APLIKAČNÍ ZPRÁVA LABORATORNÍ ANALÝZA KYVETOVÉ TESTY PITNÁ VODA Validace kyvetových testů pro analýzu pitné vody V roce 2007 byl Ústav pro poradenství a vývoj v oblasti vodohospodářství v Porýní-Westfálsku (Rheinisch-Westfälische Institut für Wasser Beratungsund Entwicklungsgesellschaft mbh, IWW) pověřen provedením studie s cílem zjistit, zda by bylo formálně možné používat kyvetové testy v analýze pitné vody podle Vyhlášky o pitné vodě z roku 2001 (Trinkwasserverordnung 2001). Studie došla k závěru, že pokud jde o analytické metody, přesnost, správnost a meze detekce u zkoumaných kyvetových testů LANGE, tyto odpovídají požadavkům vyhlášky o pitné vodě (VPV). Kyvetové testy jsou tedy v principu vhodné pro úřední analýzu pitné vody. Autor: Ralf König - Diplomovaný inženýr - Vertical Market Manager HACH LANGE
2 ANALÝZA PITNÉ VODY_POŽADAVKY Splňují kyvetové testy legislativní požadavky týkající se pitné vody? Akreditace V principu lze do akreditace zahrnout nestandardizované metody, pokud u nich bylo prokázáno, že jsou vhodné pro uživatele, a pokud byly v souladu s tím zvalidovány. Vlastnosti analytické metody musejí splňovat požadavky specifikované v dodatku 5 Vyhlášky o pitné vodě. Kromě základního ověření vhodnosti těchto metod (např. prostřednictvím této studie) musí laboratoř také předložit zjednodušené ověření, že splňuje požadavky s ohledem na charakteristiky. Testovací metodu musí schválit akreditační orgán v rámci akreditačního procesu (ISO 17025) a je třeba ji zahrnout do osvědčení (nebo do dodatku k osvědčení). V této souvislosti je nutné prokázat vhodnost metody pro příslušný účel (v souladu s paragrafem 5.4 normy ISO 17025). Laboratoř nebo výrobce testu (je-li to nutné) musejí provést potřebnou validaci. Laboratoř pro danou metodu provede sjednané interní (kontrolní karty) a externí zajištění jakosti (úspěšná účast v okružních testech). Nakonec musí notifikační orgán formálně potvrdit nebo nostrifikovat dodržování výše zmíněných požadavků v souladu s paragrafem 15 (5) příslušné vyhlášky o pitné vodě. Jsou-li tato kritéria splněna, neexistuje už žádná zákonná překážka pro začlenění kyvetových testů mezi interní metody laboratoře. Základní informace V Německu se úřední analýzy pitné vody řídí zákonem. Smějí je provádět pouze notifikované laboratoře se zvláštním osvědčením za využití metod, které jsou specifikovány podle vyhlášky o pitné vodě. Vzhledem k tomu, že německá vyhláška o pitné vodě z roku 2001 začleňuje téměř celý obsah Evropské směrnice o pitné vodě, většina jejích podmínek a požadavků platí v obdobné formě i v ostatních členských zemích EU. Na rozdíl od odpadních vod legislativa týkající se pitné vody nestanoví žádné konkrétní metodologické požadavky. V principu lze použít jakoukoli metodu, která poskytne dostatečně spolehlivé výsledky a jejíž statistické charakteristiky splní požadavky dodatku 5, paragrafu 15 příslušné vyhlášky o pitné vodě. Mezi statistické charakteristiky (SCh) patří správnost, přesnost a mez detekce, které se vyjádřují jako podíl mezní hodnoty v procentech (v tomto případě 10 %). Dalším neméně důležitým kritériem z hlediska schválení metody je to, že alternativní metoda musí splňovat obecně uznávané technické normy. Kromě toho laboratoř, která chce používat kyvetové testy coby alternativu standardizovaných metod, musí mít platnou akreditaci podle normy DIN ISO 17025. Požadavky týkající se akreditace