Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Stanovení estrogenů v biologických matricích Diplomová práce Vedoucí práce: prof. Mgr. Bořivoj Klejdus, Ph.D. Vypracovala: Bc. Marie Šnóblová Brno 2008

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení estrogenů v biologických matricích vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne... podpis diplomanta..

Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala vedoucímu své diplomové práce prof. Mgr. Bořivoji Klejdusovi, Ph.D. za jeho odborné připomínky, rady a také za jeho trpělivost a ochotu. Chci poděkovat také za to, že mi bylo umožněno pracovat v laboratoři kapalinové chromatografie na Ústavu chemie a biochemie MZLU v Brně a získat tak nové a užitečné zkušenosti pro mé budoucí působení v praxi. Dále bych chtěla poděkovat slečně Mgr. Lucii Onofrejové a paní Ing. Jaromíře Kroupové za jejich pomoc a cenné informace.

ANOTACE Osud přirozených steroidních hormonů, estrogenů, v těle člověka, vylučování estrogenních sloučenin obsažených v hormonální antikoncepci močí, následné vstupy do životního prostředí odpadních vod a metody jejich detekce jsou hlavním tématem této práce. Názvem estrogeny se označují jednak přirozené steroidní hormony, secernované především v ovariích, ale také synteticky připravené látky jiné struktury s tímto účinkem. Cílem praktické části byla optimalizace analytické separační metody HPLC-DAD/FLD, zhodnocení validačních parametrů za účelem vytvoření citlivé a jednoduché metody použitelné pro stanovení estrogenů v environmentálních vzorcích. Vlastní analýze předcházel krok SPE extrakce pro předčištění a zakoncentrování hledaných látek s použitím kolon Oasis HLB a WAX. Výtěžnost estrogenů v biologické matrici dosahuje > 80 %. LODs a LOQs se pohybují řádově v desítkám pg. Kvůli značným interferencím matrice moči i vody byl obsah estrogenů ověřen metodou HPLC-DAD/MS a množství bylo stanoveno ve stovkách ng l -1. Vzhledem k rizikům, která estrogeny představují řádově již při koncentracích 0,1 ng l -1, si zaslouží tato oblast další monitoring. Klíčová slova: Estrogeny, SPE extrakce, odpadní vody. ANNOTATION Destiny of natural steroid hormones, estrogens in human s body and following inputs in nature waste water and methods of their detection are primary goals of this thesis. So called estrogens are partly natural steroid hormones secreted especially in ovaries or synthetically prepared substances of different structure with equal effect. The goal of the practical part of thesis is optimalisation of analytical separative method HPLC-DAD/FLD, evaluation of valid parameters in order to compile sensitive and simple method applicable for determination of estrogens in environmental samples. Prior the core analysis there was done SPW for pre-cleaning and concentration of searched substances with usage of columns Oasis HLB and WAX. Estrogen extraction in biological matrix reaches > 80 %. LOD s and LOQs levels are in tens of pg. Due to extensive interference of water and urin matrix, the contents of estrogens was verified by HPLC-DAD/MS method and volume was assessed in hundreds of ng/l. Considering the hazards that may appear even at 0,1 ng/l concentration of estrogens, this field deserves further investigation. Keywords: Estrogens, Solid-phase extraction, wastewater.

OBSAH ÚVOD...11 CÍL PRÁCE...14 LITERÁRNÍ PŘEHLED...16 1. ÚVOD DO STUDIA POHLAVNÍCH HORMONŮ...17 2. ESTROGENY...18 2.1 Chemická struktura a biosyntéza estrogenů...18 2.2 Metabolizmus estrogenů...20 2.3 Transport, degradace a mechanizmus účinku estrogenů...21 3. HORMONÁLNÍ ANTIKONCEPCE...22 3.1 Složení hormonální kontracepce...23 3.2 Farmakokinetické vlastnosti...26 3.2.1 Estrogenní složka...26 3.2.2 Gestagenní složky...27 4. HYDROLÝZA KONJUGOVANÝCH LÉČIV...30 5. ESTROGENY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ...32 5.1 Úvod...32 5.2 Environmentální estrogeny...33 5.3 Fytoestrogeny, epidemiologie a jejich pravděpodobná role v ochraně proti rakovině...33 5.4 Zdroje estrogenů...34 5.5 Působení environmentálních estrogenů...35 5.6 Toxicita...35 5.7 Vliv estrogenních látek na vývoj...35 5.8 Vztah struktury a estrogenní aktivity...37 5.10 Kvantitativní vyjádření estrogenity...38 5.11 Biodegradace estrogenních sloučenin na čistírnách odpadních vod...39 5.12 Kontaminace povrchových vod...40 6. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY...41 7. METODY STANOVENÍ ESTROGENŮ...43 7.1 Validace metod pro analýzu estrogenů...44 7.2 Postup při stanovení estrogenů...44 7.2.1 Zpracování vzorků...44

7.3 Analytické detekční metody...45 7.3.1 Metody založené na plynové chromatografii (GC-MS a GC-MS-MS)...45 7.3.2 Metody založené na vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC)...46 7.3.3 Metody založené na imunochemických technikách...46 7.3.4 Další metody stanovení látek s estrogenní aktivitou...47 7.4 Použití analytických metod pro steroidní estrogeny...47 7.4.1 Odpadní vody a kaly...47 7.4.2 Povrchové vody a sedimenty...48 PRAKTICKÁ ČÁST...50 1. MATERIÁL A METODY...51 1.1 Chemikálie...51 1.2 Přístrojové vybavení...51 1.3 Biologický materiál...52 1.3.1 Hormonální antikoncepce...52 1.3.2 Moč...52 Vzorky ranní moči byly odebírány od 5 mladých zdravých žen ve věku 19-24 let, které užívají hormonální antikoncepci...52 1.3.3 Odpadní voda...52 1.4 Metodika přípravy vzorků...52 1.4.1 Hormonální antikoncepce...52 1.4.2 Moč...53 1.4.3 Odpadní voda...53 2. VÝSLEDKY PRÁCE...54 2.1 Optimalizace HPLC-DAD/FLD pro stanovení estrogenů...54 2.1.1 Optimalizace HPLC-DAD/FLD pro stanovení estrogenů a progestinů v antikoncepčních přípravcích...64 2.1.2 Optimalizace HPLC-DAD/FLD pro stanovení estrogenů v moči...65 2.1.2.1 Optimalizace kyselé hydrolýzy...65 2.1.2.2 Čistící procedura SPE...66 2.1.3 Optimalizace HPLC-DAD/FLD pro stanovení estrogenů v odpadní vodě...67 2.1.4 Optimalizace HPLC-DAD/MS pro stanovení estrogenů v odpadní vodě...68 2.2 Vyhodnocení...69 2.2.1 Vyhodnocení optimalizace metody...70 2.2.2 Vyhodnocení vzorků antikoncepce...74

2.2.4 Vyhodnocení vzorků odpadní vody...76 DISKUSE...83 ZÁVĚR...88 SOUPIS LITERATURY...91 Seznam grafů...96 Seznam tabulek...97 Seznam příloh...99 PŘÍLOHY... Chyba! Záložka není definována.

