V znam signální cesty EGFR a prediktivní markery cílené léãby u karcinomû hlavy a krku

V znam signální cesty EGFR a prediktivní markery cílené léãby u karcinomû hlavy a krku MUDr. Jana Neuwirthová; MUDr. Pavel Smilek, Ph.D.; MUDr. Zdeněk Mechl, CSc.; prof. MUDr. Rom Kostřica, CSc. Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku FN MU u sv. Anny v Brnû Souhrn Neuwirthová J, Smilek P, Mechl Z, Kostřica R.. Remedia 2009; 19: 52 56. Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) hraje významnou úlohu v kancerogenezi, a stal se proto cílovou strukturou nových metod léčby nádorů. Zavádění inhibitorů EGFR do praxe probíhá současně s výzkumem molekulárně-genetických prediktivních markerů. Předmětem diskusí jsou nejrůznější genetické alterace v signální cestě EGFR, jako je amplifikace genu pro EGFR, EGFRvIII, mutace tyrozinkinázové domény, K-ras, STAT3 aj. Klíčová slova: receptor pro epidermální růstový faktor inhibitor EGFR prediktivní marker mutace tyrozinkinázové domény EGFRvIII K-ras STAT3. Summary Neuwirthova J, Smilek P, Mechl Z, Kostrica R. The role of the EGFR signaling pathway and predictive markers of response to targeted therapy for head and neck cancer. Remedia 2009; 19: 52 56. The epidermal growth factor receptor (EGFR) plays an important role in carcinogenesis and therefore has become a target structure for novel cancer therapies. The introduction of EGFR inhibitors into practice is coupled with research into molecular genetic predictive markers. Discussed are various genetic alterations in the EGFR signaling pathway such as EGFR gene amplification, EGFRvIII, tyrosine kinase domain mutation, K-ras mutation, STAT3 activation, etc. Key words: epidermal growth factor receptor EGFR inhibitor predictive marker tyrosine kinase domain mutation EGFRvIII K-ras STAT3. Prediktivní a prognostické markery V zkumy zamûfiené na hledání markerû, které by mohly správnû urãit prognózu onemocnûní (prognostické faktory) a najít vhodn typ terapie pro konkrétního pacienta (prediktivní faktory), patfií mezi jednu z nejvíce se rozvíjejících oblastí klinické i experimentální onkologie. Markery je moïno v obecném smyslu rozdûlit na molekulárnû-genetické a klinické. Cílem hledání prediktivních markerû v onkologii je pfiedev ím volba nejvhodnûj í metody léãby u konkrétního pacienta, tedy individualizace terapie. Jedná se nejen o rozhodování mezi chirurgickou a konzervativní léãbou (chemoradioterapií), ale i o pfiípady, kdy se zvaïuje rozsah adjuvantní léãby (napfi. alterovaná frakcionace nebo chemoradioterapie versus radioterapie samotná). Zatím se fiídíme pfiedev ím histologick m typem nádoru, jeho lokalizací, stupnûm diferenciace (tzv. gradingem), anatomick m rozsahem nemoci (TNM klasifikací), celkov m zdravotním stavem pacienta a u pfiípadû adjuvantní léãby i rozsahem regionálních metastáz, pozitivitou resekãních okrajû, perineurálním ífiením nádoru apod. Na to, aby mohl b t jak koli prediktivní marker zaveden do bûïné praxe, musí splnit urãité podmínky. Samozfiejmostí je dostateãná senzitivita, specificita, technická proveditelnost, cena vy etfiení apod. PfiestoÏe je celosvûtovû pfiedmûtem v zkumu velké mnoïství markerû, pfiínos pro praxi má ve v sledku jen malé procento z nich. Znaãn m problémem