Pokud zákazník metodu nespecifikuje, analytická laboratoř je povinna používat nejvhodnější analytické metody [3]. Tyto metody musejí být uvedeny buď v mezinárodních, regionálních či národních normách, musejí pocházet od uznávaných technických organizací, musejí být publikovány v odborných časopisech nebo je musí jasně popsat výrobce metod (např. kyvetové testy). Lze také použít metody, které laboratoř vyvine nebo zavede, jsou-li tyto metody vhodné pro zamýšlené použití a jsou-li náležitě zvalidovány. Zákazník musí být o zvolené metodě informován. Základní validace kyvetových testů Validace analytické metody se provede tak, že se zjišťuje - nejistota měření - mez detekce a mez stanovitelnosti - selektivita - linearita - přesnost - správnost - robustnost vůči vnějším vlivům (křížová sensitivita, vliv matrice vzorku) Kromě toho by alternativní metoda měla poskytnout výsledky, které jsou srovnatelné s výsledky získanými pomocí odpovídající standardní metody. www.hach-lange.com
3 Všechna měření se provádějí na spektrofotometru HACH LANGE DR 5000 UV-VIS (viz obr. 1). Při základní kalibraci byly použity kalibrační roztoky, které byly připraveny obohacením roztoků bez matrice (ultračistá voda) stanovovanými analyty [1]. Pro obohacení byly použity certifikované referenční materiály. Mez stanovitelnosti byla určena v průběhu 10 dní měřením deseti kalibračních roztoků, jejichž koncentrace se úměrně zvyšovala od nejnižší koncentrace rozsahu měření kyvetového testu. Celkový rozsah měření byl zvalidován změřením dalších dvou až pěti kalibračních roztoků až po nejvyšší koncentraci rozsahu měření. V rámci validace kyvetových testů byly hodnoceny základní kalibrační údaje, které byly použity pro výpočet těchto specifikací metody. Kalibrační funkce a statistické charakteristiky, - Gradient (b, míra citlivosti), - Intercept - Směrodatná odchylka rozdílů (s y, rozptyl naměřených hodnot kolem regresní přímky) - Směrodatná odchylka metody (s x0, absolutní přesnost kalibrace) - Variační koeficient metody (V x0, relativní standardní odchylka metody, relativní přesnost kalibrace) Ověření linearity Stanovení meze detekce a meze stanovitelnosti podle normy DIN 32645 Byla také zkoumána shoda rozptylů v rozsahu měření. Statistické charakteristiky byly vypočítány pomocí Programu statistické kontroly analytických dat SQS (verze 1.51, Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim). Obr. 1: Spektrofotometr DR 5000 s dotykovou obrazovkou, rotačním odečtem čárového kódu a automatickou detekcí chyb pro spolehlivé vyhodnocení všech kyvetových testů LANGE č. Parametr Kyvetový test LANGE Standard Rozsah měření Mezní hodnota SCh (%) PC (mg/l) kyvetového testu dle VPV 1 Hliník LCK301 DIN ISO 10566 0,02 0,5 mg/l 0,2 mg/l 10 0,02 (Chromazurol S) (pyrokatecholová violeť) 2 Amonium LCK304 DIN 38406-5 0,02 2,5 mg/l 0,5 mg/l 10 0,05 (Indofenolová modř) (Indofenolová modř) 3 Chlór, volný LCK310 DIN EN ISO 7393-2 0,05 2 mg/l min. 0,1 mg/l, - - (po dezinfekci) (DPD) (DPD) max. 0,3 mg/l 4 Chlór, celkový LCK310 DIN EN ISO 7393-2 0,05 2 mg/l - - - (DPD) (DPD) 5 Železo, stopy LCK521 DIN 38406 E1-1 0,01 1 mg/l 0,2 mg/l 10 0,02 (1,10-fenantrolin) (1,10-fenantrolin) 6 Mangan, stopy LCW532 DIN 38406 E2 0,005 0,5 mg/l 0,05 mg/l 10 0,005 (PAN indikátor) (Formaldoxim) 7 Dusičnany LCK339 DIN38405 D9-1 1 60 mg/l 50 mg/l 10 5 (2,6-dimethylfenol) (2,6-dimethylfenol) 8 Dusitany, stopy LCK541 (Diazotace) DIN EN 26777 (Diazotace) 0,005 0,1 mg/l 0,5 mg/l nebo 0,1 mg/l na odtoku z ČOV 10 0,01 9 Orthofosforečnany LCK349 (Molybdenová modř) DIN EN ISO 6878 (Molybdenová modř) 0,15 4,5 mg/l 6,7 mg/l - - Tabulka 1: Metodologie, limitní hodnoty a statistické charakteristiky (SCh) zvolených parametrů analýzy v souladu s Vyhláškou o pitné vodě z roku 2001 (VPV)
