2 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie Životopis RNDr. Běla Tůmová, DrSc., absolvovala Přírodovědeckou fakultu Univerzity Karlovy v roce 1952. V letech 1952 1956 pracovala na oddělení diagnostiky a výzkumu virových infekcí Institutu hygieny a epidemiologie v Praze, dále pak v rozmezí let 1957 1997 jako vedoucí Oddělení virových respiračních nákaz a Národní referenční laboratoře pro chřipku ve Státním zdravotním ústavu. Vybudovala mezinárodně uznávané pracoviště aplikovaného a základního výzkumu, kde bylo prioritně dosaženo izolace nových chřipkových virů zvířat. Účastnila se na světovém výzkumu těchto kmenů a první klasifikaci a diagnostiky virových respiračních infekcí. V roce 1963 obhájila kandidátskou práci na téma Výskyt chřipky v Československu v letech 1950 1962. Doktorka Tůmová získala Cenu Vědecké rady Ministerstva zdravotnictví ČR (1974) za výsledky studia biologie a epidemiologie respiračních virů, v roce 1982 získala Pracovní skupina virových respiračních infekcí (jíž byla členem) Národní cenu České republiky za výsledky výzkumné činnosti v diagnostice, epidemiologii a profylaxi virových nákaz dýchacích cest. Doktorskou práci na téma Ekologie viru chřipky nové aspekty studia chřipky lidí a zvířat obhájila v roce 1984. Ve World Influenza Centre v Londýně (WHO Collab. Centrum, Medical Research Council) pracovala autorka v rozmezí let 1963 1964, kdy zde byl prokázán reasortment mezi lidským a zvířecím virem. Jako visiting professor působila na University of Wisconsin v Madisonu, USA (1968 1970), kde se kromě výuky virologie zabývala výzkumem ekologie virů ptačí chřipky, přenosem viru migrujícími ptáky a příbuzností kmenů pandemie 1968 s kmeny izolovanými z vodních ptáků. V letech 1957 1998 se účastnila krátkodobých studijních a pracovních pobytů v ústavech, zabývajících se virologickou tematikou, a to v Moskvě, Petrohradu, Berlíně, Atlantě, Helsinkách, Turku, Paříži, Stockholmu a v Glasgow. V roce 1974 se stala členkou Českomoravské společnosti mikrobiologické ČSAV, v roce 2000 pak čestnou členkou České lékařské společnosti JEP v sekci mikrobiologie a epidemiologie, byla také přijata za členku New York Academy of Sciences (1994). Dále byla členkou WHO Expert Committee on Zoonosis, členkou poradní skupiny WHO Advising Group for Human and Animal Influenza, členkou European Influenza Surveillance Scheme v Utrechtu (do roku 1998) a také členkou European Group of Virus Diagnostic v Londýně (do roku 1997). Viceprezidentkou vědecké společnosti European Scientic Working Group of Influenza v Bruselu pak byla v období let 1993 1996. Doktorka B. Tůmová byla autorkou více než 250 vědeckých sdělení, publikovaných v domácích i zahraničních odborných časopisech a také spoluautorkou 8 zahraničních monografií. Přeložila publikaci Viruses of Vertebrates, která vyšla v r. 1977. Od roku 2001 pracovala na původní verzi a novelách Národního pandemického plánu České republiky, nadále se na epidemiologickém oddělení Hygienické stanice Hlavního města Prahy účastnila analýzy epidemie SARS a výskytu viru A/H5N1 a lidských onemocnění ve světě. Svoji životní publikaci o ptačí chřipce, kterou intenzivně připravovala dva roky, dokončila před svým úmrtím dne 18. dubna 2007.
