MUTACE A REPARACE DNA Lekce 6 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.
MUTACEse dělína: i) genomové změna počtu chromozómů ii) chromozómové změna struktury chromozómů iii) genové změny DNA v rámci jednoho genu -somatické m. vznikají v somatických buňkách a postihují jen část těla organismus jeví mozaicismus (chimérismus) -gametické m. vznikají v buňkách zárodečných linií nebo v gametách a jsou přenášeny do následných generací -dominantní m. x recesivní m. většina mutací je recesivních a ztrátových, ale mohou vznikat i nové znaky -forward m. mutace od standardního k mutovanému typu - zpětná (back) m. mutace od mutovaného ke standardnímu typu
-letální m. působí smrt jedince ve stádiu zygoty nebo ve stádiích před rozmnožováním -semiletální m. působí snížení životaschopnosti -neutrální m. beze změny na vitalitu -supervitální m. zvyšují životaschopnost jedinců -spontánní m. vznikají z vnitřních známých příčin, nikoliv zásahem z vnějšku -m. indukované fyzikálními, chemickými nebo biologickými faktory -morfologické m. vyvolávají (nápadné) změny fenotypu (u mikroorganismů je jejich spektrum velmi omezené, např. mutace petite u kvasinek, vzhled bakteriálních kolonií rouhg x smooth) -nutriční m. m. vedoucí ke změně prototrofie na auxotrofii (neschopnost syntetizovat si veškeré potřebné látky k životu, ty pak musejí být dodávány v médiu)
-podmíněné m. mutace projevující se ve fenotypu jen za určitých podmínek prostředí (např. podmíněně letální jsou u E. coli teplotně senzitivní mutace ty dovolují růst organismu jen za určité nižší, permisivní, teploty, zatímco za obvyklé, tj. vyšší, restriktivní, teploty nikoliv) -teplotně citlivý není gen, ale jeho produkt, tj. bílkovina -podmíněná m. bez letálního efektu siamská kočka, králík himalájský
Mutace indukované biologickými faktory -podmíněné transpozicemi genetických mobilních elementů nebo integracemi retrovirů a T-DNA -somaklonální variabilita genetické a epigenetické změny v rostlinných buněčných a tkáňových kulturách Typy genových mutací i) substituce (záměna) bází ii) inzerce (vložení) nebo delece (ztráta) bází iii) expanze trinukleotidových repetic
i) substituce bází tranzice -Pu za Pu, Py za Py transverze - Pu za Py a naopak, má dramatičtější důsledky než tranzice jak z hlediska genetického (viz degenerace gen. kódu) tak chemického (struktura Pu x Py)
m. měnící smysl (missense m.) záměnou vznikne triplet kódující jinou AK m. beze smyslu (nonsense m.) -záměnou vznikne stop kodon tiché m. (silent m.) -záměnou vznikne triplet kódující stejnou AK (mezi tiché m. řadíme také záměny bází v intronech a v spacerové DNA)
ii) inzerce a delece bází -molekulární analýzy ukázaly, že tento typ m. je častější než záměny bází -dojde k tzv. posunovým mutacím (frameshift m.), tj. k posunu čtecího rámce -pokud dojde ke změně počtu, který je násobkem tří, dochází k tzv. in-frame inzercím nebo delecím, jejímž důsledkem je pouze ztráta nebo získání AK v kódovaném polypeptidu -pokud dojde ke změně počtu, který není násobkem tří, dojde při posunu čtecího rámce ke změnám ve všech tripletech od místa mutace záměny AK a vznik předčasného stop kodonu velmi časté iii) expanze trinukleotidových repetic (expanding trinucleotide repeats) -nový typ mutací objevený v r. 1991 -dochází ke zvyšování počtu trinukleotidových přirozeně se vyskytujících repetic
-v současné době je minimálně třináct chorob a pět fragilních míst spojováno s těmito expanzemi
Spontánní mutace -vyvolány vnitřními příčinami nikoliv přítomností mutagenu i) tautomérní přesmyky bází -soudilo se, že jsou hlavní příčinou špatného párování během replikace DNA, ukázalo se ale, že k tvorbě mutací zřejmě nevedou
ii) kolísavé párování bází (non-watson-crick base pairing) -dochází k němu díky značné flexibilitě molekuly DNA (tzv. wobble párování) -většina chybného párování během replikace DNA padá na vrub právě wobble párování
iii) deaminace bází -deaminací cytozinu vznikne uracil rozpoznáno uracil DNA glykosylázou odstraněn a nahrazen C -deaminací minoritní báze 5-metylcytozinu (páruje se s G) vznikne tymin, který se při replikace bude párovat s A záměnová m. (tranzice) -deaminací adeninu vznikne hypoxantin párující se s cytozinem rozpoznán specifickou glykosylázou a nahrazen A