je sloïitost vztahû mezi jednotliv mi signálními dráhami, které se vzájemnû ovliv- Àují, slibné se proto zdají multivariaãní anal zy více markerû souãasnû. V znam prediktivních faktorû stoupá se zavedením inhibitorû EGFR do praxe. U cílené léãby obecnû nalézáme v znamnûj í korelace s prediktivními faktory neï u chemoterapie, neboè je zamûfiena na blokádu specifického proteinu v signální dráze nádorové buàky. Rodina receptorû pro rûstové faktory erb/her Receptor pro epidermální rûstov faktor (epidermal growth factor receptor, EGFR, HER1 neboli erb-b1) patfií do rodiny transmembránov ch receptorû pro rûstové faktory erb/her, kam dále fiadíme HER2/neu (erbb2), HER3 (erbb3) a HER4 (erbb4). Tyto receptory mají extracelulární doménu, na kterou se váïe ligand, transcelulární doménu a intracelulární doménu, zprostfiedkovávající tyrozinkinázovou aktivitou pfienos signálu do buàky. Mezi hlavní kaskády pfiena eãû signální cesty EGFR patfií Ras/ Raf/MAPK (mitogen-activated protein kinase) aktivující proliferaci bunûk, STAT (signal transducers and activators of transcription) a PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)/ Akt s vlivem na pfieïívání bunûk (obr. 1). Kaskády v signální cestû EGFR lze aktivovat i jin mi receptory (GPCR, receptor spfia- Ïen s G-proteinem, PDGFR, receptor pro rûstov faktor z destiãek, IGFR, receptor pro inzulinov rûstov faktor nebo receptory hormonû). EGFR hraje klíãovou roli v kancerogenezi, jeho signální cesta zpûsobuje u nádorû aktivaci bunûãného dûlení, inhibici apoptózy, angiogenezi, metastazování, ale i rezistenci na radioterapii, chemoterapii a hormonální léãbu (obr. 2). MnoÏství receptorû na povrchu buàky podléhá za normálních okolností regulaci. Aktivovan receptor s navázan m ligandem je signálem pro internalizaci endocytózou (down-regulace), následnû probûhne jeho degradace v lysozomech anebo je recyklován zpût na bunûãnou membránu. MÛÏe docházet k dysregulaci, která vede k patologické aktivaci signální cesty EGFR, a tím k negativní prognóze onemocnûní a) zv - enou expresí ligandû, b) aktivujícími mutacemi receptoru nebo pfiena eãû v signální cestû EGFR, c) amplifikací genu pro EGFR, d) aktivací signální cesty jin mi receptory, neï je EGFR, nebo nereceptorov mi tyrozinkinázami [1, 2]. 52

Exprese EGFR Zv ená exprese EGFR je nalézána u mnoha nádorû, jako jsou karcinomy hlavy a krku (70 100 %), jícnu (30 70 %), plic (nemalobunûãn karcinom plic, NSCLC 40 80 %), kolorekta (35 40 %), prsu (14 91 %), ledvin, mozku (maligní gliomy 40 50 %), pankreatu (30 50 %), moãového mûch fie (31 48 %), ovarií (35 70 %), prostaty aj. [3, 4]. Overexprese u tûchto nádorû mûïe korelovat s hor í prognózou a s hor ím pfieïitím [5]. Ze v ech epiteliálních nádorû exprimujících EGFR je nejvy í zastoupení nalézáno právû u spinocelulárních karcinomû hlavy a krku (HNSCC) [1]. Nebyla v ak vysledována pfiímá úmûra k odpovûdi na léãbu inhibitory EGFR [6, 7]. Inhibice EGFR u HNSCC DÛvodem, proã se na EGFR zamûfiila v poslední dobû taková pozornost, je jeho vysoká exprese a klíãov signální v znam u mnoha nádorû. Stal se specifick m terãem tzv. cílené léãby (targeted therapy) zaloïené na extracelulární nebo intracelulární blokádû receptoru. Z extracelulárních inhibitorû byly do klinické