SLOVNÍK POUŽITÝCH ZKRATEK: Seznam zkratek hormonů: ACTH Adrenokortikotropní hormon = kortikotropin DES Diethylstilbestrol E1 Estron 17β-E2 17β-estradiol EE2 17α-ethinylestradiol 17α-E2 17α-estradiol E3 Estriol E1-3S Estron-3-sulfát draselná sůl βe2-3s 17β-estradiol-3-sulfát sodná sůl FSH Folikuly stimulující hormon = folitropin GnRH Hormon uvolňující gonadotropiny = LHRH = hormon uvolňující luteinizační hormon = LRH = hormon uvolňující luteotropin = LRF =luteotropin uvolňující faktor LRF hcg Choriový gonadotropin LH Luteinizační hormon = ICSH = hormon stimulující intersticiální buňky LTH Luteotropní hormon = luteotropin = PRL = prolaktin MeEE2 Mestranol MSH Melanoforový hormon = melanotropin PTH Parathormon SHBG Globulin vázající sexuální hormony STH = GH Růstový hormon = somatotropní hormon = somatotropin T 4 Thyroxin T 3 Trijodthyronin TSH Tyreotropní hormon = tyreotropin Seznam ostatních zkratek: ČOV Čistírna odpadních vod DDT Dichlordifenyltrichlorethan DHEA Dehydroepiandrosteron DNA Deoxyribonukleová kyselina EDC Endocrine disrupting compounds - Endokrinní disruptory EPA Environmental Protection Agency - Úřad pro ochranu životního prostředí

EREs Estrogen response elements ER Estrogenní receptor HDL Vysokodenzní lipoproteiny HRE Hormone response element HRT Hormonální substituční léčba LDL Nízkodenzní lipoproteiny NADPH Redukovaná forma NADP nikotinamidadenindinukleotidfosfát P450c17 17α-hydroxyláza P450c17 17,20 lyáza P450c17 Lyáza PCB Polychlorované bifenyly PCDD Polychlorované difenyl-p-dioxiny PCDF Polychlorované difenyl-furany p.o. Per os (Podávání ústy) 1 PSI = 7 Pa Pound per Square Inch TCDD 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin ŽP Životní prostředí Seznam zkratek analytických metod: APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation APPI Atmospheric Pressure Photo Ionisation CI Chemical Ionisation DAD Diode Array Detector EI Electron Impact ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay ESI Electrospray Ionisation FLD Fluorescenční detektor GC Gas Chromatography GPC Gel Permeation Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography LC Liquid Chromatography LLE Liquid-liquid Extraction LOEC Lowest Observed Effect Level Concentration LOD Level Limit Of Detection

LOQ Level Limit Of Quantification MS Mass Spectrometry MS-MS Tandem Mass Spectrometry NOEC No Observed Effect Concentration PLE Pressurised Liquid Extraction RIA Radio Immunoassay SPE Solid-phase Extraction STP Sewage Treatment Plan

ÚVOD 11

Ve své bakalářské práci jsem se snažila seznámit se a prozkoumat problematiku estrogenních látek v životním prostředí. Jelikož mne tato oblast velmi zaujala, rozhodla jsem se jí nadále věnovat a proto je diplomová práce navazujícím praktickým pokračováním teoretického základu popsaného v první práci. Mnohé chemické látky produkované člověkem ohrožují kvalitu povrchových a podzemních vod. V současné době je pozornost věnována látkám, které jsou produkovány přirozeně metabolizmem člověka, dále při užívání léčiv na hormonální bázi a farmaceutickým průmyslem a na znečištění životního prostředí mají stále větší vliv. I přes jejich velmi malá množství, ve kterých se ve vodním prostředí vyskytují (řádově jednotky až desítky ng l -1 vody) jsou tyto látky nebezpečné a to zejména z důvodu dlouhodobé akumulace a postupného působení jak na organizmy, tak i člověka. Látky, kterými se diplomová práce zabývá, jsou potenciálně nebezpečné a patří do skupiny EDC (endocrine disrupting compounds) neboli tzv. endokrinních disruptorů které EPA (Environmental Protection Agency Úřad pro ochranu životního prostředí) definuje jako exogenní látky, které interferují se syntézou, sekrecí, transportem, vazbou, účinkem, nebo rozkladem přirozených hormonů, jež jsou v těle odpovědné za homeostázi, reprodukci, vývoj nebo chování. Funkční součástí regulačního systému jsou látky nazývané hormony, do nichž se mimo jiné řadí i steroidní hormony. Součástí této skupiny jsou pohlavní inkrety zvané estrogenní hormony, které jsou hlavním předmětem této práce. Nejprve bude nastíněn obecný přehled o estrogenech, jejich metabolizmus, biosyntéza, účinky a použití syntetických derivátů v hormonální antikoncepci. Dále bude sledována expoziční cesta estrogenů do životního prostředí, zejména jejich vyloučení močí. Estrogeny se mohou dostat do rozličných složek prostředí. Mohou se stát součástí odpadních vod, kalů z ČOV, povrchových vod, sedimentů, půd, zejména jako důsledek metabolizmu nejen člověka, nýbrž i hospodářských zvířat. Následně bude obecně pojednáno o možných a v současné době dostupných metodách detekce estrogenů. Tato problematika je v současnosti v odborných kruzích se zájmem zkoumána, jak o tom dosvědčuje řada mezinárodních publikací. [25, 33, 34] Rostoucí množství odborných prací se snaží objasnit možná rizika na zdraví populací, nalézt vhodné metody pro stanovení těchto látek v prostředí a hledat cesty k jejich odstranění či zabránění jejich negativních účinků. V praktické části byla pro stanovení estrogenních látek uplatněna analytická separační metoda vysokoúčinná kapalinová chromatografie s detekcí diodového pole a fluorescenční detekcí (HPLC-DAD/FLD) a pro ověření stanovení estrogenních 12

hormonů ve složité matrici jakou je moč či odpadní voda byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie s detekcí diodového pole a s hmotnostní detekcí (HPLC- DAD/MS). Nejprve byly metody optimalizovány a následně aplikovány na reálné vzorky. Estrogenní látky byly hledány v moči žen užívajících hormonální antikoncepci a v odpadní vodě na přítoku a odtoku do ČOV Modřice. Moč byla před extrakcí tuhou fází (SPE), používanou jako čistící proceduru, upravena postupem kyselé hydrolýzy pro dekonjugaci estrogenních sloučenin. Metodika byla modifikována dle studie na podobné téma stanovení estrogenů v moči [26]. Pro úpravu vzorku vody byly použity dvě metodiky [26, 27], které byly modifikovány dle dostupných podmínek. Do výše zmíněné skupiny EDC patří mimo přirozené estrogeny také syntetické estrogeny a látky estrogenní povahy, které se do životního prostředí dostávají v důsledku rostoucí spotřeby hormonálních kontraceptiv, i jiných léků na hormonální bázi a průmyslovou výrobou. Problematika látek estrogenní povahy zde bude jen naznačena, neboť přesahuje předmět této práce. Sledovány budou hlavně přirozené estrogeny estron, 17α-estradiol, 17β-estradiol a estriol a jejich konjugované formy. Ze syntetických pak ethinylestradiol a progestiny užívané ve vybrané hormonální antikoncepci. Tyto látky jsou na jedné straně pro správnou funkci organizmu nepostradatelné, na straně druhé mohou ovlivňovat endokrinní systémy a následně reprodukci a vývoj lidské a zvířecích populací. Odhad produkce estrogenních sloučenin ženskou populací v Praze je 2,1 g/den. [36] Kontaminace organizmu je dána především potravou. Existují významné důkazy o tom, že populace lidské i volně žijících organizmů byly a jsou škodlivě ovlivňovány expozicí chemickými látkami v prostředí, což je potvrzeno především modulací různých endokrinních systémů. Řada vědeckých studií z poslední doby popisuje endokrinní abnormality u specifických populací ryb, ptáků, savců i člověka. [14] 13