4 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie RNDr. Běla Tůmová, DrSc. ( 2007) PTAČÍ CHŘIPKA trvalá hrozba pandemie Knihu uspořádali a k vydání připravili RNDr. Augustin Štumpa, CSc., a MUDr. Martina Havlíčková, CSc. Recenzenti: Prof. MUDr. Vladimír Vonka, DrSc. Prof. MUDr. Jiří Beran, CSc. Grada Publishing, a.s., 2008 Obrázky dodali autoři. Cover Photo profimedia.cz, 2008 Vydala Grada Publishing, a.s. U Průhonu 22, Praha 7 jako svou 3272. publikaci Odpovědný redaktor Jan Lomíček Sazba a zlom Linda Marečková Počet stran 136 + 8 stran barevné přílohy 1. vydání, Praha 2008 Vytiskla tiskárna PBtisk, s.r.o., Prokopská 8, Příbram VI Tato publikace je určena pro odbornou zdravotnickou veřejnost a pracovníky ve zdravotnictví vybraných oborů. Autoři i nakladatelství se omlouvají za sníženou kvalitu některých obrázků, způsobenou nižší kvalitou jejich podkladů. Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno. Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory, pořadatele ani pro nakladatelství žádné právní důsledky. Všechna práva vyhrazena. Tato kniha ani její část nesmějí být žádným způsobem reprodukovány, ukládány či rozšiřovány bez písemného souhlasu nakladatelství. ISBN 978-80-247-1986-3 (tištěná verze) ISBN 978-80-247-6319-4 (elektronická verze ve formátu PDF) Grada Publishing, a.s. 2011
5 Obsah Seznam použitých zkratek........................................ 7 Předmluva.................................................... 10 1 Úvod do problematiky....................................... 12 1.1 Virus chřipky........................................... 12 1.1.1 Struktura viru chřipky typu A........................ 12 1.1.2 Genom, virové proteiny, jejich funkce a vlastnosti....... 14 1.2 Pandemie.............................................. 20 2 Co je ptačí chřipka?......................................... 22 2.1 Historie............................................... 22 2.2 Charakteristika a evoluce linií viru chřipky................... 27 2.3 Charakteristika onemocnění a vlastnosti ptačí chřipky........... 31 2.3.1 Výskyt a šíření ptačích virů......................... 34 2.3.2 Ptačí chřipka a mezidruhový přenos.................. 38 2.3.3 Přenos ptačí chřipky na člověka...................... 42 2.4 Poznatky z výskytů a šíření ptačí chřipky v období 1957 1980.... 44 3 Epizoocie patogenních kmenů ptačí chřipky (1997 2006)......... 48 3.1 Epizoocie ve světě před rokem 2003........................ 48 3.1.1 Epizoocie subtypu H5 a H7 (HPAI) ve světě před rokem 2003........................... 48 3.2 Panzoocie viru H5N1 v Asii............................... 49 3.3 Expanze viru mimo Čínu a význam migrujících ptáků........... 54 4 Ptačí chřipka u lidí.......................................... 61 4.1 Epidemiologie lidských infekcí............................ 61 4.1.1 Průběh výskytu ptačí chřipky u lidí v Asii.............. 63 4.1.2 Charakteristika výskytu H5N1 a H9N2 u lidí a jeho zvláštnosti............................. 64 4.1.3 Nástup subtypu H5N1 úvod k panzoocii a ptačí chřipka u lidí 2003 2005..................... 66 4.1.4 Ptačí chřipka v období 2005 únor 2007............... 69 4.1.5 Zvláštnosti výskytu jiných subtypů viru u lidí ve světě.... 75 4.1.6 Zdroj a cesta nákazy lidí ptačí chřipkou................ 78 4.1.7 Pacienti, inkubační doba infekce, věkové složení........ 84 4.1.8 Prevence ptačí chřipky u lidí, obecná opatření........... 86 4.2 Onemocnění lidí ptačí chřipkou............................ 88 4.2.1 Klinický obraz a nálezy............................ 90
