Stanovení kyseliny pantotenové v lupíncích Corn flakes pomocí kapilární izotachoforézy Úkol: Pomocí kapilární izotachoforézy stanovte, zda je v reálném vzorku (kukuřičné lupínky Corn flakes) obsažena kyselina pantotenová. 1. Teoretická část: 1.1. Kyselina pantotenová (Corn flakes) Kyselina pantotenová vitamín B 5 (chemická struktura viz Obr. 1) se vyznačuje mj. antistresovými účinky, podporou hojení ran, jizev, popálenin a regeneraci tkání, ochrannými účinky proti UV paprskům a schopností zabraňovat usazování LDL cholesterolu v cévních stěnách. Kyselina pantotenová je obsažena v mnoha potravinách rostlinného a živočišného původu, a to především v mase, celozrnném pečivu a luštěninách. Často je také spolu s jinými vitamíny přidávána jako aditivum do různých potravin, kterými jsou především cereálie (např. kukuřičné lupínky Corn flakes), nápoje a dětská výživa. Průměrný obsah kyseliny pantotenové v potravinách se vyskytuje řádově v jednotkách až desítkách mg/kg. Její doporučená denní dávka je v České republice stanovena na hodnotu 6 mg a nejvyšší přípustná denní hodnota je 40 mg. Obr. 1 Chemická struktura kyseliny pantotenové (vitamínu B 5 ) 1.2. Kapilární izotachoforéza Kapilární izotachoforéza (CITP) je elektromigrační separační technika umožňující analýzu nabitých látek (kationtů či aniontů) při vloženém konstantním proudu (gradientu
napětí). Vzorek je dávkován mezi dva základní elektrolyty vedoucí a koncový obsahující ionty mající rozdílné hodnoty pohyblivostí (mobilit). Vedoucí elektrolyt obsahuje ionty se stejným znaménkem jako separované analyty (koionty) mající nejvyšší mobilitu v daném elektrolytovém systému. Koncový elektrolyt obsahuje koionty mající nejnižší mobilitu v daném elektrolytovém systému. Separované látky (analyty) jsou poté rozděleny mezi vedoucí a koncový elektrolyt na základě jejich rozdílných pohyblivostí. Každý separovaný analyt vytváří během CITP analýzy vlastní oddělenou zónu. Výsledkem analýzy je při použití univerzálního vodivostního detektoru schodovitý záznam tzv. izotachoforegram. Z výšky schodu usuzujeme kvalitu a délka zóny je přímo úměrná kvantitě (viz Obr. 2). Obr. 2 Izotachoforegram znázorňující CITP analýzu vzorku obsahující analyt A a B U elektromigračních metod se můžeme setkat s nízkou opakovatelností migračních časů, což je způsobeno především elektroosmotickým a hydrodynamickým tokem uvnitř separační kapiláry. V případě izotachoforetického analyzátoru je možné elektroosmotický tok potlačit, a to použitím kapilár (kolon) z inertního materiálu (např. z kopolymeru fluorovaného ethylenu a propylenu FEP) a/nebo přídavkem vhodného aditiva do pracovního elektrolytu (např. hydroxyethylcelulóza - HEC). Hydrodynamický tok je v tomto případě potlačen použitím hydrodynamicky uzavřeného systému (použitím semipermeabilních celofánových membrán oddělujících elektrolytové nádobky od elektrolytu, kterým je naplněna separační kapilára).