4 ANALÝZA PITNÉ VODY_VALIDACE Validace kyvetových testů: přesnost Obr. 2: Pěticentimetrová pravoúhlá kyveta pro přesné stanovení stopového množství železa, manganu a dusitanů Přesnost Vyhodnocení přesnosti metody pomocí variačního koeficientu metody Variační koeficient metody (relativní směrodatná odchylka metody, V x0 ) slouží k vyhodnocení přesnosti kalibrace. Variační koeficient metody odráží kvalitu metody testu. Navíc umožňuje porovnat analytické metody, které mají různý rozsah měření. Variační koeficienty metod u zkoumaných kyvetových testů (obr. 3) nepřekračují 3 %. Metody tedy vykazují dobrou až velmi dobrou přesnost. Zvláště je třeba zdůraznit, že variační koeficienty u kyvetových testů na amonium, železo, dusičnany a fosforečnany jsou prokazatelně pod hodnotou 1 %, což značí, že tyto kyvetové testy jsou opravdu velmi přesné. Přesnost analýzy při mezní hodnotě ( 10 %) V analytické chemii přesnost metody závisí na koncentraci analytů a snižuje se s tím, jak se hodnota blíží dolní mezi rozsahu měření. Podle zákonných požadavků týkajících se pitné vody se výsledky schválených metod měření nesmějí lišit o více než 10 % od mezních hodnot, které stanoví legislativa. Statistické charakteristiky stanovené pro přesnost v příslušné vyhlášce o pitné vodě se týkají koncentrace parametru při mezní hodnotě. Cílem je zajistit, že použitá analytická metoda bude přinejmenším vhodná pro spolehlivou detekci analytu v koncentraci rovnající se mezní hodnotě. Analytická přesnost kyvetových testů byla vypočítána pomocí Programu pro statistickou kontrolu analytických dat SQS (verze 1.51, Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim) a za využití dat ze základní validace. V x0 (%) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 LCK301 Hliník Variační koeficienty metody u kyvetových testů 2,2 2,21 2,13 1,84 LCK304 Amonium 0,42 LCK521 Železo, stopy 0,70 LCW532 Mangan, stopy 1,19 LCK339 Dusičnany 0,51 LCK541 Dusitany, stopy 0,74 LCK349 Orthofosforečnany LCK310 Chlór, volný Obr. 3: Variační koeficienty metody (V x0 ) kyvetových testů LANGE (základní kalibrace) LCK310 Chlór, celkový Všechny validované kyvetové testy, pro něž jsou statistické charakteristiky stanoveny ve vyhlášce o pitné vodě (hliník, amonium, železo, mangan, dusitany a dusičnany), mají vysokou úroveň analytické přesnosti při mezní hodnotě. Všechny poskytují výsledky, které nepřekračují maximální odchylku 10 %. V případě amonia, hliníku, železa a dusičnanů je rozptyl výsledků nižší než 3 %. Vyhláška o pitné vodě nestanoví žádné statistické charakteristiky pro chlór (volný/celkový) a orthofosforečnany. www.hach-lange.com