6 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie 4.2.2 Patogeneze, patologie.............................. 98 4.2.3 Stanovení diagnózy.............................. 105 4.3 Laboratorní diagnostika viru sezónní a ptačí chřipky........... 106 4.3.1 Odběr klinického materiálu........................ 107 4.3.2 Odběr a zasílání vzorků........................... 110 4.3.3 Hodnocení výsledků expresních testů................ 110 5 Ptačí chřipka poučení, závěry a perspektiva.................. 112 5.1 Proč nedošlo dosud k pandemii ptačí chřipky?................ 112 5.2 Je příští pandemie nevyhnutelná a jak jsme na ni připraveni?.... 114 5.2.1 Je příští pandemie nevyhnutelná?.................... 114 5.2.2 Jak jsme připraveni?.............................. 118 Zcela na závěr................................................ 120 Použitá literatura............................................. 121 Doporučení organizací......................................... 132 Rejstřík..................................................... 134
Seznam použitých zkratek 7 Seznam použitých zkratek aa ADNS AGES ARI ARDS BL3 CNS CRLAI ČČK D/kD DD DEFRA DIC ECDC EDQM EISS EMEA ENSIP ER EU/EC EUROGROG FAO FVL GA GIT HA/H HCD HEF HIT HPAI CHOPN IF IFN ILI INFOSAN KF, KFR LPAI M1 M2 aminoacid/aminokyseliny Animal diseases notification system Austrian Health and Foot Safety Agency akutní respirační infekce syndrom akutní dechové tísně stupeň bezpečnostního režimu práce centrální nervový systém Community reference laboratory for avian influenza Český červený kříž Dalton/kiloDalton domov důchodců Department for Enviroment Food and Rural Affairs diseminovaná intravaskulární koagulace Evropské centrum pro kontrolu a prevenci chorob European department for quality of medicines European influenza surveillance scheme European agency for the evaluation of medicinal products European network for surveillance of influenza in pigs endoplazmatické retikulum Evropská unie (European community) Francouzská organizace, Evropský systém surveillance Food and agriculture organization Fakulta veterinárního lékařství v Brně Golgiho aparát gastronitestinální trakt hemaglutinin horní cesty dýchací hemaglutinin-esteráza fuzní protein test inhibice hemaglutinace High pathogenic avian influenza (vysoce patogenní ptačí virus) chronická obstrukční plicní nemoc test imunofluorescence interferon (alfa, beta, gama) Influenza like illness (chřipce podobná onemocnění) International Food Safety Authorites Network test vazby komplementu Low pathogenic avian influenza (nízko patogenní ptačí virus) Matrix protein membránový protein, iontový kanál
8 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie MDCK Mr MS NA/N NCAED NP NPP NRL/NIC NRL-NDAI NS (1, 2) nt OIE OIT PA, PB1, PB2 PAHO PBS PCR PPEC PPG PS NPP PX RDS RNA mrna ss RNP SARS SVS SVÚ SZO/WHO SZÚ TNF ÚSP buňky Madin darby canine kidney cells relativní molekulová hmotnost Member states neuraminidáza Národní referenční centrum pro analýzu epidemiologických dat nukleoprotein (nukleokapsidový protein) Národní pandemický plán Národní referenční laboratoř (National influenza centre), označení dle WHO Národní referenční laboratoř pro patog. aviární influenzu nestrukturální protein/gen nukleotid International office for epizootic Community influenza outbreak investigation team polymerázy RNA Panamerican health organization fosfátový pufr polymerázová řetězová reakce Pandemický plán EU (Community influenza pandemic preparedness plan) Koordinační skupina Pandemického plánu (Community influenza pandemic preparadness coordination group) pracovní skupina Národního pandemického plánu peroxidázový test Respiratory distress syndrome (projev šokové plíce) ribonukleová kyselina messenger RNA (matrice pro proteosyntézu) jednovláknitá RNA (z angl. single strand) ribonukleoprotein (komplex RNA s proteiny) Severe acute respiratory syndrome (těžký akutní respirační syndrom) Státní veterinární správa Státní veterinární ústav Světová zdravotnická organizace Státní zdravotní ústav Thumor necrosis factor ústav sociální péče Zkratky aminokyselin Ala, A alanin Arg, R arginin
Seznam použitých zkratek 9 Asn, N Asp, D Cys, C His, H Gln, Q GLu, E Gly, Gg Lys, K Leu, L Pro, P Ser, S Thr, T Ura, U Val, V asparagin kyselina asparagová cystein histidin glutamin kyselina glutamová glycin lysin leucin prolin serin treonin uracil valin Forma aa/číslo/aa znamená: změnu/substituci jedné aa za jinou aa na určité číslem označené pozici.