Při použití dvoukolonového izotachoforetického analyzátoru je využívána tzv. technika spojených kolon umožňující dvoudimenzionální CITP (2D-CITP). První kolona (kapilára) v níž dochází k odstranění nežádoucích interferentů a zakoncentrování cílových analytů je tzv. předseparační kolona. V druhé koloně analytické dochází k separaci zakoncentrovaných analytů. 2. Praktická část 2.1. Přístroje Dvoukolonový izotachoforetický analyzátor s vodivostní detekcí vybavený autosamplerem Homogenizátor IKA Centrifuga Ultrazvuková lázeň ph metr Analytické váhy 2.2. Pomůcky Plastové kádinky, plastové nádobky, elektrolytové nádobky, plastové odměrné baňky, jednorázové navažovací lodičky, špachtle, lžička, pipety, balónek, vatové tampony, stříkačkové mikrofiltry, injekční stříkačka, viálky, eppendorfky. 2.3. Chemikálie Standard kyseliny pantotenové, reálný vzorek (kukuřičné lupínky Corn flakes), kyselina chlorovodíková, TRIS, kyselina octová, hydroxyethylcelulóza (HEC), deionizovaná voda, kalibrační roztoky pro kalibraci ph metru. 2.4. Pracovní postup 2.4.1. Úprava reálného vzorku do plastové nádobky navážíme 2 g reálného vzorku (kukuřičné lupínky Corn flakes) a přidáme 20 ml deionizované vody nádobku umístíme do homogenizační aparatury a vzorek homogenizujeme po dobu 10 minut
poté přidáme 2 ml kyseliny octové (0,3 M) a opět homogenizujeme po dobu 10 minut do eppendorfky odpipetujeme alikvotní podíl (1 ml) zhomogenizovaného vzorku a umístíme na 15 minut do centrifugy (3000 rpm) odebereme supernatant, přefiltrujeme přes stříkačkový mikrofiltr (0,45 µm) a převedeme do viálky viálku umístíme do autosampleru připojeného k izotachoforetickému analyzátoru 2.4.2. Příprava elektrolytů podle tabulky složení elektrolytového systému (viz Tab. 1) navážíme nebo odměříme do odměrné baňky vypočtené množství (V = 250 ml) a doplníme deionizovanou vodou po rysku roztok vložíme na cca 10 minut do ultrazvukové lázně pomocí ph metru (předem nakalibrovaného) upravíme ph elektrolytu na potřebnou hodnotu připravené elektrolyty převedeme do elektrolytových nádobek a umístíme do analyzátoru 2.4.3. Příprava standardního roztoku do eppendorfky navážíme 5 mg standardu kyseliny pantotenové rozpustíme v 1 ml deionizované vody připravený roztok zředíme 20x deionizovanou vodou a převedeme do viálky 2.4.4. ITP analýza izotachoforetický analyzátor postupně naplníme elektrolytovým systémem (dle pokynů vedoucího cvičení) dále nastavíme metodu (časový průběh separace, hodnoty hnacích proudů, přepnutí kolon, volba módu) pomocí návodu k přístroji a vedoucího laboratorního cvičení provedeme v aniontovém módu ITP-ITP analýzu: 1. Slepého vzorku (koncový elektrolyt) 2. Připraveného reálného vzorku 3. Reálného vzorku s přídavkem standardního roztoku kyseliny pantotenové
Tab. 1 Složení elektrolytového systému Předseparační kolona (90x0.8 mm) Analytická kolona (90x0.3 mm) Vedoucí elektrolyt 10 mm HCl + 0,1 % HEC pomocí histidinu upravit ph hodnotu na 6,0 Koncový elektrolyt 5 mm MES + 0,05 % HEC pomocí TRISu upravit ph hodnotu na 6,2 Použitý hnací proud 200 µa 25 µa při detekci 10 µa 3. Vyhodnocení S použitím naměřených dat (izotachoforegramů) určete, zda je v předloženém reálném vzorku (lupínky Corn flakes) obsažena kyselina pantotenová. Výsledek zdůvodněte. 4. Otázky k prozkoušení 1. Bylo by možné v případě stanovení kyseliny pantotenové pomocí izotachoforézy použít také kationtový separační mód? Odpověď zdůvodněte. 2. Navrhněte jiný způsob úpravy vzorku před ITP analýzou. 3. Zjistěte pka hodnotu kyseliny pantotenové a uveďte v jakém rozmezí ph bude disociována. 4. Hrozí otrava z předávkování kyselinou pantotenovou, pokud jej organismus přijímá ve zvýšeném množství? 5. Popište metody, které je možné použít pro kvantifikaci cílových analytů. 6. Je možné pomocí izotachoforetické analýzy provést separaci nenabitých analytů? 7. Popište základní rozdíly mezi kapilární elektroforézou a kapilární izotachoforézou. 8. Jaké jiné elektromigrační metody znáte? 9. Vysvětlete rozdíl mezi univerzálním a selektivním detektorem. 10. Vysvětlete pojem elektroosmóza.
5. Doporučená literatura 1. Boček P. a kol.: Analytická kapilární izotachoforéza, Pokroky chemie. Academia, Praha 1987. 2. Everaerts F. M. a kol.: Isotachophoresis: theory, instrumentation, and applications. Elsevier, Amsterdam 1976. 3. Šťulík K.: Analytické separační metody. Karolinum, Praha 2004. 4. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 5. Coultate T. P.: Food: The chemistry of its components. RSC Publishing, Cambridge 2009. 6. Ötleş S.: Handbook of food analysis instruments. CRC Press, Boca Raton 2008. 7. Velíšek J.: Chemie potravin. OSSIS, Tábor 2002.