5 Přesnost za podmínek opakovatelnosti Dalším cílem z hlediska kvality rutinních analýz je zajistit stálou a dlouhodobou přesnost a správnost výsledků analýzy. Přesnost metody byla zkoumána a vyhodnocena v průběhu 2 až 3 týdnů na základě systematicky prováděných, opakovaných kontrolních analýz (celkem deset analýz, s dvojím stanovením) u obohacených reálných vzorků pitné vody a v různých dnech měření. Pro tento účel byla vypočítána směrodatná odchylka v rámci série (dvojité stanovení na den měření) a také celková směrodatná odchylka mezi sériemi podle publikované metody autorů Funk a kol. [5]. Za podmínek opakovatelnosti všechny zkoumané kyvetové testy vykazují dobré až velmi dobré výsledky. Nebylo zjištěno, že by se výsledky analýzy měnily s časem. Robustnost: vliv šarže reagentu na přesnost Robustnost odráží relativní necitlivost analytické metody na změny celkových analytických podmínek. Robustnost kyvetových testů byla zjištěna pomocí reagentů z různých výrobních šarží. Provádělo se trojí stanovení standardního roztoku v roztoku bez matrice (ultračistá voda) za využití kyvetových testů ze dvou různých výrobních šarží za podmínek opakovatelnosti. Průměrné hodnoty ve dvou sériích měření (v každém případě N=3) s rozdílnými šaržemi reagentů se liší jen nepatrně. U všech zkoumaných kyvetových testů je relativní směrodatná odchylka (míra rozptylu) pro všechny naměřené hodnoty (N=6) dobrá až velmi dobrá. Relativní směrodatná odchylka pro všechny metody nepřekračuje hranici 3 %. Šarže reagentu nemá na přesnost prokazatelný vliv. Správnost Stanovení výtěžnosti Správnost je mírou odchylky mezi naměřenou hodnotou (nebo průměrem několika měření) a správnou (skutečnou) hodnotou. Ta je způsobena systematickou chybou. Při stanovení správnosti kyvetových testů jsou analyty obohaceny certifikovanými referenčními materiály, kdy jsou vytvořeny reálné matrice pitné vody [1]. Obohacené zkušební roztoky byly analyzovány šestkrát pomocí kyvetových testů za podmínek opakovatelnosti. Správnost byla stanovena na základě výtěžnosti poté, co naměřené hodnoty byly zkontrolovány na přítomnost odlehlých hodnot (Grubbsova metoda, P=99 %). Výtěžnost odpovídá průměru naměřených hodnot (N=6) vyjádřených jako procentuální podíl cílové koncentrace obohacených analytů. Obr. 4: Kyvetový test na stanovení volného a celkového chlóru LCK310 Obr. 5: Kyvetový test na stanovení orthofosforečnanů LCK349
6 ANALÝZA PITNÉ VODY_VALIDACE Validace kyvetových testů: správnost Obr. 6: Ideální pro stanovení nízkých koncentrací manganu LCW532 LCK/Parametr Výtěžnost (%) LCK301 Hliník 91,8 LCK304 Amonium 98,2 LCK310 Chlór, volný 94,9 LCK310 Chlór, celkový 91,5 LCK521 Železo, stopy 99,2 LCW532 Mangan, stopy 98,0 LCK339 Dusičnany 100,8 LCK541 Dusitany, stopy 91,2 LCK349 Orthofosforečnany 97,6 Tabulka 2: Výtěžnost u kyvetových testů LANGE v ultračisté vodě Hodnoty výtěžnosti zkoumaných kyvetových testů leží v intervalu 92,5 102 %. Splňují tudíž podmínky příslušné vyhlášky o pitné vodě s ohledem na požadavek správnosti (10% odchylka relativně k limitní hodnotě). Výtěžnost v různých matricích Jedním z klíčových kritérií kvality testovací metody je její vhodnost pro použití s reálnými vzorky. Vlivy matrice a jednotlivé kroky se mohou projevit zvýšenou nepřesností anebo stálou nebo proporcionální systematickou odchylkou výsledků analýzy od správných hodnot. Výpočet funkce výtěžnosti ve speciální matrici pitné vody představuje vhodný způsob, jak stanovit vliv matrice. Reálná pitná voda coby matrice byla obohacena standardními roztoky s obsahem chlornanu (0,8 mg/l volného Cl 2 ), vápníku (365 mg/l CaCO 3 = 20 dh), železa (2 mg/l Fe) a manganu (1 mg/l Mn). Pro každý kyvetový test byla sestrojena závislost výtěžnosti v celém rozsahu měření za využití čtyř matric pitné vody. Hodnoty výtěžnosti