iv) depurinace -ztráta purinu z nukleotidu AP místo nemůže sloužit jako komplementární templát při replikaci DNA vkládá se náhodný nukleotid (nejčastěji adenin) chyba a při následné replikaci je zafixována -depurinace je poměrně častá záležitost (savčí buňka v kultuře ztratí takto denně cca 10 tis. purinů)
v) sklouzávání vlákna DNA při replikaci -dochází k tím k tvorbě inzercí nebo delecí několika nukleotidů a tím k posunovým mutacím
Mutace indukované chemickými faktory -faktor signifikantně zvyšující mutační rychlost se nazývá mutagen -první chemický mutagen objeven Auerbachovou (yperit, Drosophila, tajný vojenský výzkum publikováno až 1947) i) analogy bází -látky připomínající velmi svojí strukturou standardní báze, takže mohou být inkorporovány do replikované molekuly DNA -5-bromouracil (5BU) je analog tyminu a také se normálně páruje s A, avšak někdy se nesprávně páruje s G, což nakonec vede k tranzici (T.A 5BU.A 5BU.G C.G)
-2-aminopurin (2AP) je analog adeninu páruje se s T, avšak výjimečně také s C v konečném důsledku tranzice (T.A T.2AP C.2AP C.G) ii) kyselina dusitá způsobuje deaminaci bází, především cytosinu iii) hydroxylamin hydroxyluje cytosin na hydroxylaminocytosin, který se páruje s adeninem (tranzice CG TA)
iv) interkalační látky -svoji strukturou a velikostí připomínají dvojice bází vmezeřují je do molekuly DNA narušení 3D struktury DNA jednonukleotidové inzerce nebo delece
v) oxidativní reakce -látky způsobující poškození DNA prostřednictvím reaktivní formy kyslíku (peroxid vodíku, hydroxylový a superoxidový radikál) vznikají v buňce během normálního aerobního metabolismu (nebo je jejich vznik indukován ionizujícím zářením) -např. z guaninu vznikne 8-oxy-7,8-dihydrodeoxyguanin, který se často nesprávně páruje s A transverze G.C T.A
vi) alkylační látky -jsou to elektrofilní látky mají afinitu k DNA, která má negativní náboj (každý nukleotid má negativní náboj na fosfátu a parciální negativní náboje na bázi) -alkylační látky reagují s těmito místy a zanechávají na nich alkyl skupiny (alkylace DNA) -na bázích jsou nejvíce náchylné k alkylacím N 7 guaninu a N 3 adeninu destabilizace vznik apurinního místa mutace -alkylovány mohou být rovněž všechny atomy N a O podílející se na tvorbě vodíkových můstků nesprávné párování takové báze mutace -dělí se na monofunkční (EMS etylmetansulfonát, MMS metylmetansulfonát, ENU etylnitrosomočovina, MNNG metylnitronitrosoguanidin) a bifunkční (ty způsobují také hodně chromozómových mutací zlomů = klastogenní účinek; sirný a dusíkatý yperit)
vii) aflatoxin B1 -silný kancerogen produkovaný plísněmi rodu Aspergillus (aflatoxiny jsou akutně toxické, kancerogenní, mutagenní a teratogenní) -váže se na guanin v pozici N 7 destabilizace vazby báze-cukr vznik AP místa mutace -potraviny choulostivé na výskyt aflatoxinů jsou arašídy, para ořechy, chilli, koření, sušené ovoce (např. fíky), sója, kukuřice -viz též http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/obsah.php
Mutace indukované zářením -poprvé popsán mutagenní účinek záření (X paprsků) v r. 1927 H. Müllerem -X záření, gama záření, kosmické záření (ionizační záření) x UV záření i) UV záření -má nízkou energii proniká jen nepatrně a nezpůsobuje ionizaci, nicméně je vysoce mutagenní -způsobuje tvorbu pyrimidinových dimerů (nejčastěji T-T, méně často C-C nebo C-T) v rámci jednoho vlákna DNA vytvořením cyklobutanového kruhu změna 3D struktury DNA inhibice replikace a transkripce) nebo 6-4 fotoproduktu -nejsilnější mutagenní účinek má UV 260 nm (DNA nejsilněji absorbuje záření stejné vlnové délky)
ii) ionizující záření -vysoká energie vysoce pronikavé -způsobuje tvorbu volných radikálů a reaktivních iontů, které napadají DNA a vedou nejčastěji k dvouřetězcovým zlomům (ionizační záření je klastogen = mutagen způsobující zlomy) nepřímý účinek záření -přímý účinek zásah přímo molekuly DNA a její poškození (zlomení)
Reverze -reverzní m. je změna vedoucí od mutovaného ke standardnímu fenotypu -pravá reverze změna DNA na původní sekvenci -supresorová m. genetická změna potlačující efekt jiné (forward) mutace