CÍL PRÁCE 14

Základním cílem mého projektu byla snaha o poznání a porozumění osudu přirozených estrogenů a syntetického ethinylestradiolu a progestinů v kombinované hormonální antikoncepci uvnitř organizmu, o jejich metabolizmu, účincích a expozičních cestách v životním prostředí. Cílem praktické části této práce bylo optimalizovat analytické metody HPLC/DAD-FLD a HPLC/DAD-MS pro jejich stanovení v biologické matrici moči, u žen užívajících hormonální antikoncepci a v odpadní vodě brněnské ČOV v Modřicích. Dále také vhodná úprava složitých environmentálních matric pomocí chemické hydrolýzy a SPE extrakce. Důležitým bodem je i vliv fyzikálních faktorů na aktivitu a rozklad sledovaných látek, zejména teplota a doba vzájemných interakcí mezi estrogenními sloučeninami. Jako modelové sloučeniny byly vybrány přirozené steroidní estrogeny produkované hlavně ovárii; estron, 17α-estradiol, 17β-estradiol, estriol a jejich konjugované sloučeniny. Dále bylo poukázáno na syntetický estrogen obsažený v hormonální antikoncepci, a to ethinylestradiol a několik různých progestinů. Důvodem byly především pravděpodobné efekty na vznik rakoviny (převážně endometria a také prsu), negativní efekty na reprodukci mužského organizmu (při expozici mužského plodu, případně novorozence prostřednictvím mateřského mléka), dané inhibicí spermatogeneze a snížením počtu spermií a další negativní efekty na zdraví, převážně reprodukci, lidského organizmu. Kromě toho byly důvodem také účinky těchto látek na divokou populaci, zejména ryb, neboť ovlivňují plodnost a sexuální vývoj. 15

LITERÁRNÍ PŘEHLED 16

1. ÚVOD DO STUDIA POHLAVNÍCH HORMONŮ Orgány vylučující specifické látky přenášené čistě krevní cestou bez součinnosti nervové soustavy a působící na orgány jiné, jsou nazývány žlázami s vnitřní sekrecí, neboli endokrinními žlázami. Soubor všech endokrinních žláz určitého organizmu se označuje jako endokrinní systém, čímž je vyznačena jeho funkční jednota a vzájemná závislost jeho jednotlivých částí. Hormony jsou specifické látky secernované do krve žlázami endokrinního systému. Regulují činnost jiných vzdálených tkání a to stimulačně nebo inhibičně. Hormony lze dělit dle různých hledisek. Endokrinní hormony jsou produkovány žlázami s vnitřní sekrecí, jednak kůrou nadledvin a dále pohlavními žlázami. Skupina ženských pohlavních hormonů, kterými se práce zabývá patří mezi steroidní hormony. Jako steroidy se označují sloučeniny s cyklopentano-perhydrofenanthrenovým skeletem, složeným ze 4 kruhů gonan (Příloha 1, Obr.1). Jsou to látky ve vodě skoro nerozpustné, lipofilní, pokud nejsou ve formě esterů s kyselinou sírovou, ve formě glukuronidů nebo glykozidů. Mezi steroidy patří také pohlavní (sexuální) mužské hormony (androgeny) a hormony produkované kůrou nadledvin (kortikoidy). Z dalších přirozených látek mají steroidní strukturu steroly, žlučové kyseliny, aglykony srdečních glykozidů, některé sapogeniny a alkaloidy. Některé z těchto přírodních látek jsou vhodnou surovinou pro syntetickou přípravu steroidních hormonů. [11] Základní izolace účinných steroidů ze žláz byly v počátcích ztíženy nedostatečnou metodikou při čištění a dělení látek strukturou vzájemně podobných v mikroměřítku, nezbytném pro nepatrná množství hormonů ve žlázách. Teprve chromatografické postupy umožnily účinné izolace jednotlivých steroidních hormonů v čistém stavu. Steroidní hormony se již nepřipravují ze žláz, ale synteticky z některých přírodních steroidů, zejména rostlinných. Většina farmaceutických preparátů steroidních hormonů jsou dnes syntetické steroidní estery se složkou kyseliny propionové, nebo trimethyloctové apod. Estery steroidních hormonů mají protrahované působení, je to způsobeno pomalejší resorpcí těchto látek a jejich zvolněnou inaktivací v organizmu, zvláště v játrech, takže se dosáhne vyšších hladin hormonů po delší dobu. Metabolizmus ovariálních steroidních hormonů a cesty syntézy hlavních skupin steroidních hormonů - Přílohy 2 a 3, Obr. 2 a 3. 17

Ženské pohlavní hormony, tj. estrogeny a gestageny (progestiny) jsou především vytvářeny ve vaječnících, proto se pro ně někdy používá název ovariální hormony. Dalším místem jejich tvorby je kůra nadledvin (u žen i mužů), u mužů varlata a v těhotenství i placenta. Ovariální hormony jsou zodpovědné za rozvoj ženského pohlaví, vývin sekundárních pohlavních znaků, ovlivňují psychosexuální funkce žen, po pubertě vyvolávají cyklické změny spojené s ovulací, a konečně hrají také významnou roli při těhotenství. Ženské pohlavní hormony mají mnohačetné indikace. Používají se jako substituční léky při hypogonadizmu, v gynekologii k úpravě ovulace a menstruačního cyklu, a v řadě farmaceutických indikacích, nejčastějšími indikacemi je jejich použití jako antikoncepční látky, protinádorové látky a v dermatologii. Kromě indikací v gynekologii, se používají jako hormonální substituční léčba (HRT) u žen především po menopauze. Orálně a transdermálně podávané estrogeny a gestageny patří mezi nejčastěji předepisovaná léčiva. V terapii mají význam i látky s antiestrogenními a antigestagenovými účinky. [11] 2. ESTROGENY 2.1 Chemická struktura a biosyntéza estrogenů Estrogenní aktivita je výrazná jak u steroidních, tak některých nesteroidních látek, z nichž je nejznámější diethylstilbestrol. Z přirozeně se vyskytujících látek je nejúčinnější 17β-estradiol, po něm následuje estron a nejnižší účinnost má estriol. 17αepimer je daleko méně účinný nežli přirozený hormon estradiol. Všechny tyto látky jsou steroidy s 18ti uhlíky, fenolovým A kruhem, a hydroxynebo ketoskupinou na C 17. Alkylací na A kruhu dochází ke snížení vazebné kapacity příslušných látek na estrogenní receptory. Substituce ethinylem na C 17 výrazně zesiluje účinek po p.o. podání. Chemické vzorce Příloha 4, Obr. 4. Biochemické cesty, včetně hlavních enzymů a jejich intracelulární lokalizace jsou podobné v ovariích, varlatech a nadledvinách. Steroidní hormony jsou syntetizovány z cholesterolu, který je přítomný v ovariu jak volný, tak i esterifikovaný s mastnými kyselinami (estery cholesterolu). Cholesterol získaný jak z cirkulujících lipoproteinů, tak z esterů cholesterolu se konvertuje v ovariích na pregnenolon odstraněním 6 uhlíkového fragmentu izokapronové kyseliny. Tato reakce nebo skupina 18