10 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie Předmluva Než se v Hongkongu na začátku století začala šířit epizoocie ptačího viru chřipky, málokdo věděl, kromě úzké skupiny odborníků, co je to ptačí chřipka. Rozhodně nikdo v té době nepředpokládal, že postupně zachvátí většinu asijských států a během několika měsíců se objeví v dalších kontinentech. Tehdy vzrůstaly obavy z vývoje vysoce patogenního ptačího viru v plně lidský patogen a vybavila se téměř zapomenutá souvislost s ptačím původem pandemií 20. století, včetně tolikrát s obavami citované smrtící pandemie v letech 1918 1919. Od posledních pandemií v roce 1968 a ještě před tím o 10 let dříve v roce 1957, kdy se objevila zcela nová varianta viru, uplynulo 50 let. Pokud by skutečně platil často udávaný interval mezi dvěma pandemiemi 30 50 let, což je pouhý hypotetický odhad, můžeme být blízko první pandemie 21. století. Situace je ale složitější chování viru a jeho genetického kódu se nedá předem ani odhadovat, ani vypočítat. Předchozích 50 let přineslo mnoho dílčích poznatků o struktuře a biologii viru chřipky a především objevilo a potvrdilo účast virů ptačí chřipky na vzniku shiftových, pandemických variant, a to včetně té z roku 1918. Ukazuje se ale, že to stále nestačí k tomu, abychom mohli říci, kdy, kde a zda vůbec právě teď dojde k další pandemii. Znalosti o vlastnostech chřipkového viru a o možnostech jeho nevyzpytatelného genomu jsou stále nedostatečné a známe velice málo o genofondu chřipkových virů i o jejich koloběhu v přírodě. Ani teď po desetiletých asijských zkušenostech nevíme, jak se vytvoří patogenní pandemický virus schopný mezilidského přenosu z těch mnoha variant a linií, které se dále šíří v populaci ptáků domácích i volně žijících a dokáží nejen vyhubit tisícihlavé chovy, ale usmrtit i člověka. Snaha ukázat výsledky mnoholeté práce desítek badatelů, a to v laboratořích i terénu, kteří stále usilují o každý i sebemenší pokrok v objasnění problémů, které nám zašifrovala příroda, byl jeden z důvodů, proč vznikla tato knížka. Také proto, že se na základech tohoto studia významně podílel i československý tým virologů, veterinářů a ornitologů v národní i mezinárodní spolupráci. Předkládaná publikace seznámí čtenáře s pozoruhodnou historií vzniku problému ptačí chřipky, nebezpečím pandemií a hypotéz jejich vzniku, až po současnou panzoocii způsobenou virem H5N1, která se nesměle ohlásila v roce 1997, ale od konce roku 2003 do prvních měsíců roku 2007 postihla v obrovských rozměrech Asii a rozšířila nebezpečnou nákazu do Afriky, na Střední východ a do Evropy. Časovanou bombu (abych zachovala mediální kolorit) máme tedy přímo v domě. Stamilionové ztráty ekonomické, provázející současnou panzoocii, a zejména onemocnění lidí s vysokou až 70% smrtností je třeba brát vážně; stejné ztráty ekonomické a velmi pravděpodobně i lidské oběti budou provázet každou chřipkovou pandemii. Je proto nutné využít zkušenosti, které jsme nečekaně zís-
Předmluva 11 kali, a využít možností sice omezených, ale účinných preventivních opatření pro případ humanizace ptačího viru a jeho pandemického rozšíření, a to nejen v současné aktuální hrozbě H5N1, ale i v budoucnosti; nebezpečí nové ptačí varianty nám bude hrozit stále. V jaké podobě, to je stále otázka. Kniha je určená všem, kteří se o tuto problematiku zajímají z obecného zájmu nebo z profesní nutnosti zdravotnickým a veterinárním pracovníkům, mladým přírodovědcům i státní správě, která by se rovněž měla systematicky na pandemii připravit. Práce na