Pupečníková krev současné možnosti a perspektivy využití M. Petrenko, M. Huser Souhrn: Zárodečné (kmenové) buňky se v posledních letech staly významnou nadějí při léčbě mnohých, zejména hematologických onemocnění. Proto se hledají zdroje s vysokou koncentrací zárodečných buněk, které mají potřebné biologické vlastnosti schopnost diferenciace na buňky různých tkání. Jedním z významných zdrojů těchto buněk je pupečníková krev. Donedávna byla tato krev pouze biologickým odpadem, dnes se ukazují různorodé možnosti jejího využití. Pro budoucí použití je důležitý způsob odběru, zpracování a skladování pupečníkové krve. Klíčová slova: pupečníková krev kmenové buňky (stem cells) zmrazování transplantace porodnictví Summary: Germ (stem) cells became an important expectation in the treatment of many, especially hematological diseases in last years. Therefore sources with high concentration of germ cells with necessary biological properties an ability to differentiate into cells of different tissues are searched. One of the important sources of these cells is the umbilical blood. This blood was only a biological refuse until recently but diverse options of its use come out today. The way of collection, processing and storage of the umbilical blood is important for the next use. Keywords: umbilical blood stem cells congelation transplantation obstetrics 1. Úvod Pupečníková krev je krví z oběhu plodu (po porodu už novorozence). Vzhledem k tomu, že 97 % krve je obsaženo v placentě a jen 3 % v pupečníku, jeví se jako správnější označení placentární krev. Výraz pupečníková krev je však v literatuře obecně používán nejčastěji. Tato krev obsahuje kromě jiných součástí buňky, které se v této podobě v průběhu dalšího vývoje jedince již nevyskytnou. Jedná se o tzv. zárodečné buňky (kmenové, stem cells). Mají společnou vlastnost jsou schopny se množit a diferencovat na různé typy buněk. Dosavadní výsledky výzkumů prokazují, že jsou tyto zárodečné buňky schopny se diferencovat na kostní buňky, na buňky produkující inzulin, na specifické buňky mozku, myokardu a dalších orgánů. V současnosti se v praxi využívají hlavně krvetvorné zárodečné buňky. 2. Kmenové buňky a jejich využití Kostní dřeň, periferní krev a pupečníková krev obsahují speciální multipotentní buňky zvané kmenové (stem cells), které jsou schopny se diferencovat na všechny ostatní buňky. Kostní dření protéká velké množství krve a do jejího proudu se neustále uvolňují nové a nové zralé krvinky. Ale i kmenové buňky někdy cestují oběhem, a proto tyto kmenové buňky nacházíme i v periferní krvi, i když u dospělého člověka ve velmi malém množství. Jejich separace a skladování je proto značně neefektivní.v krevním oběhu novorozence, tedy v placentární, či pupečníkové krvi je ale jejich množství podobné tomu množství, které se nachází u dospělého člověka v kostní dřeni. 3. Transplantace krvetvorné tkáně 3.1. Důvody pro transplantaci krvetvorné tkáně Kostní dřeň pacienta přestane vytvářet a uvolňovat krvinky do krevního oběhu. Jedná se o selhání (úplné nebo částečné) kostní dřeně (například aplastická anémie). Kostní dřeň vytváří nenormální klony krvinek, které nejsou schopny správně fungovat, a navíc ještě potlačují tvorbu normálních krevních buněk. V tomto případě je potřeba nemocnou tkáň zlikvidovat a nahradit zdravou (například leukemie). Vlastní léčba nádorových onemocnění, při níž dojde při velmi razantní léčbě nádorů k likvidaci citlivé krvetvorné tkáně, kterou je třeba obnovit. Některá vrozená onemocnění, při nichž nejsou tělesné buňky schopny zpracovat například nějakou chemickou látku. Tuto schopnost mohou tělu přinést transplantované buňky krvetvorné tkáně. 