u všech zkoumaných kyvetových testů se pohybovaly mezi 90 a 100 % a splnily požadavky Vyhlášky o pitné vodě z roku 2001 týkající se správnosti. Výjimkou byl kyvetový test na hliník, který poskytl výtěžnost pouze 85,1 % v matrici s manganem. Nejvyšší hodnoty výtěžnosti v celé škále matric byly pozorovány u kyvetových testů na železo a orthofosforečnany (96,9 98,6 %). Výtěžnosti u všech metod jsou dobré až velmi dobré podle typu matrice. Kontrola meze stanovitelnosti (podle normy DIN 32645) Dodatek 5 příslušné vyhlášky o pitné vodě definuje statistické charakteristiky pro mez detekce jako procentuální podíl mezní hodnoty. Mez detekce je nejnižší koncentrace analytu, kterou lze stanovit kvalitativně, zatímco limit stanovitelnosti je nejnižší koncentrace analytu, kterou lze stanovit kvantitativně. Mez stanovitelnosti je nejnižší koncentrace, při níž měření splňuje definovaný požadavek přesnosti. Vzhledem k tomu, že při analýze pitné vody se analyty stanovují kvantitativně (tj. jako koncentrace), pro účely této validace a pro vyhodnocení účinnosti testovací metody se používala spíše mez stanovitelnosti nežli mez detekce. Mez stanovitelnosti byla stanovena podle normy DIN 32645 (metoda kalibrační závislosti) změřením 10 standardních kalibračních roztoků s rovnoměrně vzrůstající koncentrací od dolní koncentrace rozsahu měření testovací metody HACH LANGE v průběhu 10 dní. www.hach-lange.com
7 Kyvetové testy pro stanovení hliníku, amonia, železa (stopy), manganu (stopy), dusičnanů a dusitanů (stopy) splňují specifikaci statistických charakteristik pro mez detekce. V případě parametrů jako chlór (volný a celkový) a orthofosforečnany nejsou ve Vyhlášce o pitné vodě z roku 2001 specifikovány žádné statistické charakteristiky. Meze stanovitelnosti u těchto metod jsou v intervalu, který odpovídá standardním fotometrickým metodám. Č. Zkoumaný kyvetový test Rozsah měření kyvetového testu v mg/l Mez stanovitelnosti (mg/l) Mez detekce (%) 1 LCK301 Hliník 0,02 0,5 0,017 8,5 10 2 LCK304 Hliník 0,02 2,5 0,0086 1,7 10 3 LCK310 Chlór, volný 0,05 2 0,016 16-4 LCK310 Chlór, celkový 0,05 2 0,022 22-5 LCK521 Železo, stopy 0,01 1 0,01 5 10 6 LCW532 Mangan, stopy 0,005 0,5 0,004 8 10 7 LCK339 Dusičnany 1 60 0,44 0,88 10 8 LCK541 Dusitany, stopy 0,005 0,1 0,0063 6,3 10 9 LCK349 Orthofosforečnany 0,15 4,5 0,045 0,67 - SCh u meze detekce dle VPV (%) Tabulka 3: Meze detekce u zkoušených kyvetových testů LANGE ve srovnání s příslušnými SCh vyhlášky o pitné vodě Porovnání kyvetových testů se standardními fotometrickými metodami Tato studie je založena na porovnání statistických charakteristik obou metod (kyvetové testy oproti standardním fotometrickým metodám). Statistické charakteristiky fotometrických metod byly stanoveny zvlášť v rámci studie [1]. Pro účely vyhodnocení srovnatelnosti výsledků analýzy reálných vzorků byly za podmínek opakovatelnosti a za využití kyvetových testů a standardizovaných fotometrických metod provedeny šestinásobné analýzy vzorků pitné vody obohacené matricí. U všech zkoumaných standardních fotometrických metod a u všech zkoumaných kyvetových testů se hodnoty výtěžnosti v matrici pitné vody (správnost) pohybovaly mezi 91,0 a 103,8 % Pro všechny zkoumané metody se relativní směrodatná odchylka v rámci série za podmínek opakovatelnosti (přesnost) nacházela v intervalu 0,29 2,6 % a lze ji tedy považovat za velmi dobrou až dobrou. Výjimkou je standardní metoda fotometrického stanovení dusičnanů, protože variační koeficient této metody (4,9 %) je prokazatelně nad hranicí 3 %. Všechny ostatní hodnoty však vyhovují. Je vidět, že přesnost kyvetových testů na mangan a dusičnany je lepší než v případě standardní fotometrické metody. Obecně lze říci, že meze stanovitelnosti kyvetových testů jsou řádově stejné jako u standardizovaných fotometrických metod. Obr. 7: Kyvetový test LCK521 (železo, stopy)