praxe zavedeny rûzné druhy monoklonálních protilátek a na úrovni blokády tyrozinkinázové domény se osvûdãily intracelulární nízkomolekulární inhibitory. Intracelulární inhibitory procházejí bunûãnou membránou a váïou se na ATP vazebné místo tyrozinkinázové domény (kompetice s ATP). Monoklonální protilátky jsou vysokomolekulární, a v organismu proto na rozdíl od nízkomolekulárních inhibitorû neprocházejí bunûãn mi membránami ani hematoencefalickou bariérou. Mají afinitu k extracelulární doménû EGFR (kompetice s pfiirozen mi ligandy), ãímï zabraàují navázání ligandu, dimerizaci a aktivaci receptoru, následnû je EGFR internalizován a dochází k jeho degradaci [8]. EGFR kromû klíãového v znamu v kancerogenezi v ak hraje svoji roli i u normálních tkání, jako jsou stfieva, kûïe nebo ledviny; pfii léãebné inhibici tohoto receptoru z toho proto vypl vají neïádoucí úãinky, jako je prûjem, koïní vyráïka [9] nebo hypomagnezémie (blokáda EGFR interferuje s transportním mechanismem magnesia, ãímï zabraàuje zpûtnému vychytávání magnesia v Henleovû kliãce ledvin) [10, 11]. Extracelulární inhibitory u HNSCC vykazují lep í úãinnost neï inhibitory intracelulární, coï lze pfiisoudit jinému mechanismu úãinku. Monoklonální protilátky vedle zablokování signální cesty receptoru aktivují na protilátkách závislou bunûãnou cytotoxicitu (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity). Tato aktivace imunitního systému proti nádoru je spu tûna navázáním protilátky na nádorovou buàku, av ak je specifická pouze pro protilátky tfiídy IgG1, jejichï zástupcem je napfi. Obr. 1 Přenašeče v signální cestě EGFR hlavní kaskády; EGFR receptor pro epidermální růstový faktor; MAPK mitogen-activated protein kinase; STAT signal transducers and activators of transcription; PI3K phosphatidylinositol 3-kinase. cetuximab [12]. Mezi dal í imunitní mechanismus patfií aktivace komplementu a na komplementu závislá cytotoxicita (complement-dependent cytotoxicity) [1, 13]. V nedávné dobû bylo navíc prokázáno, Ïe antiapoptotick úãinek signální cesty EGFR je kromû tyrozinkinázové aktivity zprostfiedkován i interakcí a stabilizací transportního systému pro glukózu (SGLT1, sodium-dependent glucose cotransporter 1), kter udrïuje intracelulární hladinu glukózy, dûleïitou pro bunûãné pfieïívání [14]. Jin mi slovy, na základû tohoto zji tûní lze usuzovat, Ïe zablokování tyrozinkinázové domény receptoru zpûsobí pouze parciální blokádu signální cesty EGFR, coï vysvûtluje vedle chybûní imunitní odpovûdi také rozdíln terapeutick úãinek (obr. 3). Dal- ím faktem je, Ïe tyrozinkinázové inhibitory EGFR mohou b t povaïovány za ménû specifické neï monoklonální protilátky, neboè mohou v buàce inhibovat i jiné tyrozinkinázové cesty ovlivàující i normální bunûãné funkce. Do indikace karcinomû hlavy a krku byly zavedeny extracelulární inhibitory, které prokázaly supraaditivní efekt pfii kombinaci s radioterapií i chemoterapií. V souãasné dobû je v âr zaregistrován pouze cetuximab, a sice v kombinaci s radioterapií v indikaci lokoregionálnû pokroãil ch HNSCC v léãbû první linie. SvÛj pfiínos prokázal také pro recidivující/metastatické onemocnûní, v této indikaci se v souãasnosti jeho registrace u nás teprve chystá. S cetuximabem je spojeno v raznû niï í