knize, která by měla uchovat v paměti historii i současně probíhající panzoocii ptačí chřipky, byla velmi náročná, zejména výběr jenom podstatných zpráv ze záplavy informací včetně vědeckých článků, které se v posledních 7 letech rozrostly do nebývalých rozměrů. Zda se mi podařilo připravit srozumitelný přehled od raných začátků problému ptačí chřipky do stále otevřené budoucnosti, nechť posoudí vážený čtenář. Závěrem musím poděkovat všem, kteří velkou měrou přispěli k tomu, že tato monografie vznikla a byla dokončena. Především děkuji nakladatelství Grada Publishing, recenzentům prof. MUDr. Jiřímu Beranovi, CSc., a prof. MUDr. Vladimíru Vonkovi, DrSc., za cenné připomínky, Dr. Schramlové za poskytnutí elektronmikroskopického snímku viru chřipky, svým kolegyním z Národního chřipkového centra a z epidemiologického odboru a vedení mého současného pracoviště. Dík patří slečně Vlčkové za trpělivost s přepisováním a opravami textu i dokumentace a také mému manželovi Dr. Štumpovi za pochopení a toleranci. Běla Tůmová
12 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie 1 Úvod do problematiky 1.1 Virus chřipky Viry chřipky patří do čeledi Orthomyxoviridae [7, 87], kterou tvoří celkem 4 rody: chřipka A, chřipka B, chřipka C a Thogovirus. Viry typu A, které tvoří skupinu nejpočetnější, jsou rozlišeny od typu B a C na základě antigenního rozdílu v NP (nukleokapsidový protein) a proteinech M (matrix a membránový protein). Influenza virus A je dále řazen do různých subtypů podle typu dvou hlavních povrchových glykoproteinů hemaglutininu HA (nebo H) a neuraminidázy NA (nebo N). V současnosti je známo celkem 16 subtypů HA a 9 NA, z nichž pouze tři HA a dvě NA se vyskytují u lidí, všechny ostatní jsou součástí skupiny ptačích virů. Obr. 1.1 Virus chřipky elektronoptické znázornění sférické části s glykoproteinovými výběžky HA a NA na obalu viru 1.1.1 Struktura viru chřipky typu A Virová částice má pleiomorfní, kulovitý nebo vláknitý tvar o velikosti 80 120 nm. Lipidový obal je odvozený od plazmatické membrány hostitelské buňky. Obal viru je tvořen dvěma hlavními glykoproteiny ve tvaru výběžků ukotvených v lipidové dvouvrstvě o délce 10 14 nm, které tvoří HA a NA, poměr HA a NA je obvykle
Úvod do problematiky 13 4 : 1 až 5 : 1. HA má tvar trimeru, NA je tetramer houbě podobného tvaru na tyčce, jejíž délka se mění podle kmene a stupně patogenity. Membránou obalu prochází rovněž tzv. protein M2. Matrixový protein M1 je navázán na vnitřní stranu membrány a je spojen s ribonukleoproteinovým jádrem virionu (RNP). RNP má tvar volných tyčinek a obsahuje další 4 proteiny a RNA. Hlavní proteinovou složkou RNP je nukleokapsidový protein NP a takzvaný polymerázový komplex tvořený třemi polymerázami PB1, PB2 a PA. NS2 (nestrukturální protein, v malém množství v purifikovaném viru) lipidická dvojvrstva NA (neuraminidáza) 1 2 3 4 5 6 7 8 PB2 PB1 PA HA NP NA M 1 + M 2 NS 1 + NS 2 HA (hemaglutinin) M2 (iontový kanál) M1 (matrix protein) PB1, PB2, PA (transkriptázový komplex) NP (nukleokapsida) RNA RNP PB1 PB2 PA NP NS1 (nestrukturální protein, přítomen pouze v infikovaných buňkách) Obr. 1.2 Schéma struktury chřipkového virionu Virus chřipky patří do skupiny obalených virů RNA s negativním vláknem nukleové kyseliny a segmentovaným genomem (tabulka 1.1). Virová partikule obsahuje celkem osm segmentů, které nesou na 5 a 3 konci konzervativní sekvence. S výjimkou N a NS je každý protein kódován jedním segmentem. Každý z nich má specifické vlastnosti, které se uplatňují v patogenezi infekce.