reakcí je rychlost limitujícím krokem v biosyntetických procesech a je kontrolována luteinizačním hormonem (LH) z adenohypofýzy. Pregnenolon tvořený touto reakcí může být konvertován na progesteron nebo 17α-hydroxypregnenolon. Konverze na progesteron vyžaduje působení 3βhydroxysteroiddehydrogenázy a 5 4 ketosteroid izomerázy, která posune dvojnou vazbu z 5 na 4 pozici. Progesteron se secernuje žlutým tělískem ve velikých množstvích po ovulaci. Slouží však také jako prekurzor pro androgeny a estrogeny, protože je substrátem pro P450c17 (17α-hydroxyláza), která přeměňuje progesteron na 17αhydroxyprogesteron v endoplazmatickém retikulu. Po 17α-hydroxylaci může být dvouuhlíkový postranní řetězec odštěpen pomocí enzymu P450c17 (17,20 lyáza) za vzniku androgenů. 17α-hydroxypregnenolon se přeměňuje pomocí P450c17 (lyáza) na dehydroepiandrosteron (DHEA). Tento může být pak přeměněn na androstendion. Relativní příspěvek těchto metabolických cest k produkci androgenů není jasný. Androstendion je hlavní androgen secernovaný ovarii, ale uvolňují se také malá množství DHEA a testosteronu. Estradiol je syntetizován z androgenů skupinou enzymů nazývaných aromatázový komplex nebo systém. Tento proces má tři stupně: hydroxylace methylové skupiny na 19 uhlíku, oxidace této skupiny a hydroxylace v 3 α pozici. Soudí se, že tyto tři kroky nastávají v mikrozomální frakci. Tyto tři hydroxylační kroky vyžadují O 2 a NADPH. Aromatázový enzymový komplex pravděpodobně zahrnuje P450-oxidázu se smíšenou funkcí. Když je substrátem tohoto enzymového komplexu testosteron, vzniká estradiol, kdežto z aromatizace androstendionu vzniká estron. Estron vzniká také z estradiolu působením 17-hydroxysteroiddehydrogenázy, z estronu může dále vznikat estriol působením 16α-hydroxylázy, který však může být vytvářen také přímo z estradiolu působením 16α-hydroxylázy a 17- hydroxysteroiddehydrogenázy nebo aromatizací 16α-hydroxyandrostendionu působením 17-hydroxysteroiddehydrogenázy. Během menstruačního cyklu je regulace biosyntézy a uvolňování kontrolována gonadotropiny, stejně jako lokálními faktory. U mužů 80 % estradiolu pochází z periferní aromatizace testosteronu. U žen jsou androgeny též významnými substráty, protože až 50 % estradiolu v těhotenství vzniká aromatizací androgenů. Konečně je konverze androstendionu na estron hlavním zdrojem estrogenů u postmenopauzálních žen. Aromatázová aktivita je přítomna v tukových 19

buňkách a též v játrech, v kůži a v jiných tkáních. Zvýšená aktivita tohoto enzymu se podílí na estrogenizaci, která je typická pro takové stavy jako je cirhóza jater, hyperthyreóza, stárnutí a obezita. Schéma biosyntézy estrogenů Příloha 5, Obr. 5. Vztah mezi estrogeny a gonadotropiny Hypothalamus a hypofýza tvoří jednotku, která řídí funkci řady endokrinních žláz, mezi něž patří i gonády, a také řadu fyziologických funkcí. Adenohypofýza (přední lalok hypofýzy) secernuje pod kontrolou hypothalamických hormonů řadu hormonů (trofní hormony), které regulují růst a funkci jiných endokrinních žláz nebo působí na metabolické procesy v jiných cílových tkáních. Hypothalamické hormony je možno rozdělit na ty, které se secernují do hypofyzárních portálních cév = hypofýzotropní hormony, a na ty, které se v neurohypofýze (zadní lalok hypofýzy) secernují přímo do krve = neurohypofyzární hormony. Hypothalamické hormony jsou uvolňovány v pulzech a izolovaná adenohypofýza odpovídá lépe na pulzatilní přívod těchto hormonů, než na jejich kontinuální působení. Sekrece většiny adenohypofyzárních hormonů se řídí hormony stimulačními. Některé hypofýzotropní hormony jsou multifunkční. Mezi hypofýzotropní hormony, regulující sekreci hormonů adenohypofýzy patří GnRH (hormon uvolňující gonadotropiny). GnRH, nazývaný rovněž hormon uvolňující luteinizační hormon (LHRH), hormon uvolňující luteotropin (LRH) a luteotropin uvolňující faktor (LRF) je lineární dekapeptid syntetizovaný neurosekrečními buňkami uloženými uvnitř hypothalamu. Tento hormon stimuluje sekreci LH (luteinizační hormon) a FSH (folikuly stimulační hormon) z adenohypofýzy a je důležitý pro jejich syntézu a uvolňování. Uvolňování GnRH je ovlivněno hladinou pohlavních hormonů v krvi, která přichází do hypothalamu. LH a FSH patří mezi gonadotropní hormony, které ovlivňují gonády, regulují ovariální tvorbu estrogenů a progesteronu. Oba hormony mají zpětnovazební inhibiční účinky na hypothalamus i hypofýzu. [44] 2.2 Metabolizmus estrogenů Estrogeny jsou skupina hormonů syntetizovaných v různých tkáních, především pak v ovariích, která kromě estrogenů aktivně syntetizují a secernují různé hormony. 20

Hlavním přirozeným hormonem ovariálních folikulů je 17β-estradiol. U některých druhů je hojnější estron syntetizovaný v řadě tkání. V těhotenství se tvoří relativně více estriolu, a to v placentě. Cirkulující estradiol se rychle přeměňuje oxidací v játrech na estron 17βhydroxysteroidnídehydrogenázou. Malé množství estronu znovu vstupuje do cirkulace, avšak většina je dále metabolizována na 16α-hydroxyestron (který je potom přeměněn na estriol) nebo 2-hydroxyestron, katecholestrogen. Mnoho ze zbývajícího estronu je konjugováno a tvoří estronsulfát. Estriol je většinou přeměňován na estriol-3-sulfát-16- glukuronid před vyloučením ledvinami. Konjugované vylučovací formy estrogenů Příloha 6, Obr. 6. 2.3 Transport, degradace a mechanizmus účinku estrogenů Estrogeny jsou v plazmě silně vázány na plazmatické proteiny. Estradiol se silně váže na transportní globulin, nazývaný globulin vázající sexuální hormony (SHBG) a s menší afinitou se váže také na albumin. Ethinylestradiol se váže jen na albumin. Transportní proteiny vytvářejí rezervoár hormonů v krvi a pro svou poměrně vysokou vazebnou kapacitu patrně vyrovnávají ( pufrují ) náhlé změny v plazmatických hladinách. SHGB je syntetizován v játrech, a protože syntéza je stimulována estrogeny a inhibována androgeny, hladina je dvakrát vyšší u žen než u mužů. Poměr volného a vázaného estradiolu se během menstruačního cyklu výrazněji nemění. Avšak rozdíl ve vazebné schopnosti může mít význam po menopauze nebo u žen s abnormální funkcí ovarií spojenou s nadměrnou produkcí androgenů. Rychlost sekrece ovariálních steroidů se podstatně mění v průběhu menstruačního cyklu a je přímo úměrná jejich syntéze v ovariích. Nenastává jejich skladování: jsou secernovány hned jak jsou vyrobeny. Konjugované steroidy jsou ve vodě rozpustné a nevážou se na transportní proteiny: jsou proto rychle vylučovány žlučí, stolicí a močí. Účinné jsou jen volné frakce hormonu. Díky lipofilní povaze, estrogeny snadno prostupují do nitra buňky. Estrogeny působí na základě své schopnosti vázat se na intracelulární receptory: komplex hormonreceptor se pak váže na specifické oblasti chromatinu nebo DNA (nebo obou) a vyvolává změny v rychlosti transkripce specifických genů. Interakce receptor-dna umožňuje různým transaktivačním doménám každého receptoru působit na aktivitu genů, přilehlých k hormon-responzivnímu elementu (hormone response element, HRE). 21