ANALÝZA PITNÉ VODY_SHRNUTÍ Závěrečné vyhodnocení validace Ve validační studii IWW bylo experimentálně zvalidováno devět fotometrických kyvetových testů LANGE a jejich statistické parametry byly zkoumány a vyhodnoceny se zřetelem na požadavky příslušné vyhlášky o pitné vodě z roku 2001. Kyvetové testy pro stanovení hliníku, amonia, železa (stopy), manganu (stopy), dusičnanů a dusitanů (stopy) vyhovují požadavkům Vyhlášky o pitné vodě z roku 2001 s ohledem na správnost, přesnost a mez detekce v rámci statistických charakteristik. Všechny statistické charakteristiky jsou pod hranicí 10 %. Na základě stanovených statistických charakteristik jsou tyto kyvetové testy v zásadě vhodné k použití při analýze pitné a neupravené vody. Vyhláška o pitné vodě z roku 2001 nestanoví žádné statistické charakteristiky pro tři zkoumané kyvetové testy HACH LANGE: chlór (volný), chlór (celkový) a orthofosforečnany. Statistické charakteristiky pro kyvetový test na stanovení orthofosforečnanů (správnost, přesnost a mez stanovitelnosti) jsou všechny pod hranicí 10 %. Tento kyvetový test by tudíž také splnil tři charakteristiky účinnosti a vyhověl by příslušným kritériím. V případě kyvetových testů na chlór (volný) a chlór (celkový) je přesnost a mez stanovitelnosti nad 10 % a správnost je pod 10 %. Kyvetový test LANGE Princip měření Odchylka je podobný jako správnosti u standardu 10 % Odchylka přesnosti 10 % LCK301 Hliník Ne Ano Ano Ano LCK304 Amonium Ano Ano Ano Ano LCK521 Železo, stopy Ano Ano Ano Ano LCW532 Mangan, stopy Ne Ano Ano Ano LCK339 Dusičnany Ano Ano Ano Ano LCK541 Dusitany, stopy Ano Ano Ano Ano Tabulka 4: Statistické charakteristiky kyvetových testů LANGE Obr. 8: Kyvetový test na stanovení dusičnanů LCK339 Z tohoto výsledku vyplývá, že statistické charakteristiky jsou většinou řádově stejné jako u standardních fotometrických metod. Je to způsobeno omezenou stabilitou kontrolních roztoků standardu, které se musejí připravit čerstvé a jsou tudíž nezávislé na typu analytické metody. Mez odchylky stanovitelnosti 10 % Literatura [1] Prüfung und Bewertung ausgewählter HACH LANGE Prüfverfahren für die Untersuchung von Trinkwasser gemäß Trinkwasserverordnung 2001, 2008, IWW Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasser Beratungs- und Entwicklungsgesellschaft mbh, Moritzstraße 26, 45476 Mülheim an der Ruhr [2] Verordnung über die Qualität von Wasser für den menschlichen Gebrauch (Trinkwasserverordnung TrinkwV 2001) vom 21. Mai 2001; BGBl., Teil I, Nr. 24 vom 28.05.2001, S. 959-980 [3] DIN EN ISO/IEC 17025: 2005-08; Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien (ISO/IEC 17025:2005); Deutsche und Englische Fassung EN ISO/IEC 17025:2005 [4] Liste der Aufbereitungsstoffe und Desinfektionsverfahren gemäß 11 Trinkwasserverordnung 2001, Umwelt Bundesamt 2004 [5] Qualitätssicherung in der Analytischen Chemie, Funk W., Dammann V., Donnevert G, 2005; Wiley-VCH, Weinheim DOC042.85.20035.Apr09