3.2. Typy transplantací Autologní dárcem je pacient sám sobě. Kostní dřeň či pupečníková krev je odebrána potenciálnímu pacientovi v době, kdy nemá projevy onemocnění. Při onemocnění pacient podstoupí razantní léčbu, která zároveň zlikviduje jeho kostní dřeň. Krvetvorba je mu navrácena pomocí jeho vlastního štěpu vrátí se mu dříve odebrané krvetvorné buňky. Předpokládá se, že pokud jsou ve štěpu nádorové buňky, tak jen v takovém množství, že si s nimi pacient poradí sám. Alogenní příbuzenská dárcem je v tomto případě někdo z rodiny. Je nejčastějším typem alogenních transplantací, její výhodou je větší imunologická vhodnost. Nutná je HLA typizace. Sourozenecká transplantace u kostní dřeně se ukáže jako vhodná přibližně ve 25 %, u pupečníkové krve asi ve 35 %. Alogenní nepříbuzenská dárce je v tomto případě anonymní získaný z registru dárců kostní dřeně nebo z banky pupečníkové krve. Po transplantaci bývá provázena množstvím komplikací, ale pro mnoho pacientů je to jediná šance. Samozřejmě je nutná HLA typizace. Registry dárců kostní dřeně evidují asi 8 milionů dobrovolných dárců a registry pupečníkové krve asi 150 000 darovaných potenciálních transplantátů. Šance, že mezi nimi bude kompatibilní dárce nebo transplantát je asi 50%. Xenogenní transplantace z jednoho živočišného druhu na jiný. U krvetvorné tkáně se u člověka nepoužívá. Pro shodu tkáňových znaků se využívá HLA typizace v 6 znacích. Ideální shoda je 6 ze 6 znaků. U kostní dřeně se toleruje u nepříbuzenských transplantací 5 ze 6, u příbuzenských i 3 ze 6, ale samozřejmě je zde pravděpodobnost většího množství komplikací. Z tohoto hlediska není bez zajímavosti, že u krvetvorné tkáně z pupečníkové krve je tato komplikace v menším procentu, a že při transplantaci se toleruje shoda až 4 ze 6. www.praktickagynekologie.cz 17
4. Výhody a nevýhody využití pupečníkové krve 4.1. Výhody Štěp je většinou zcela vyšetřen a okamžitě připraven k použití, čímž odpadá doba čekání na kontaktování dárce, jeho vyšetření a odebrání (měsíce), takže se celý proces podstatně zkrátí (týdny). Štěp je fyzicky přítomen v kryobance. Odpadá nejistota, zda dárce bude ještě stále chtít kostní dřeň darovat. Vzhledem k menší zralosti dárce (krev zbylá po porodu v pupečníku a placentě patří původem plodu ne matce), je po transplantaci méně komplikací vyplývajících z imunitních rozdílů mezi dárcem a příjemcem (pacientem), tzv. reakce štěpu proti hostiteli. Naskýtá se snadná možnost další manipulace se štěpem (například rozmnožování buněk krvetvorné tkáně). Nehrozí cytomegalovirová infekce (virus neprochází placentární bariérou). 4.2. Nevýhody Objem krvetvorné tkáně je často malý, proto je v některých případech vhodná jen pro transplantace u dětí. Na technikách překračujících tato omezení se zatím pracuje. Je nezbytné vybudování kryobank a zajištění jejich provozu. 5. Alternativy k využití vlastní (autologní) pupečníkové krve Vzhledem k tomu, že pupečníková krev má jedince doprovázet několik desetiletí, v průběhu kterých věda postoupí dopředu, je potřeba předpokládat i možný jiný vývoj a to, že se pupečníková krev stane nepotřebnou. To by znamenalo, že se najde jiný způsob jak nahradit vlastní krvetvorné buňky i jiné zárodečné buňky pupečníkové krve. Touto možností je klonování. Teoreticky je možné klonování embryí, která jsou identická s pa- cientem a léčebné využití jejich multipotentních buněk. Tento postup, byť i prakticky realizovatelný, naráží na mnohé závažné etické otazníky. Zatímco kmenové buňky získané od dospělých jedinců (kostní dřeň) nebo od novorozenců (pupečníková krev) nepředstavují z etického hlediska velký problém, kmenové buňky získané z potracených plodů nebo embryí vyvolávají řadu etických námitek. Jinou možností by byl takový pokrok v transplantační imunologii, který by umožnil transplantovat kostní dřeň nebo pupečníkovou krev nepříbuzného dárce i s nízkou kompatibilitou bez