mnoïství neïádoucích úãinkû ve srovnání s klasickou chemoterapií, nesetkáváme se s toxick m pûsobením na játra, ledviny, krvetvorbu, srdce ãi nervovou soustavu. Cílená léãba je v ak finanãnû nároãnûj í a ãasto se u ní vyskytuje závislost úãinku na specifick ch genetick ch alteracích v populaci nádorû. Proto se musí souãasnû se zavádûním inhibitorû EGFR do praxe rozvíjet i v zkum molekulárnû-genetick ch prediktivních markerû, které mohou v znamn m zpûsobem ovlivnit nákladovou efektivitu (cost-effectiveness) této léãby. Genetické alterace v signální cestû EGFR a jejich klinick v znam Amplifikace genu pro EGFR Amplifikace EGFR znamená zmnoïení poãtu genû EGFR v buàce. V onkologii byl pfii její pfiítomnosti vysledován vztah k negativní prognóze mnoha nádorû, av ak zároveà i pozitivní prediktivní v znam pfii léãbû inhibitory EGFR. Pfiíkladem mûïe b t 53

zaznamenaná lep í odpovûì kolorektálních karcinomû na extracelulární inhibici EGFR [15, 16]. In vitro byla u HNSCC prokázána souvislost mezi poãtem kopií EGFR genu a senzitivitou nejen na gefitinib, ale i na cetuximab [17]; nyní se ãeká, aï laboratorní v sledky potvrdí data z klinick ch studií. Jednou ze sporn ch otázek stále zûstává, jak m mechanismem zpûsobuje amplifikace genu pro EGFR lep í odpovûì na cílenou léãbu. Hypoteticky si to lze vysvûtlit tak, Ïe zmnoïení poãtu genû v chromozomu obecnû ukazuje na klíãovost exprimovaného proteinu v signální soustavû nádorové buàky, a proto blokáda této signální cesty mûïe mít lep í léãebn efekt neï u nádorov ch bunûk bez pfiítomnosti genové amplifikace. Mutace K-ras genu K-ras je jedním z pfiena eãû v signální cestû EGFR a pfii jeho mutaci dochází ke kontinuální aktivaci signální cesty nezávisle na aktivaci nebo inhibici receptoru. Nemutovan ras protein má schopnost inaktivace ze stavu GTP do GDP pomocí GTPázy. Aktivující bodové mutace v exonu 1 K-ras genu (v kodonech 12 a 13) sniïují hydrolytickou aktivitu GTPázy, coï má za následek kontinuální aktivaci K-ras proteinu. Ras mutace byla nalezena u mnoha typû nádorû, napfi. u nádorû plic, kolorekta, pankreatu ãi HNSCC. Její pfiítomnost je spojována s negativní prognózou onemocnûní a jedná se o negativní prediktivní marker v souvislosti se standardní léãbou i s terapií inhibitory EGFR. V souãasné dobû se v mnoha zemích vãetnû âr detekuje v rámci predikce úãinnosti cetuximabu u kolorektálních karcinomû, u kter ch se udává relativnû vysok v skyt (35 45 %) [18]. U tumorû s mutovan mi formami K-ras nebyl prokázán léãebn efekt. Na posledním meetingu ASCO v roce 2008 byl potvrzen negativnû prediktivní v znam mutace K-ras pfii léãbû extracelulárními inhibitory EGFR, studie CRYSTAL a studie OPUS fáze III na kolorektálních karcinomech zaznamenaly signifikantnû zlep ené pfieïití bez progrese onemocnûní pfii pfiítomnosti nemutovaného K-ras genu. Na základû tûchto v sledkû bylo doporuãeno rutinní testování kolorektálních karcinomû pfied léãbou cetuximabem ãi panitumumabem. Pfiípad úspû ného zavedení tohoto genetického markeru do praxe v indikaci kolorektálních karcinomû je v zvou pro roz ífiení v zkumu i na dal í druhy nádorû. Na meetingu AHNS (American Head and Neck Society) v roce 2008 byla prezentována studie sledující mutaci K-ras ve vztahu k lokoregionální kontrole, k