BIODEGRADACE POLYCHLOROVANÝCH BIFENYLŮ IMOBILIZOVANÝMI BUŇKAMI PSEUDOMONAS SP2 PODRAZKÝ O., BURKHARD J. Ústav chemie ochrany prostředí, Vysoká škola-chemicko technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6 - Dejvice KLIER D., KUNCOVÁ G., KARBAN J. Ústav chemických procesů Akademie věd ČR, Rozvojová 2, 165 02 Praha 2 Suchdol PAZLAROVÁ J., DEMNEROVÁ K. Ústav biochemie a mikrobiologie, Vysoká škola-chemicko technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6 - Dejvice Polychlorovanými bifenyly (PCB) jsou souhrnně označovány chlorované deriváty bifenylu (obr.1). Atomy chloru mohou substituovat atomy vodíku v polohách 2 až 6 a 2 až 6. Celkem existuje 209 chlorovaných derivátů bifenylu (tzv. kongenerů). 3 2 6' 5' 4 1 1' 4' 5 6 2' 3' Obr.1. Strukturní vzorec bifenylu. PCB jsou jedny z nejzávažnějších látek znečišťujících životní prostředí díky jejich fyzikální i chemické stabilitě a schopnosti hromadit se v živých organismech. Zejména pro své fyzikální vlastnosti (nízká tenze par, malá el.vodivost, bod varu přes 200 ºC, atd.) byly používány jako plnidla do plastů, k výrobě transformátorových olejů, nestékavých barev, atd. Jejich účinky na živé organismy nejsou dosud dobře známy, kumulují se však v tucích a jejich rozkladem mohou vznikat vysoce jedovaté dioxiny a dibenzofurany. Jak stanovení, tak likvidace PCB jsou v současnosti velice náročné. Stanovení koncentrace PCB se provádí extrakcí vzorku nepolárním rozpouštědlem s následnou analýzou na plynovém chromatografu. Likvidace PCB je nákladná, neboť se provádí spalováním za velmi specifických podmínek (teplota přes 1200 ºC a následné rychlé ochlazení spalin, aby nedocházelo k tvorbě dioxinů). H H O CO CO I II III IV V Obr.2. Mechanismus biodegradace PCB buňkami Pseudomonas sp.2. Z těchto důvodů je v současnosti studována biodegradace jako alternativní způsob likvidace, příp. možnost využití biosenzorů k detekci PCB. Schopnost rozkládat některé méně chlorované kongenery vykazují např. bakterie Pseudomonas sp.2 izolované z kontaminované půdy v České Republice, pokud rostou na bifenylu jako jediném zdroji uhlíku. Degradace probíhá mechanismem znázorněným na obr.2. Přičemž meziprodukt (IV) je u některých kongenerů barevný (žlutý). IUAPPA Praha 2000 158 Section: B
Práce byla rozdělena do dvou částí. První část se zabývala imobilizací buněk, jako možností intenzifikace biodegradačního procesu, druhá část pak vznikem barevných produktů degradace při imobilizaci buněk do alginátu, potaženého silikátovou vrstvou, což je významné z hlediska možnosti využití v biosenzorech. Porovnání účinnosti nosičů při biodegradaci Deloru 103 K experimentům s imobilizací buněk byly použity 4 druhy nosičů na bázi porézních silikátů, konkrétně Siran, což je komerční nosič na bázi porézního skla (Schott Engineering GmbH, Německo), hydrofobizovaný a nehydrofobizovaný keramický nosič, připravený na ÚCHP AV ČR a expandovaná břidlice jako přírodní a ekonomicky snadno dostupný materiál. U keramického nosiče byla zkoumána i účinnost po jeho regeneraci vypálením v peci při 500 ºC po dobu 5 h. Degradační experimenty byly prováděny v provzdušňovaných reaktorech vždy se 100 ml nosiče. Ze zamražené kultury buněk Pseudomonas sp.2, bylo nejprve připraveno inokulum kultivací v 250ml erlenmeyerově baňce s 50 ml média (1 g.l -1 MgSO 4.7H 2 O, 5 g.l -1 Ca(NO 3 ) 2, 5 g.l -1 FeSO 4.7H 2 O) a 0,05 g bifenylu jako jediným zdrojem uhlíku, při teplotě 29 ºC po dobu 3 dnů. Do vysterilizovaných reaktorů se 100 ml nosiče pak bylo odměřeno vždy 100 ml sterilního média, 0,1 g bifenylu a 8 ml inokula. Obsah reaktorů byl provzdušňován průtokem 