aby odpovídaly rozsahu kalibrační křivky. V každé sérii vzorků se provede i stanovení slepého pokusu a vhodného IRM. Poznámky 1 Hodnoty absorbancí kalibrace lze použít pro výpočet korigovaných absorbancí a pro sestrojení grafu po dobu 1 měsíce. V případě odlišné hodnoty absorbance slepého pokusu od běžné hodnoty je nutné provést novou kalibraci ihned.
Strana 5 6 Výpočet Obsah 4-hydroxyprolinu (X) ve vzorku v % se vypočítá podle vztahu A V1 V3 X (%) n V V 10000 2 4 X je výsledná koncentrace 4-hydroxyprolinu v % vzorku, A obsah 4-hydroxyprolinu v hydrolyzátu vzorku (mg/l), n navážka vzorku (g), V1 objem hydrolyzátu vzorku po doplnění v odměrné baňce (ml), V2 objem pipetovaného hydrolyzátu vzorku (ml), V3 objem roztoku s upraveným ph, po doplnění v odměrné baňce (ml), V4 objem pipetovaného roztoku do zkumavky (ml), 10 000 přepočet na g/100g. Při dodržení všech uvedených ředění objemů a pipetování (tj. V1 = 50 ml, V2 = 5 ml, V3 = 50 ml a V4 = 1 ml) lze použít zkrácený vztah A 0,05 X (%) n Za výsledek se považuje průměrná hodnota získaná ze dvou paralelních stanovení. Výsledek se zaokrouhluje na 2 desetinná místa. Poznámky 2 Obsah kolagenu (K) ve vzorku v % se vypočítá podle vztahu K = X 8 (%) K je výsledná koncentrace kolagenu ve vzorku (%), X výsledná koncentrace 4-hydroxyprolinu ve vzorku (%), 8 faktor přepočtu 4-hydroxyprolinu na kolagen. 7 Literatura 1 Věstník MZe částka 1/2014, str. 25 28, Stanovení čisté svalové bílkoviny v mase a výrobcích z masa.