Zvýšená (nebo snížená) aktivita specifických genů vede ke změnám syntézy specifických proteinů. Tímto způsobem je ovlivněna celá řada metabolických a reprodukčních procesů. [35] Sekvence aminokyselin v molekulách receptorů pro estrogeny (ER) byly odvozeny z analýzy sekvencí bází příslušných cdna. Tyto receptory patří do genové rodiny (používá se i pojem nadrodina ), protože sem patří i deriváty vitaminu A, D, thyroxinu a kortikoidů. Každý receptor má několik funkčních domén. Degradace estrogenů závisí na stadiu menstruačního cyklu a období pre- a postmenopauzálním. Obecně se dá říci, že estrogeny jsou rychle degradovány v játrech s t 1/2 v minutách. Estradiol je nejdříve metabolizován na méně účinný estron a estriol. Dále vznikají neaktivní metabolity a následuje jejich konjugace s glukuronovou a sírovou kyselinou. Existuje i enterohepatální cirkulace a vylučování estrogenů močí. Ethinylestradiol je metabolizován značně pomaleji než estradiol, jeho t 1/2 je 13-27 hodin. Mestranol se v játrech metabolizuje na účinný ethynilestradiol. Měření hladin estrogenů v plazmě a moči má velký diagnostický význam. Hladiny estrogenů jsou přesně známy a ukazují na ovariální funkčnost. Po menopauze klesají hladiny estrogenů zhruba na jednu desetinu normálního množství. U dívek před pubertou nejsou zjistitelné hladiny estrogenů. Během těhotenství se stává placenta hlavním zdrojem estrogenů. Estrogeny, podobně jako jiné steroidní hormony, působí prostřednictvím cytoplazmatických receptorů. Jejich největší koncentrace jsou v reprodukčních orgánech, prsech, hypothalamu, hypofýze, kostech, játrech a dalších tkáních. Označují se jako estrogen-dependentní tkáně. 3. HORMONÁLNÍ ANTIKONCEPCE Pro klinické použití je nyní dostupné veliké množství orálních antikoncepčních prostředků obsahujících estrogeny nebo gestageny (nebo oboje). Tyto přípravky se různí v chemickém složení a jak je možné očekávat, mají mnohé vlastnosti společné, ale jsou zde rovněž rozdíly. Hlavními kritérii pro hodnocení jednotlivých metod ženské antikoncepce je účinnost a tolerance. Podle hormonálního složení kontracepce se dělí preparáty na čistě gestagenní a kombinované, skládající se z estrogen-gestagenních komponent. V této práci byla použita hormonální antikoncepce kombinovaná. Způsob užívání sledované perorální kombinované antikoncepce je cyklický. S výjimkou jednoho přípravku jde 22

o 21 tabletové formy antikoncepce, kdy po 21 denním užívání následuje 7 denní období bez tablet, ve kterém dochází k pseudomenstruaci krvácení ze spádu hormonálních hladin. Preparát Tri-Regol obsahuje 21 tablet s účinnou látkou a 7 placebo tablet. Kromě toho jsou k dispozici preparáty 28 tabletové, které obsahují 24 tablet s účinnou látkou a 4 placebo tablety. Podle dávky hormonu v jednotlivých fázích se dělí přípravky kombinované kontracepce na: monofázické (stejná dávka obou hormonů ve všech tabletách), bifázické (stejná dávka estrogenů v obou fázích preparátu, ve druhé fázi je vyšší dávka progestinu), trifázické (dávky progestinu se mění každých 7 dnů, estrogen až na výjimky zůstává ve stejné dávce) a kombifázické (ve druhé fázi preparátu je nižší dávka estrogenu a vyšší dávka progestinu). Sledovaná antikoncepce je ve všech případech s výjimkou jednoho preparátu monofázická. Antikoncepce Tri-Regol je trifázická, stanovena byla tabletka s nejvyšším obsahem ethinylestradiolu. Dalším kritériem dělení kombinované kontracepce je typ použitého estrogenu (ethinylestradiol) a použitého progestinu. Jiným kritériem dělení je i výše použité dávky ethinylestradiolu (EE2). Preparáty se pak dělí na přípravky vysokodávkové (EE2 40 50 µg), nízkodávkové (EE2 30 35 µg) a s velmi nízkým dávkováním EE2 (15 20 µg). Sledovaná antikoncepce spadá do skupiny s nízkou a velmi nízkou dávkou EE2. Podle způsobu aplikace se dělí hormonální kontracepce na formu perorální, injekční, transdermální, implantátovou. Patří sem i nitroděložní tělísko s levonorgestrelem, který je postupně uvolňován v dávce 20 µg/24 hodin. [15] 3.1 Složení hormonální kontracepce Jediným používaným estrogenem je ethinylestradiol (EE2), dříve používaný mestranol se v ČR v dostupných preparátech nevyskytuje. Obě látky EE2 i mestranol jsou chemicky příbuzné a biologická aktivita mestranolu je vázána na jeho konverzi v ethinylestradiolu. Různorodost hormonální kontracepci přináší kromě dávky EE2 hlavně typy použitého progestinu, které jsou rozděleny podle generací (Tab. 2). Progestiny, používané v hormonální kontracepci, mají pestré farmakodynamické vlastnosti. Některé jsou vlastní účinnou látkou (levonorgestrel, gestoden, norethisteron, dienogest), jiné jsou prohormony (lynestrenol, desogestrel), u dalších je aktivita dána působením účinné látky i metabolitů (norgestimát). Progestiny mohou mít reziduální, zbytkovou aktivitu nebo minimální, klinicky nevýznamnou androgenní aktivitu, 23