5 ml.min -1 vzduchu 1 při teplotě okolí (22-26 ºC) po dobu 5 dnů, pak byla vypuštěna vodná fáze 2 a nosič byl propláchnut 100 ml sterilní vody. Do reaktorů pak bylo opět odměřeno 100 ml sterilního média, 0,1 g bifenylu a byly přidány 4 µl Deloru 103, což je směs chlorovaných derivátů bifenylu, dříve komerčně vyráběná v bývalém Československu. Degradace pak probíhala po dobu 21 dní při teplotě okolí (22-26 ºC) a průtoku vzduchu 5 ml.min -1 (při druhém experimentu (srpen 99) byl testován Siran s průtokem vzduchu 2,5 ml.min -1, při třetím (prosinec 99) průtok 20 ml.min -1 ), přičemž do reaktorů byl průběžně doplňována sterilní voda. Po ukončení degradace byla zvlášť zpracována kapalná fáze a nosič. Nosič byl extrahován acetonem v Soxhletově aparatuře, načež byl aceton extrahován hexanem. Takto připravený vzorek byl po zakoncentrování přímo analyzován na plynovém chromatografu. Kapalná fáze nebyla hexanem extrahována, protože se předpokládá, že téměř veškeré, ve vodě nerozpustné, PCB se nasorbují na povrch nosiče, případně na biomasu. Porovnání výsledků degradace podle jednotlivých kongenerů je v grafu na obr.3. Obr.3. Porovnání účinnosti nosičů při biodegradaci Deloru 103 imobilizovanými buňkami Pseudomonas sp.2. Na grafu je vidět, že nejúčinněji probíhala biodegradace Deloru 103 při imobilizaci buněk na Siranu, o něco horší účinnost vykazují keramické nosiče připravené na ÚCHP AV ČR a jako velice málo účinná se ukázala expandovaná břidlice. 1 Průtok vzduchu byl později měněn na: 2 ml/min (červen 99), 20 ml/min (prosinec 99). 2 U reaktoru s přírodním materiálem nebylo téměř vůbec možné vypustit médium, natož pak propláchnout nosič vodou. Vlastní biodegradace tedy pokračovala pouze přidáním 4 µl Deloru 103. IUAPPA 2000 159 Section: B
Vznik barevných meziproduktů při biodegradaci PCB Během biodegradace některých kongenerů PCB buňkami Pseudomonas sp.2 dochází k tvorbě žlutých meziproduktů, které jsou polární a jejichž barva závisí na ph, čehož by bylo možno využít v biosenzorech pro detekci PCB. Pro zintezívnění biodegradace byly buňky imobilizovány do alginátových kuliček, které byly pokrývány silikátovou vrstvou, která měla zvýšit jejich odolnost. Při biodegradaci PCB takto imobilizovanými buňkami však vznikalo namísto žlutého oranžové zabarvení, které bylo dále studováno. Buňky byly nejprve kultivovány v 2l erlenmeyerově baňce, do které bylo odměřeno 1000 ml média, 1 g bifenylu a 50 nebo 100 ml inokula (médium i inokulum bylo připraveného stejně, jako při experimentech s keramickými nosiči). Někdy byly místo inokula použity buňky zbylé z předcházející kultivace. Tato baňka pak byla aerována a míchána na temperované míchačce při teplotě 30 ºC po dobu 6-8 dní. 5. den kultivace bylo přidáno 0,25-0,5 g bifenylu. Po ukončení kultivace byla změřena optická denzita média při 650 nm a bylo odstředěno tolik média, aby se získalo cca 2.10 10 buněk. Odstředěné buňky byly rozmíchány se 2 ml Trizma pufru o ph=8, pak k nim bylo přidáno 10 ml alginátu sodného a směs byla promíchána a převedena do injekční stříkačky s jehlou o průměru cca 1 mm, ze které byla kapána do 100 ml 0,7% roztoku Ca 2 tak, aby se tvořily pokud možno pravidelné kuličky. Vytvořené kuličky byly ponechány v roztoku Ca 2 ještě 30 min. za neustálého míchání v chladu a pak byly propláchnuty cca 100 ml chladné sterilní vody. Den před koncem kultivace bylo připraveno cca 17 ml sol-gelu pro coating následujícím postupem: Do každé ze dvou 50ml kádinek bylo odměřeno 6,16 g teramethoxysilanu (TMOS), poté přidány 2 ml demineralizované H 2 O a 0,44 ml 0,01M H. Kádinky pak byly překryty parafilmem a směs v nich míchána až do zhomogenizování a okamžitě dána do chladu. Druhý den byl sol-gel míchán cca 4 h za laboratorní teploty bez překrytí parafilmem a poté byl dán na cca 1 h opět do chladu. Coating alginátových kuliček byl prováděn následovně: kuličky byly na síťce potápěny do sol-gelu a poté ponechány 1 min. v sušárně, vyhřáté na teplotu cca 80 C. Tento postup byl opakován 3x a poté byly kuličky převedeny do dvou 250ml erlenmeyerových baněk s 50 ml kultivačního média, 0,05 g bifenylu a 5 µl Deloru 103 v každé z baněk. 