-intragenová suprese druhá mutace v rámci téhož genu -intergenová suprese obnovení fenotypu je dosaženo zavedením druhé mutace do jiného genu (obr.17-10)
REPARACE DNA i) přímá reparace ii) nepřímá reparace (excizní) iii) reparace chybného párování (mismatchrepair) iv) postreplikační reparace v) reparace dvouřetězcových zlomů (DSB repair) vi) SOS reparace
i) přímá reparace: DNA fotolyáza (fotoreaktivace) -opravuje pyrimidinové dimery, energii získává z viditelné části světla -enzym poškozené místo rozezná, opraví a poté z DNA disociuje
O 6 -alkylguanin-dna-alkyltransferáza -opravuje přímo báze alkylované v pozici O 6 -guanin, O 4 -tymin a alkylovaný fosfát odstraněním (přenesením) navázaných alkylových skupin - sebevražedný enzym (jedna alkyl skupina přenesená na cystein enzymu ho ireverzibilně inaktivuje)
ii) nepřímá reparace: Excizní reparace poškozená DNA je odstraněna a nahrazena nově syntetizovanou DNA -base excision repair (BER) -DNA glykosyláza rozpozná poškozené místo (existují různé glykosylázy na rozpoznávání různých typů poškození DNA) přerušení vazby cukr báze a její uvolnění vznik AP místa enzym 5 -AP endonukleáza vytvoří jednořetězcový zlom 5 3 exonukleáza začne odstraňovat přilehlé nukleotidy (krátký úsek) DNA polymeráza I (u bakterií) nebo ß (u eukaryot) zaplní uvolněné místo ligáza kovalentně spojí -DNA polymeráza ßnemá korekční (proofreading) aktivitu (1 chyba na 4000 inkorporovaných nukleotidů; v lidském genomu je denně opraveno tímto způsobem 20-40 tis. nukleotidů, tj, polymeráza by takto denně vyrobila až 10 mutací) tuto aktivitu zajišťují při této opravě speciální AP endonukleázy, tzv. APE1
-nucleotide excision repair (NER) -velmi univerzální, odstraňuje velké množství typů poškození -komplexní proces řízený velkým počtem genů -komplex enzymů vyhledává na DNA distorze separace vláken DNA v oblasti poškození a jejich stabilizace navázáním speciálních proteinů zlomy poškozeného vlákna ve vzdálenosti 5 nukleotidů na 3 konci a 8 nukleotidů (u bakterií) nebo 21-23 nukleotidů (u eukaryot) na 5 konci DNA polymeráza zaplní uvolněné místo DNA ligáza kovalentně spojí iii) reparace chybného párování -DNA polymeráza má spolehlivost 10-4 až10-5, její proofreadingová aktivita zvyšuje spolehlivost replikace až na 10-9 -zbývající chyby opravuje mismatch reparace a dále opravuje malé smyčky DNA vznikající díky sklouzávání vláken DNA při replikaci
iv) postreplikační reparace -probíha po replikaci DNA rekombinačním způsobem -poškození DNA neopravuje, ponechává ho na místě, ale umožní replikaci DNA i v oblasti léze
v) reparace dvouřetězcových zlomů Existují dva základní mechanismy opravy: i) homologní rekombinace (jako templát pro opravu DSB využívá totožné nebo velmi podobné sekvence DNA) ii) nelegitimní rekombinace (NHEJ nonhomologous end joining; rekombinuje zcela odlišné sekvence) Homologní rekombinace (HR) -je důležitá při opravě DNA v somatických buňkách a při meióze -existují 3 modely HR (založené ovšem především na studiích na kvasinkách) Nelegitimní rekombinace (NHEJ) -nejčastější způsob opravy DSB v eukaryotních buňkách -iniciační rozpoznání zlomu je zprostředkováno komplexem KU70 a KU80 -následuje opracování konců DNA molekuly (komplex MRN), aby byly substrátem pro DNA ligázu -závěrečná ligace je katalyzována komplexem DNA ligázy IV a proteinu XRCC4
vi) SOS reparace (chybující, error-prone) -dovoluje překonat replikační blok i za cenu vnesení četných chyb do DNA (což může být meší zlo než nedokončená replikace DNA, která je fatální) -komplexní proces zahrnující nejméně 25 genů
Detekce mutagenů v prostředí -začíná se nejjednoduššími testy, tj. testy s mikroorganismy -stěžejní je test Amesův, jenž pracuje s auxotrofním mutantem (his - ) Salmonella typhimurium a sleduje vznik zpětných mutací na prototrofii -bakterie má inaktivován reparační systém (=zvýšení citlivosti) a modifikovanou lipopolysacharidovou stěnu (=zvýšení průniku látek z okolí) -pracuje se s řadou kmenů určených pro detekci různých skupin chemických mutagenů -modifikace s mikrozomální jaterní frakcí S9 umožňuje přiblížit prokaryotní systém systému eukaryotnímu a tím dovoluje identifikovat tzv. promutageny, tj. látky, které samy o sobě nejsou mutagenní, mutagenem se stanou až po metabolické aktivaci organismem (buňkou)