rizika rejekce navození imunologické tolerance. Tato varianta je však méně pravděpodobná než varianta klonování, zejména u transplantace krvetvorných buněk. Na rozdíl od krvetvorných buněk, u nichž je ve srovnání s buňkami jiných orgánů (mozku, Langerhansových ostrůvků, ledvin, myokardu a dalších) potřeba kompatibility nejvyšší, je tedy u onemocnění těchto orgánů, případně dalších, při předpokládaném pokroku ve výzkumu zárodečných buněk možné využití transplantátů z registrů pupečníkové krve. 6. Seznam onemocnění léčených transplantací krvetvorných buněk Autologní transplantát z pupečníkové krve nemůže být použit u těch níže uvedených onemocnění, která jsou geneticky podmíněna, a u těch, jejichž začátek sahá do období před narozením. Vlastní krvetvorné buňky mohou být použity pouze u těch onemocnění, u nichž je riziko odebrání nádorových buněk relativně nízké. Celkově však platí, že výběr léčby závisí na množství různých faktorů, a proto je u jednoho každého konkrétního pacienta velmi individuální. Na závěr seznamu (viz tabulka níže) jsou uvedena některá onemocnění, u kterých bude s největší pravděpodobností možné použít zárodečné buňky pupečníkové krve v budoucnosti. 7. Odběr pupečníkové krve Pupečníková krev se odebírá ihned po narození dítěte v průběhu 3. doby porodní po přestřižení pupečníku. V době odběru je již novorozenec oddělen od placentárního oběhu, odběr se ho tedy netýká. Odběr tak nezatěžuje novorozence ani matku bolestí či jiným dyskomfortem. Průměrné množství krve odebrané z placenty se pohybuje kolem 90 ml. Čím větší množství krve se odebere, tím větší počet zárodečných buněk lze uchovat. 18 Praktická gynekologie 4/04
Současná aplikace krvetvorných buněk vlastní pupečníková krev vlastní krvetvorné Název onemocnění pupečníková krev sourozence kostní dřeň buňky dárce akutní leukemie akutní lymfoblastická leukemie ano ano ano - ano akutní myeloblastická leukemie ano ano ano ano chronické leukemie chronická lymfatická leukemie ano ano ano - ± chronická myeloidní leukemie ano ano ano - ano juvenilní myelomonocytární leukemie ano ano ne ano myelodysplastické syndromy chronická myelomonocytární leukemie ano ano ne ano refrakterní anémie ano ano ano - ano refrakterní anémie s převahou blastů ano ano ano - ano refrakterní anémie s převahou blastů v transformaci ano ano ano - ano refrakterní anémie s věnečkovitými sideroblasty ano ano ano - ano poruchy krvetvorby aplastická anémie (závažná) ano ano ne ano kongenitální cytopenie ne ano ne ano kongenitální dyskeratóza ne ano ne ano Fanconiho anémie ne ano ne ano noční paroxyzmální hemoglobinurie ano ano ne ano myeloproliferativní poruchy akutní myelofibróza ano ano ne ano myelofibróza ano ano ne ano lymfoproliferativní poruchy Hodgkinova choroba ano ano ano ± Non Hodgkinův lymfom ano ano ano ± plazmocytární onemocnění myeloma multiplex (plazmocytom) ano ano ano - ± plazmocelulární leukemie ano ano ano - ± jiné malignity rakovina prsu (ano) (ano) (ano) exp rakovina vaječníku (ano) (ano) (ano) exp malobuněčný nádor plic (ano) (ano) (ano) exp nádory mozku ano (ano) ano ne Ewingův sarkom ano (ano) ano exp neuroblastom ano ano ano ± karcinom ledviny (ano) (ano) (ano) ano/exp karcinom semeníku ano ano ano exp autoimunitní onemocnění Evansův syndrom ano ano exp ne sclerosis multiplex ano ano ano - exp revmatoidní artritida ano ano ano - exp systémový lupus erythematosus ano ano ano - exp fagocytární poruchy Chédiakův Steinbrickův Higashiho syndrom ne ano ne ano chronická granulomatóza ne ano ne ano aktinová deficience neutrofilů ne ano ne ano retikulární dysgeneze ne ano ne ano lipozomální onemocnění adrenoleukodystrofie ne ano ne ano Gaucherova choroba ne ano ne ano Hunterův syndrom (MPS-II) ne ano ne ano Hurlerové syndrom (MPS-IH) ne ano ne ano Krabbeova choroba