pfieïití bez známek onemocnûní a ve vztahu k pfieïití bez vzdálen ch metastáz u pacientû s lokoregionálnû pokroãil mi karcinomy hlavy a krku, ktefií byli léãeni chemoradioterapií a chirurgicky nebo bez chirurgického zákroku. Anal za DNA se podafiila u 197 pacientû, z nichï 3,5 % mûlo pfiítomnu K-ras mutaci v kodonu 12. Závûr této studie znûl, Ïe mutace K-ras je u karcinomû hlavy a krku spojena se selháním léãby, celkovou agresivitou onemocnûní, a mohla by proto ovlivnit druh volené terapie [19]. U karcinomû dutiny ústní byla K-ras mutace vysledována u 18 % (6 ze 33) pacientû na Tchaj-wanu, kde nádory této oblasti vznikají v souvislosti se Ïv káním betelov ch ofií - kû [20]. Jiné studie, uskuteãnûné v evropské populaci, zachytily pouze vzácn v skyt této ras mutace [21]. Mutace tyrozinkinázové domény EGFR Bunûãné linie s aktivujícími mutacemi tyrozinkinázové domény (nejãastûji ve formû delece v exonu 19 a bodové mutace v exonu 21) vykazují lep í odpovûì na stimulaci prostfiednictvím EGF s del í aktivací signální cesty neï buàky s nemutovan m genem, navíc byla zji tûna i mnohonásobnû úãinnûj í inhibice intracelulárními inhibitory v pfiípadech nemalobunûãného karcinomu plic. Kontinuální aktivace EGFR v tûchto pfiípadech mûïe potlaãit v znam ostatních signálních cest bunûãného pfieïívání a zv - it tak závislost nádoru na signální cestû EGFR pro pfieïití. V tomto modelu pak mutovan receptor váïe intracelulární inhibitor s vy í afinitou díky strukturálním zmûnám ATP vazebného místa tyrozinkinázové domény, a navíc zpûsobuje i vy í senzitivitu bunûk na cílenou léãbu, zapfiíãinûnou EGFR dependencí nádoru. Teorie tzv. závislosti na onkogenu se nabízí jako vysvûtlení úspû né apoptózy nádorov ch bunûk pfii inhibici signální soustavy proliferace, na níï je tumor závisl. Pfii genetické anal ze u kolorektálních karcinomû tyto mutace nebyly zachyceny [22], u karcinomû hlavy a krku byly v mnoha studiích také neúspû nû hledány anebo zachyceny pouze ve velmi malém procentu, li ícím se dle populace (rûzní autofii uvádûjí rozmezí od 0 4 % u bûlo ské populace aï po 7 % u asijské populace). Na základû uskuteãnûn ch studií lze tvrdit, Ïe v asijsk ch zemích je niï í v skyt mutace K-ras, naopak ãastûji jsou tam nalézány mutace tyrozinkinázové domény. Má to i svûj dûleïit v stup pro klinickou praxi, kdy se mûïeme setkat s vy - í úãinností intracelulárních inhibitorû EGFR u japonské populace ve srovnání s Evropou. Obr. 2 Signální cesta EGFR v kancerogenezi. Mutace EGFRvIII Bylo popsáno nûkolik variant mutací extracelulární domény receptoru (vi vvii), klinick v znam prokázala varianta III. EGFRvIII se objevuje pouze u nádorov ch bunûk a jedná se o mutaci s delecí v exo- 54

nech 2 7, kdy receptoru chybí extracelulární doména, a nemûïe se na nûj proto navázat ani ligand, ani extracelulární inhibitor. EGFRvIII má schopnost dimerizace i bez navázání ligandu a kontinuální aktivace, která vede ke zv enému pfieïívání bunûk a k rezistenci na protinádorovou léãbu. Tato mutace byla na základû studie u HNSCC nalezena u 42 % ze 33 pacientû a byla u ní v laboratorních podmínkách prokázána jak rezistence na cetuximab, tak i sníïená odpovûì na podání cisplatiny [23]. Dal í v zkum na bunûãn ch liniích HNSCC prokázal, Ïe zv ená