nebo naopak mohou mít působení antiandrogenní, popřípadě mohou mít hlavní účinky antimineralokortikoidní. Vybrané zástupce progestinů jsou označeny v Tab. 2 tučným písmem. Na základě chemické struktury a do jisté míry i historického vývoje se můžou gestageny rozdělit do dvou základních skupin. První skupina je odvozená od 17α-hydroxyprogesteronu (pregnanu): progesteron a příbuzné látky progesteron a jeho izomery; deriváty 17-oxyprogesteronu: chlormadinon acetát, cyproteron acetát, medroxyprogesteron acetát; deriváty norprogesteronu. Druhou skupinu tvoří deriváty 19-nortestosteronu. Deriváty 19-nortestosteronu se dále dělí na ethinylované deriváty estranu, mezi které patří norethisteron a lynestrenol, na ethinylované deriváty 13-ethylgonanu, jejichž zástupci jsou levonorgestrel, gestoden, desogestrel a norgestimat, a na neethinylovaný derivát estranu dienogest. Poslední čtyři zástupci jsou pak často uváděny jako tzv. nové progestiny, díky svým výjimečným vlastnostem, vyplývajícím především z minimální androgenní aktivity. [29] Tab. 1 Syntetické gestageny a jejich rozdělení dle základní molekuly 17 - alfa hydroxyprogesteron: 19 - norsteroidy: 17 alfa spironolakton: CMA - chlormadinon acetát, ESTRANY: GONANY: DRSP drospirenon CPA - cyproteron acetát DNG dienogest, DSG desogestrel, LYN lynestrenol, GSD gestoden, NES norethisteron LNG levonorgestrel, NGM norgestimat Chemická struktura prakticky všech používaných progestinů se odvozuje od CPPP (cyklopentanoperhydrofenantrenu). Společným rysem účinných látek je oxo- (tj. keto) skupina na C3 a dvojná vazba mezi C4 a C5, které jsou nutné k tomu, aby sloučenina byla schopna vazby na receptor pro progesteron. Progestiny používané v perorálních kontraceptivech, které tyto strukturální znaky nemají, jsou ve skutečnosti prekurzory a jsou po podání rychle metabolizovány na vlastní účinnou látku. Progestiny mají obecně nejen efekt gestagenní, ale i další endokrinofarmakologické účinky. Efekt antiestrogenní přispívá ke kontracepční aktivitě, dále pak efekt androgenní. Všechny progestiny, včetně přirozeného progesteronu vykazují i relativní vazebnou afinitu k androgenním receptorům. Progestiny III. generace se pro svoji nízkou afinitu k androgenním receptorům někdy nazývají non-androgenní. 24

Jejich nízká androgenicita je jednou z hlavních vlastností, která je odlišuje od gestagenů II. generace. K progestinům s reziduální androgenní aktivitou patří norethisteron, prohormon lynestrenol s metabolitem norethisteronem, dále levonorgestrel. Mezi progestiny s minimální androgenní aktivitou se řadí prohormon desogestrel s metabolitem etonogestrelem, gestoden, prohormon norgestimat s metabolity norelgestorminem a levonorgestrelem. Progestiny s antiandrogenní aktivitou jsou cyproteron acetát, chlormadinon acetát a dienogest, k novým progestinům s antimineralokortikoidní aktivitou patří drospirenon. Optimální volba preparátu záleží právě na androgenní či antiandrogenní aktivitě použitého progestinu. [30] Tab. 2 Rozdělení progestinů do jednotlivých generací První generace Druhá generace Třetí generace Čtvrtá generace Ostatní etynodiol diacetát norgestrel desogestrel chlormadinon progesteron lynestrenol levonorgestrel gestoden acetát dydrogesteron norethisteron norgestrion norgestimát cyproteron medroxyproge- norethynodrel acetát steron acetát medrogeston tibolon drospirenon Současným trendem v dávkování je snižování dávky estrogenů až k 15 µg. Přípravky s velmi nízkou dávkou EE2 (20 µg) a s nízkou dávkou EE2 (30 40 µg) jsou rozděleny podle použitého progestinu v Tab. 3, 4, 5. Následující tabulky uvádí vybrané druhy kombinované hormonální antikoncepce: Tab. 3 Přípravky s nízkou dávkou estrogenu (EE 30 40 µg) v kombinaci s: progestiny s reziduální androgenní Minisiston aktivitou monofázické (EE2 30 µg + levonorgestrel 125 µg) progestiny s reziduální androgenní aktivitou Tri-Regol 21+7 (má 7 placebo tablet) trifázické 1. fáze: EE2 30 µg + levonorgestrel 50 µg 2. fáze: EE2 40 µg + levonorgestrel 75 µg 3. fáze: EE2 30 µg + levonorgestrel 125 µg progestiny s minimální androgenní Minulet aktivitou monofázické (EE2 30 µg + gestoden 75 µg) Tab. 4 Přípravky s nízkou dávkou estrogenu (EE 30 40 µg) v kombinaci s: progestiny s antiandrogenní aktivitou, monofázické Diane-35 (navíc 7 placebo tbl) (EE2 35 µg + cyproteron acetát 2 mg) progestiny s antimineralokortikoidní aktivitou, monofázické Yadine (EE2 30 µg + drospirenon 3 mg) 25

Tab. 5 Přípravky s velmi nízkou dávkou estrogenu (EE 15 20 µg) v kombinaci s: progestiny s minimální androgenní aktivitou, přípravky monofázické Logest (EE2 20 µg + gestoden 75 µg) Mercilon (EE2 20 µg + desogestrel 150 µg) Lindynette (EE2 20 µg + gestoden 75 µg) V práci byly sledovány kombinované hormonální přípravky obsahující definované množství EE2 a zástupce progestinů II, III a IV generace. Z přípravků s nízkou dávkou estrogenu byly sledovány Diane 35, Yadine, Minisiston, Minulet a Tri- Regol 2.fáze a s velmi nízkou dávkou estrogenu byl sledován Mercilon, Logest a Lindynette 20. 3.2 Farmakokinetické vlastnosti 3.2.1 Estrogenní složka Ethinylestradiol (EE2) Orálně podaný ethinylestradiol je rychle a kompletně absorbován. Nejvyšší sérové koncentrace okolo 33 pg/ml je dosaženo po jednorázové orální dávce během 1-2 hodin. Poté klesá hladina ethinylestradiolu ve dvou fázích charakterizovaných poločasem 1-2 hodiny a asi 20 až 24 hodin. Během absorpce a prvního průchodu játry je ethinylestradiol metabolizován, což způsobuje individuálně variabilní orální biologickou dostupnost. Absolutní biologická dostupnost je přibližně 60 % následkem presystémové konjugace a first-pass metabolizmu. Zřejmý distribuční objem ethinylestradiolu je asi 5 l/kg a rychlost metabolické clearance ze séra asi 5 ml/min/kg. Ethinylestradiol je vysoce, ale nespecificky vázán na sérový albumin (přibližně 98,5 %) a indukuje vzestup sérové koncentrace SHGB a kortikoidy vážícího globulinu (CBG). Asi 2 % z celkové hladiny látky je přítomno ve volné formě. Ethinylestradiol podléhá presystémové konjugaci jak ve stěně tenkého střeva, tak v játrech. Ethinylestradiol je primárně metabolizován aromatickou hydroxylací, vzniká však velké množství různých hydroxylovaných a methylovaných metabolitů, které jsou přítomny jako volné metabolity nebo jako konjugáty s glukuronidy a sulfáty. Ethinylestradiol není ve významném množství vylučován v nezměněné formě. Metabolity ethinylestradiolu jsou vylučovány močí a žlučí v poměru 4:6. Poločas exkrece metabolitů je asi 1 den. [31] 26