ne ano ne ano Maroteauxův-Lamyův syndrom (MPS-VI) ne ano ne ano metachromatická leukodystrofie ne ano ne ano Morquioův syndrom (MPS-IV) ne ano ne ano mukolipidóza II ne ano ne ano mukopolysacharidóza ne ano ne ano Niemannova Pickova choroba ne ano ne ano Sanfilippův syndrom (MPS-III) ne ano ne ano Scheieův syndrom (MPS-IS) ne ano ne ano Slyův syndrom (MPS-VII) ne ano ne ano Wolmanova choroba ne ano ne ano poruchy histiocytů familiární erytrofagocytózní lymfohistiocytóza ne ano ne ano hemofagocytóza ne ano ne ano histiocytóza X ne ano ne ano histiocytóza Langerhansových buněk ne ano ne ano www.praktickagynekologie.cz 19
vlastní pupečníková krev vlastní krvetvorné Název onemocnění pupečníková krev sourozence kostní dřeň buňky dárce dědičné erytrocytární abnormality β talasemie ne ano ne ano Diamondova Blackfanova anémie ne ano ne ano erytrocytární aplazie ne ano ne ano srpkovitá anémie ne ano ne ano vrozené poruchy imunitního systému absence T a B buněk ne ano ne ano absence T buněk, normální B buňky ne ano ne ano ataxie telangiektázie ne ano ne ano lymfocytární syndrom ne ano ne ano běžná variabilní imunodeficience ne ano ne ano DiGeorgeův syndrom ne ano ne ano Kostmannův syndrom ne ano ne ano deficience leukocytární adheze ne ano ne ano Omennův syndrom ne ano ne ano závažné kombinované imunodeficience (SCID) ne ano ne ano SCID s deficiencí adenozindeaminázy ne ano ne ano Wiskottův Aldrichův syndrom ne ano ne ano X vázaná lymfoproliferativní porucha ne ano ne ano jiná dědičná onemocnění kartilaginózní (chrupavčitá) a vlasová hypoplazie ne ano ne ano keratoidní lipofuscinóza ne ano ne ano kongenitální erytropoetická porfyrie ne ano ne ano Glanzmannova trombastenie ne ano ne ano Leschův Nyhanův syndrom ne ano ne ano osteopetróza ne ano ne ano Tayova Sachsova choroba ne ano ne ano vrozené poruchy trombocytů amegakaryocytóza/kongenitální trombocytopenie ne ano ne ano Potenciální využití zárodečných buněk Alzheimerova choroba ano ano ne ne cukrovka ano ano ne ne onemocnění srdce ano ano ne ne onemocnění jater ano ano ne ne svalová dystrofie ano ano ne ne Parkinsonova choroba ano ano ne ne úraz míchy ano ano ne ne mozková mrtvice (NCMP) ano ano ne ne Vysvětlivky: ano = V případě pupečníkové krve lze transplantaci vykonat a je možné od ní očekávat vyléčení. ano = V případě kostní dřeně se transplantace provádí standardně, většinou s kurativním efektem. ano = Transplantace se provádí, avšak není možné od ní očekávat trvalé vyléčení, jenom prodloužení přežívání. (ano) = Transplantaci lze provést, v současnosti je však při dané diagnóze zatím pouze předmětem výzkumu, skutečný význam se ukáže v budoucnosti. ± = Transplantace se v některých případech provádí, lze od ní sice očekávat i trvalé vyléčení, avšak pro velmi vysoké riziko tohoto zákroku se nejedná o standardní metodu. exp = Jedná se pouze o experimentální metodu Nejdůležitější podmínkou uchování je, aby byla krev odebrána sterilně. Vzhledem k tomu, že pupečník prochází porodními cestami bohatými na vaginální flóru, existuje reálné riziko kontaminace. Tomu lze zabránit precizní dezinfekcí pupečníku před odběrem, tím se riziko kontaminace sníží na minimum. Pupečníkovou krev je možné odebírat i v nestandardních situacích, jako je předčasný či potermínový porod, porod císařským řezem nebo porod v různých polohách. Epidurální analgezie a užívání léků v průběhu těhotenství rovněž není překážkou. Kontraindikací je infekce HIV a aktivní hepatitida typu B a C. V případě komplikace porodu může nastat situace, při níž porodník nemá dostatek času na odběr pupečníkové krve. V takovém případě je rozhodnutí na lékaři, zda odběr provede. Rozhodnutí provádí v zájmu zdraví rodičky, odběr se stává sekundární záležitostí. Odběr se provádí do speciálních odběrových sad, u kterých je k dispozici přesný návod. Většina porodních asistentek je dnes o technice odběru podrobně informována. Při dodržení správného postupu se jedná o technicky nenáročný výkon. Důležité je i správné vyplnění doprovodné zdravotní dokumentace. 