bunûãná invazivita a migrace u EGFRvIII souvisí se zv enou aktivitou STAT3. Potvrzení prediktivního v znamu této mutace v ak ãeká na klinické studie. Kromû rezistence na extracelulární inhibitory byla popsána také sníïená odpovûì na intracelulární inhibici [24], u EGFRvIII se proto mohou pfiedpokládat strukturální zmûny postihující kromû extracelulární i intracelulární doménu. STAT3 STAT3 je jedním z rodiny signálních pfiena eãû a aktivátorû transkripce STAT. Pfii aktivující mutaci STAT3 byla u HNSCC bunûãn ch linií prokázána zv ená exprese Bcl-X a cyklinu D1. Tumory vzniklé z bunûãn ch linií s aktivovanou STAT3 rostou rychleji. In vitro i in vivo byla navíc prokázána rezistence na inhibici EGFR [25]. Ostatní mutace Pozornost je zamûfiena také na mutace Akt, dále na mutace tumor-supresorového genu PTEN, Src, MAPK aj. Zatím se ale jedná spí e o men í studie. Závûr Ukazuje se, Ïe molekulárnû-genetické prediktivní markery mají klíãov vliv na pfiedpovûì úãinnosti cílené léãby. Detekce exprese EGFR neprokázala v tomto Obr. 3 Mechanismus účinku inhibitorů EGFR rozdíly mezi intracelulárními a extracelulárními inhibitory; EGFR receptor pro epidermální růstový faktor; ADCC na protilátkách závislá buněčná cytotoxicita (antibody-dependent cellular cytotoxicity); SGTL1 transportní systém pro glukózu (sodium-dependent glucose cotransporter 1). smyslu pfiínos, proto se pozornost zamûfiila na genetické alterace v signální cestû nádorû. V rámci hledání odpovûdi na podávání extracelulárních inhibitorû u pacientû s HNSCC jsou slibné pfiedev ím mutace genu K-ras, STAT3 a EGFRvIII jako markery negativní odpovûdi a amplifikace genu pro EGFR jako marker pozitivní odpovûdi. U intracelulárních inhibitorû byla navíc vysledována pozitivní odpovûì pfii pfiítomnosti aktivujících mutací tyrozinkinázové domény EGFR. Pfii srovnávání studií je nutno brát v úvahu skuteãnost, Ïe v skyt mutací v signální cestû EGFR mûïe b t vázán nejen na rûzné druhy inhibitorû, ale i na rûzné druhy tumorû ãi populací. Literatura [1] Kalyankrishna S, Grandis JR. Epidermal growth factor receptor biology in head and neck cancer. J Clin Oncol 2006; 24: 2666 2672. [2] Oliveira S, van Bergen en Henegouwen PM, Storm G, et al. Molecular biology of epidermal growth factor receptor inhibition for cancer therapy. Expert Opin Biol Ther 2006; 6: 605 617. [3] Kim ES, Khuri FR, Herbst RS. Epidermal growth factor receptor biology (IMC-C225). Curr Opin Oncol 2001; 13: 506 513. [4] Mendelsohn J, Baselga J. Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment of cancer. J Clin Oncol 2003; 21: 2787 2799. [5] Nicholson RI, Gee JM, Harper ME, et al. EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer 2001; 37: 9 15. [6] Burtness B, Goldwasser MA, Flood W, et al. Phase III randomized trial of cisplatin plus placebo compared with cisplatin plus cetuximab in metastatic/recurrent head and neck cancer: an Eastern Cooperative Oncology Group study. J Clin Oncol 2005; 23: 8646 8654. [7] Trigo J, Hitt R, Koralewski P, et al. Cetuximab monotherapy is active in patients (pts) with platinum-refractory recurrent/metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): results of a phase II study. J Clin Oncol 2004; 22: (suppl.) 5502. [8] Li S, Schmitz KR, Jeffrey PD, et al. Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab. Cancer Cell 2005; 7: 301 311. [9] Lacouture ME. Mechanisms of cutaneous toxicities to EGFR inhibitors. Nat Rev Cancer; 2006; 6: 803 812. [10] Schrag D, Chung KY, Flombaum C, et al. Cetuximab therapy and symptomatic hypomagnesemia. Journal of the National Cancer Institute 2005; 97: 1221 1224. [11] Tejpar S, Piessevaux H, Claes K, et al. Magnesium wasting associated with epidermal-growth- -factor receptor-targeting antibodies in colorectal cancer: a prospective study. Lancet Oncol 2007; 8: 387 394. [12] Kawaguchi Y, Kono K, Mimura K, et al. Cetuximab induce antibody-dependent cellular cytotoxicity against EGFR-expressing esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer 2007; 120: 781 787. [13] Imai K, Takaoka A. Comparing antibody and small-molecule therapies for cancer. Nat Rev Cancer 2006; 6: 714 727. [14] Weihua Z, Tsan R, Huang WCH, et al. Survival of cancer cells is maintained by EGFR independent of its kinase activity. Cancer Cell 2008; 13: 385 393. 55

[15] Liévre A, Bachet JB, Le Corre D, et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Research 2006; 66: 3992 3995. [16] Mornoni M, Veronese S, Benvenuti S, et al. Gene copy number for epidermal growth factor receptor and clinical response to antiegfr treatment in colorectal cancer: a cohort study. Lancet Oncol 2005; 6: 279 286. [17] Erjala K, Sundwall M, Junttila TT, et al. Signaling via ErbB2 and ErbB3 associates with resistance and epidermal growth factor receptor (EGFR) amplification with sensitivity to EGFR inhibitor gefitinib in head and neck squamous cell carcinoma cells. Clinical Cancer Research 2006; 12: 4103 4111. [18] Bokemeyer C, Bondarenko I, Hartmann J, et al. KRAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with mcrc treated with FOL -FOX with or without cetuximab: The OPUS experience. ASCO 2008, Abst 4000. [19] Bissada E, Abou Chacra Z, Guertin L, et al. Prevalence of K-RAS codon 12 mutations in head and neck squamous cell carcinoma and impact on clinical outcomes. AHNS 2008 Annual Meeting, Abst 714000. [20] Kuo MY, Jeng JH, Chiang CP, et al. Mutations of Ki-ras oncogene codon 12 in betel quid chewing- -related human oral squamous cell carcinoma in Taiwan. J Oral Pathol Med 1994; 23: 70 74. [21] Chang SE, Bhatia P, Johnson NW, et al. Ras mutations in United Kingdom examples of oral malignancies are infrequent. Int J Cancer 1991; 48: 409 412. [22] Khambata-Ford S, Garrett CR, Meropol NJ, et al. Expression of epiregulin and amphiregulin and K-ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. J Clin Oncol 2007; 25: 3230 3237. [23] Sok JC, Copelli FM, Thomas SM, et al. Mutant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting. Clinical Cancer Research 2006; 12: 5064 5073. [24] Learn CA, Hartzell TL, Wikstrand CJ, et al. Resistance to tyrozine kinase inhibition by mutant epidermal growth factor receptor variant III contributes to the neoplastic phenotype of glioblastoma multiforme. Clin Cancer Res 2004; 10: 3216 3224. [25] Kijima T, Niwa H, Steinman RA, et al. STAT3 activation abrogates growth factor dependence and contributes to head and neck squamous cell carcinoma tumor growth in vivo. Cell Growth Differ 2002; 13: 355 362. 56