3.2.2 Gestagenní složky Norgestrel (NOR) Norgestrel je progestin používaný v hormonální antikoncepci. Norgestrel je směs dvou stereoizomerů, dextro-norgestrel and levo-norgestrel. Jen levonorgestrel je biologicky aktivní. Levonorgestrel (l-norgestrel nebo D-norgestrel) je syntetický progestogen. Z hlediska chemického se jedná o levotočivý enanciomer racemické směsi norgestrelu. Je to gonan progestinu vzniklý derivací 19-nortestosteronu. Levonorgestrel (LNG) Levonorgestrel je historicky prvním zástupcem skupiny derivátů 13- ethylgonanu. Záměna ethylové skupiny za skupinu methylovou v poloze 13 propůjčuje levonorgestrelu ve srovnání s estrany odlišné biologické vlastnosti, především výraznější gestagenní účinek. Po orálním podání je levonorgestrel kompletně biologicky dostupný. Je rychle absorbován. Maximální sérové koncentrace je dosaženo za 1-2 hodiny po požití. Nebyl zjištěn efekt prvního průchodu. Poločas v distribuční fázi je 2 hodiny a v eliminační fázi 10-24 hodin. Hodnoty plazmatické clearance jsou 106 ml/h/kg. Malé množství levonorgestrelu přechází do mateřského mléka. V plazmě je levonorgestrel z 93-95% vázán na bílkoviny, především na SHBG. Současné užití ethinylestradiolu má za následek zvýšení biosyntézy SHBG a tudíž jeho vazebné kapacity. Levonorgestrel je vylučován z velké části jako redukované a nebo hydroxylované metabolity, převážně konjugací s kyselinou glukuronovou nebo sírovou. Až 60% metabolitů se vylučuje ledvinami. Přibližně 30% je vylučováno stolicí. [32] Gestoden (GSD) Gestoden se liší od levonorgestrelu dodatečnou dvojnou vazbou v poloze 15. Nemá žádnou estrogenní aktivitu (působí anti-estrogenně) a jen velmi nízkou zbytkovou androgenní aktivitu. Má velmi slabé anti-mineralokortikoidní účinky. Orálně podaný gestoden je rychle a kompletně absorbován. Maximální sérové hladiny je dosaženo asi za 1 hodinu po požití jednotlivé dávky. Poté klesá sérová hladina gestodenu ve dvou fázích charakterizovaných poločasem 0,1 hodiny a asi 18 hodin. Biologická dostupnost je okolo 99 %. Zřejmý distribuční objem gestodenu je 0,7 l/kg a rychlost metabolické clearance ze séra je 0,8 ml/min/kg. Gestoden je vázán na sérový albumin a na sex hormone binding globulin (SHGB). Pouze 1-2 % z celkové 27

sérové koncentrace je přítomno ve formě volného steroidu, 50-70 % je specificky vázáno na SHGB. Ethinylestradiolem indukované zvýšení SHGB ovlivňuje množství gestodenu vázáného na sérové proteiny, což má za následek zvýšení frakce vázané na SHGB a snížení frakce vázané na albumin. Gestoden se z velké části se metabolizuje redukcí, oxidací a konjugací. Metabolity se vylučují z 50 % močí a z 50 % žlučí. Gestoden není vylučován v nezměněné formě. Poločas exkrece metabolitů je asi 1 den. Gestoden je metabolizován obvyklou cestou steroidního metabolizmu. Gestoden je silným inhibitorem enzymů cytochromu P-450, které se účastní metabolizmu steroidů. U kombinovaných přípravků obsahujících gestoden však nebylo prokázáno zpomalení metabolizmu ethinylestradiolu. [31, 12] Desogestrel (DSG) Desogestrel je typickým proléčivem. Mateřská látka nemá žádnou afinitu k progesteronovému receptoru. Velmi rychle se však metabolizuje ve sliznici tenkého střeva a v játrech. Desogestrel je během tří hodin téměř kompletně eliminován z plazmy. Aktivním metabolitem je 3-ketodesogestrel (3-KDSG), jehož biologická dostupnost je asi 75 %. Určitý podíl desogestrelu je konjugován přímo na glukuronidy a sulfáty, malé procento je metabolizováno na levonorgestrel. Maximální plazmatické koncentrace je dosaženo dříve po přímém podání 3-KDSG, z hlediska biologického účinku je však výhodnější využití jeho proléčiva (desogestrelu). In vitro se 3-KDSG váže na androgenní receptor se stejnou afinitou jako gestoden. Relativní vazebná afinita k progesteronovému receptoru je ve srovnání s gestodenem a levonorgestrelem nejvyšší. 3-KDSG se váže z větší části na albumin (65 %), z menší části na SHBG. Desogestrel má eliminační poločas cca 20 hod. [31] Cyproteron acetát Po orálním podání je cyproteron acetát rychle a kompletně absorbován. Vrcholu sérové koncentrace je dosaženo asi za 1,6 hodiny po užití. Biologická dostupnost je okolo 88 %. Cyproteron acetát je výlučně vázán na plazmatický albumin. Asi 3,5 4 % celkové sérové koncentrace je přítomno ve volné formě. Ethinylestradiolem indukované zvýšení hladiny SHGB nemá vliv na proteinovou vazbu cyproteron acetátu. Distribuční objem je okolo 986 ± 437 l. 28

Cyproteron acetát je téměř kompletně metabolizován. Hlavní metabolit v plazmě byl označen jako 15β-OH-CPA, který je tvořen cytochromem P450 enzymu CYP3A4. Sérová clearance je 3,6 ml/min/kg. Sérová hladina cyproteron acetátu klesá ve dvou vylučovacích fázích charakterizovaných poločasy 0,8 hodiny a 2,3 3,3 dne. Cyproteron acetát je částečně vylučován v nezměněné formě. Jeho metabolity jsou vylučovány žlučí a močí v poměru 1:2. Poločas vylučování metabolitů je asi 1,8 dne. Farmakokinetika cyproteron acetátu není ovlivněna hladinami SHGB. Po denním podávání přípravku se zvýší hladina asi 2,5 krát a dosahuje rovnovážného stavu ve druhé polovině léčebného cyklu. [31] Drospirenon Drospirenon je syntetický progestin s ojedinělým farmakologickým profilem. Je jediným zástupcem této skupiny s antialdosteronovými účinky přirozeného progesteronu. Zároveň má antiandrogenní účinky a neblokuje tak příznivé účinky estrogenů. V kombinaci s estrogeny byl v klinických studiích zkoušen jako perorální kontraceptivum a kontinuální hormonální terapie. V těchto studiích byla ověřena jeho účinnost a bezpečnost s některými příznivými účinky, zejména na kardiovaskulární systém (pokles tělesné hmotnosti, pokles krevního tlaku, příznivý vliv na hladiny lipidů). Po perorálním podání se drospirenon velice rychle a téměř kompletně absorbuje. Maximálních plazmatických koncentrací je po jednorázové aplikaci dosaženo přibližně za 1 2 hodiny. Biologická dostupnost je udávána v intervalu 76 až 85 %, přičemž její hodnota není prakticky ovlivněna současným příjmem potravy. Poté, co je drospirenon absorbován, je vázán na sérový albumin, a to z 55 až 97 %, přičemž pouze 3 5 % jeho celkové koncentrace je přítomno ve formě volného steroidu. Distribuční objem drospirenonu je 3,7 4,2 l/kg. Drospirenon je v organizmu prakticky kompletně biotransformován. K jeho nejdůležitějším metabolitům přitom patří jeho kyselá forma, vzniklá otevřením laktonového kruhu, a 4,5-dihydrodrospirenon-3-sulfát oba metabolity vznikají bez zapojení cytochromu P-450. Rychlost metabolické clearance drospirenonu z plazmy je 1,2 1,5 ml/min/kg. Plazmatické koncentrace drospirenonu klesají ve dvou fázích. Konečná dispoziční fáze je charakterizována poločasem přibližně 31 hodin. Metabolity 29