250ml erlenmeyerovy baňky pak byly vloženy do třepačky a třepány po dobu 5-8 dní při teplotě 30 C a 60 ot/min. Poté byly baňky umístěny na 30 minut do vodní lázně s teplotou cca 80 C, jejich obsah byl zcentrifugován a bylo změřeno UV/VIS spektrum. Fugát byl uschován v lednici pro další analýzy. Zabarvení v baňkách se značně lišilo, neboť proces pokrývání kuliček sol-gelem je špatně reprodukovatelná operace. První oranžově zbarvené vzorky z biodegradací imobilizovanými buňkami byly analyzovány kapilární elektroforézou s DA detektorem, a pro porovnání byla provedena i analýza žlutě zbarvených vzorků, připravených biodegradací PCB volnými buňkami. Obr.4. Porovnání analýzy žlutých a oranžových meziproduktů na kapilární elektroforéze. Na obr.4 je vidět, že píky 3, 4, 5 a 6 se vyskytovaly pouze v oranžových vzorcích a nebyly přítomny ve žlutých vzorcích. Píky 1, 2 a 1, 2 zřejmě přísluší žlutým meziproduktům, neboť mají maximum absorbance v oblasti okolo 400 nm a do oblasti 480 nm pouze zasahují svými okraji, protože jsou velice výrazné. 5 6 1 2 3 1 2 4 žlutý prod. oranžový prod. IUAPPA 2000 160 Section: B
Kapalné fáze z některých dalších experimentů byly zpracovány extrakcí na tuhé fázi (SPE). Vzorky byly nejprve okyseleny na ph=2 a pak převedeny na kolonky s pevným sorbentem LiChrolut EN (Merck KGaA, Německo). Po projití vzorku byly kolonky vysušeny proudem dusíku a zachycené látky byly eluovány methanolem. Zabarvení vzorků se po okyselení měnilo z oranžové na žlutou, vzorky prošlé kolonkou, byl téměř bezbarvé. Methanolové extrakty pak měly opět oranžovou barvu. Tyto extrakty pak byly analyzovány kapalinovou chromatografií s DA detektorem (viz obr.5). Zde se bohužel ukázalo, že výsledky analýz se pro jednotlivé experimenty značně liší, což je zřejmě způsobeno špatnou reprodukovatelností imobilizace a coatingu. Při zkoumání reakcí buněk Pseudomonas sp.2 na různá rozpouštědla bylo zjištěno, že oranžové zabarvení vzniká i při kultivaci buněk na bifenylu za přítomnosti methanolu. Intenzita tohoto zabarvení stoupala s množstvím nadávkovaného bifenylu a methanolu, pokud však množství přidaného methanolu dosáhlo cca 5 ml na 50 ml média, buňky byly inhibovány. Oranžové zabarvení kapalné fáze při degradaci PCB buňkami Pseudomonas sp.2 imobilizovanými v alginátu, překrytém vrstvou sol-gelu, by tedy mohlo být způsobeno i zvýšenou koncentrací bifenylu, který se dostane do alginátových kuliček s odstředěnými buňkami z kultivace a zároveň zvýšenou koncentrací methanolu uvnitř kuliček, který se uvolňuje z TMOS během tuhnutí sol-gelu. Dalším úkolem bude všechny tyto barevné produkty odseparovat a pokud možno určit jejich strukturu. Výsledky těchto analýz však bohužel nebyly v době uzávěrky textu příspěvku k dispozici. Z chování těchto barevných produktů při extrakci tuhou fází lze usuzovat, že se jedná o látky polární, jejichž barevnost se mění v závislosti na ph prostředí. IUAPPA 2000 161 Section: B
λ=450 nm vzorek č.1 vzorek č.2 vzorek č.3 vzorek č.4 Obr.5. Porovnání analýz 4 vzorků oranžových meziproduktů kapalinovou chromatografií. IUAPPA 2000 162 Section: B