8. Zpracování pupečníkové krve Cílem zpracování je připravit transplantát, který může být uskladněn několik desetiletí. V současnosti se používá několik metod zpracování, jejichž společným jmenovatelem je zmražení. Zmrazování je, podobně jako zmrazování gamet či embryí v asistované reprodukci, prováděno na automatických přístrojích řízených počítačem. Některé laboratoře používají v zájmu snižování nákladů jen izolaci a zmražení samotných zárodečních buněk. Tento postup však snižuje jejich počet a nevylučuje se ani úplná ztráta dnes ještě málo prozkoumaných zárodečních buněk. Dle literárních údajů je proto vhodnější zmrazování celého preparátu s obsahem všech druhů buněk. Pro zachování sterility je využíván takový způsob zpracování krve, při němž nepřichází krev do kontaktu s vnějším prostředím. 20 Praktická gynekologie 4/04
Laboratoř musí být rovněž vybavena přetlakovým filtračním systémem a samotná manipulace je prováděna ve sterilním boxu. Velmi důležitým faktorem tzv. správné laboratorní praxe je snížení chyb způsobených lidským faktorem na minimum. Systém kontroly musí tedy probíhat tak, aby nedošlo k odhalení chyby až po znehodnocení transplantátu. V praxi to znamená, že je vhodné, aby transplantát nezpracovával jeden pracovník, ale tým. Tento systém je sice nákladnější, ale velmi účinný a minimalizuje riziko znehodnocení pupečníkové krve. 9. Uskladnění transplantátů Transplantát musí být uskladněn tak, aby se v průběhu desetiletí skladování nepoškodil. Vzorky se uchovávají v tekutém dusíku při teplotě 196 C v biologických kontejnerech. Tyto kontejnery jsou nezávislé na přívodu elektrické energie a hladina dusíku je monitorována elektronickým systémem napojeným na bezpečnostní systém skladu. Tento systém má vlastní zdroj napájení, takže kontrola není narušena ani při výpadku elektřiny. Každý transplantát je rozdělen na dvě části, přičemž každá z nich je uložena v jiném kontejneru. Tím se snižuje riziko zničení transplantátu z 1 : 10 000 až na 1 : 100 000 000. Skladovací prostory jsou napojeny na elektronický ochranný systém a většinou i místní policii. Cílem všech těchto opatření je zabránit ztrátě nenahraditelného biologického materiálu. 10. Závěr Moderní věda dnes stojí na začátku zkoumání zárodečních buněk. Nebývalý rozvoj molekulární biologie, imunologie a mnohých dalších paraklinických oborů naznačuje možnosti jejich využití i u těch onemocnění, u nichž je současná klasická medicína bezmocná, nebo využívá jen symptomatických či paliativních metod léčby. Lze proto předpokládat, že to, co dnes skeptici považují za nemožné, bude za pár let běžnou rutinní praxí a transplantát z pupečníkové krve bude využitelný pro různé léčebné účely. Svědky podobného vývoje jsme byli už několikrát, v našem oboru je asi nejmarkantnějším příkladem pokrok v asistované reprodukci a reprodukční genetice. Literatura 1. Gluckman E. The Ham Wasserman lecture cord blood: Biology and clinical use. Trens in onco hematology 1998; 6: 51 55. 2. Weber Nordt R. Stem cells from umbilical cord blood, Biomedical Progress 2000; 13: 6 9. 3. Harris DT. Cord blood banking and it s potential clinical applications, Clinical Research News for Arizona Physicians 2003: 1 4. 4. Barker JN, Wagner JE. Umbilical cord blood transplantation: current state of the art. Corr Opin Oncol 2002; 14: 160 164. 5. Banka pupečníkové krve české republiky, www. stránky http://www.bpk.cz/bpk/proc_teorie.htm prim. MUDr. Martin Petrenko, CSc., MUDr. Martin Huser Gynekologicko porodnická klinika, FN Brno www.praktickagynekologie.cz 21