drospirenonu jsou vylučovány žlučí a močí v poměru 1,2 až 1,4. Poločas vylučování metabolitů močí a stolicí je asi 1,7 dne. [9] Vzorce progestinů Příloha 7, Obr. 7. 4. HYDROLÝZA KONJUGOVANÝCH LÉČIV Užívaná antikoncepce, ale i estrogenní látky endogenního a exogenního původu (xenobiotika) procházejí v živém organizmu složitým systémem biotransformace. Metabolizmem je vyloučena jen velmi malá část původních sloučenin, největší podíl tvoří konjugované sloučeniny, jak je popsáno v části farmakokinetické vlastnosti jednotlivých komponent antikoncepce. Výsledkem biotransformace je nejen změna toxicity a biologické aktivity, ale také zvýšení rozpustnosti a tím usnadnění vylučování. Celý systém biotransformace lze rozdělit do dvou fází. První fáze, do které se řadí oxidační, redukční a hydrolytické reakce, může být i přípravou pro druhou fázi, do které se řadí tvorba různých konjugátů s polárními kyselinami, např. s kyselinou glukuronovou, kyselinou sírovou, octovou, benzoovou a zřejmě také fosforečnou a některými aminokyselinami. Nejvíc však jsou zastoupeny konjugáty s kyselinou glukuronovou-glukuronáty a v menší míře s kyselinou sírovou-sulfáty. Ostatní konjugáty tvoří zanedbatelný podíl. Příslušný konjugát zvyšuje polárnost původní sloučeniny a tím i rozpustnost v polárním biologickém prostředí, což má za následek zrychlení vylučování močí. Tím, že konjugáty jsou biologicky neaktivní, je tento systém jedním z důležitých článků bioregulace. Zatím nevysvětleno zůstává zjištění, že polární konjugáty se mohou nacházet i na druhé straně lipofilní biologické membrány v uzavřeném intracelulárním prostoru. Glukuronáty (glukuronidy) jsou sloučeniny léčiv s kyselinou glukuronovou C 6 H 10 O 7. Jde o několik typů vazeb. Alkoholy a fenoláty jsou vázány éterickou vázbou a tvoří konjugáty typu R-O-C 6 H 9 O 7. Sloučeniny s karboxylovou skupinou (karboxylové kyseliny) jsou vázány estery za vzniku konjugátu typu ROO C 6 H 9 O 7. Hydroxylaminy poskytují příslušné amidy (tzv. N-glukuronidy). Trioly vytvářejí S-glukuronidy obdobné O-glukuronidům. Pro analytiky bude velmi závažná vazba stabilita příslušných konjugátů. Poměrně nejstálejší jsou konjugáty glukuronové kyseliny vázané éterickou vazbou 30

s alkoholy a fenoly s výjimkou sloučenin, kde hydroxylová skupina je tvořena oxo-enol tautomerií. Některé esterické konjugáty jsou snadno hydrolyzovány v alkalickém prostředí. Tím lze vysvětlit vyšší koncentrace nekonjugovaných (volných) látek v alkalické moči. Některé N-glukuronidy jsou stálé jen při neutrálním ph. Sulfáty vznikají reakcí kyseliny sírové s alkoholy a fenoly za vzniku příslušných esterů obecného vzorce R-O-SO 4. Aby se vytvořil správný obraz o aktuálních možnostech účinku léčiva v biologickém prostředí, mělo by se kromě vazeb na bílkoviny a tím i dočasné inaktivace sledovat i množství léčiva pevně vázaného jako konjugát. Tento problém je zvlášť aktuální při analýze moči, kde převážná většina metabolitů léčiv je ve formě dobře rozpustných kojugátů. Stanovení nekonjugovaných (volných) a konjugovaných (vázaných) forem léčiv v moči skýtá další možnost komplexního vysvětlení jejich účinků. Musí se však přihlédnout k typu konjugátu a podle stability vazby volit podmínky dělení nekonjugovaných forem od příslušných konjugátů. Rozštěpení konjugátů se může provést několika způsoby. Kyselá hydrolýza Pomocí silných anorganických kyselin se může konjugát rozštěpit za uvolnění původní sloučeniny příp. i metabolitu, který prošel změnou v první fázi biotransformace. Pro tyto účely není vhodná kyselina sírová (tvorba barevných produktů). Všeobecně se nejčastěji používá kyselina chlorovodíková. V práci s močí byl použit postup kyselé hydrolýzy, který je podrobněji popsán v praktické části. Enzymová hydrolýza Příslušné konjugáty jsou štěpeny specifickými enzymy. Glukuronáty jsou štěpeny enzymem beta-glukuronidázou, který se vyskytuje v játrech savců, v trávicích šťávách (succus entericus) některých měkkýšů (např. Helix pomatia) a také jako adaptační produkt při kultivaci některých bakterií (E.coli) v prostředí glukuronátů. Aktivita tohoto hydrolytického enzymu je závislá na ph a liší se podle provenience enzymu. Sulfáty jsou štěpeny enzymem sulfatázou, jejíž optimální ph leží kole 5 až 7. Inkubace se obvykle provádí při laboratorní teplotě 12 až 24 hodin. Doba hydrolýzy se může značně zkrátit přidáním koncentrovanějšího roztoku enzymu a zvýšením teploty. [2] 31

5. ESTROGENY V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ 5.1 Úvod Potenciál určitých chemických látek ovlivňovat endokrinní systémy a následně reprodukci a vývoj lidské a zvířecích populací, je v současné době velmi dobře poznán. Estrogenní hormony a sloučeniny vykazující estrogenní aktivitu se běžně vyskytují v odpadních a povrchových vodách. Sloučeniny s estrogenní aktivitou jsou rozsáhlou skupinou látek antropogenního i přírodního původu, které mají určité strukturní rysy podobné jako hormon estrogen a v důsledku toho jsou schopné jej imitovat. Patří do skupiny endokrinních disruptorů, které EPA (Environmental Protection Agency Úřad pro ochranu životního prostředí) definuje jako exogenní látky, které interferují se syntézou, sekrecí, transportem, vazbou, účinkem nebo rozkladem přirozených hormonů, jež jsou v těle odpovědné za homeostázi, reprodukci, vývoj nebo chování. [14] Existují významné důkazy o tom, že populace lidské i volně žijících organizmů byly a jsou škodlivě ovlivňovány expozicí chemickými látkami v prostředí, což je potvrzeno především modulací různých endokrinních systémů. Řada vědeckých studií z poslední doby popisuje endokrinní abnormality u specifických populací ryb, ptáků, savců i člověka. [14] Steroidní hormony jsou člověku i živým organizmům vlastní a jsou nezbytné pro plnění nejrůznějších funkcí v těle. Do prostředí jsou vylučovány metabolizmem a právě tehdy mohou představovat riziko nejen pro organizmy, ale i pro lidskou populaci, zvláště dostanou-li se do potravního řetězce. Mezi estrogeny patří i látky synteticky vyrobené, které se používají k nejrůznějším účelům, zejména jako antikonceptiva a k léčbě nemocí spojených s hormonálními poruchami. Nezanedbatelným zdrojem steroidních estrogenů jsou odpady z chovu hospodářských zvířat, jejichž exkrementy obsahují v závislosti na původci 17α-estradiol, 17β-estradiol, estron a estriol, a to konjugované i volné. [20] Kontaminovány bývají také nádrže s užitkovou vodou na farmách nebo v blízkosti pastvin. [20] Látky s estrogenní aktivitou, obsažené ve vodním prostředí, mohou ovlivňovat faunu a jsou hlavním původcem feminizace ryb. Průzkumy ukázaly, že hlavními látkami představujícími riziko pro populace organizmů jsou přirozené sloučeniny estrogenů: estron, 17β-estradiol, estriol, dále syntetický ethinylestradiol. Výčet steroidních estrogenů je rozsáhlý a i další sloučeniny mohou být důvodem k zamyšlení. 32