14 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie Tab. 1.1 Složení geonomu viru chřipky typu A; kódované proteiny, typ a funkce jednotlivých částí Genom, kódované proteiny, typ a funkce jednotlivých částí genom kódové proteiny počet délka molekul typ funkce segment délka název (aa) virionu endonukleáza, zahájení 1 2341 PB2 759 30 60 transkripce mrna polymerázový 2 2341 PB1 759 30 60 transkripce syntéza řetězce RNA komplex transkripce replikace viru, 3 2233 PA 716 30 60 proteolytická aktivita membránový adsorbce na buněčné receptory, 4 1778 HA 566 500 5 1565 NP 498 1000 6 1413 NA 454 100 7 1027 8 890 M1 252 3000 M2 97 20 60 NS1 230 glykoprotein hlavní struktura protein asociující s virovou RNA membránový glykoprotein strukturální protein pod obalem viru integrální protein v obalu nestrukturální protein v jádře NS2 121 NEP neutralizační protilátky v komplexu RNA a transkriptázou umožňuje transport z cytoplazmy do jádra enzym štěpící kyselinu sialovou uvolňuje virus z buňky protilátky omezují šíření viru účast na pučení viru z buňky, největší protein viru iontový kanál inhibuje proces buněčné RNA, transport sestřih translace a proteosyntéza export virové RNA z jádra buňky do cytoplazmy Viry s geonomem RNA mají ve virové partikuli vlastní RNA dependentní RNA transkriptázu, která z negativního vlákna RNA přepisuje virovou mrna, která slouží jako matrice pro syntézu virových proteinů. Syntéza proteinů probíhá v cytoplazmě infikované buňky. 1.1.2 Genom, virové proteiny, jejich funkce a vlastnosti Základní znalosti funkce a vlastností proteinů jsou postupně měněny nebo doplňovány novými poznatky, které přinesla asijská panzoocie ptačí chřipky. Týká se to zejména změn sekvence aminokyselin vnitřních proteinů, které souvisí s chováním a vlastnostmi viru, patogenity, virulence a druhů hostitelů. Nukleoprotein (NP) je jedním z nejdůležitějších genů, který určuje druhovou specifitu hostitele, kóduje vnitřní pro typ specifický protein a je značně stabilní, protože není vystaven vnějším tlakům. Lidský NP nashromáždil za 50 let výskytu 39 změn aminokyselin, zatímco ptačích pouze 0 10. Podle složení a pozice aminokyselin lze odlišit kmeny lidské od kmenů ptačích, prasat a koní. Polymerázy, PB1, PB2 a PA tvoří největší komplex, uplatňují se v replikaci viru a při transkripci RNA a spoluurčují charakter patogenity viru [48].
Úvod do problematiky 15 Hemaglutinin je hlavním proteinem virového obalu, je kódován čtvrtým segmentem geonomu a zodpovídá za schopnost virionu aglutinovat červené krvinky (odtud název). Je současně hlavním antigenem, proti nemuž jsou tvořeny obranné virus neutralizační protilátky, které brání nákaze antigenně shodným virem. Je spoluodpovědný za patogenitu, druhovou specifitu viru a za vstup do hostitelské buňky vazbou viru na specifické buněčné receptory. Hemaglutinin je syntetizován jako jedna molekula, tzv. prekurzorový hemaglutinin H0, který vyžaduje posttranslační rozštěpení na subjednotky HA1 a HA2 vzájemně spojené dvěma sulfidovými můstky. Podle chrakteru štěpného místa a typu proteáz u ptačích kmenů rozlišujeme tzv. varianty vysoce a nízce patogenní (HPAI high pathogenity avian influenza a LPAI low pathogenity avian influenza). Běžnou a nejčatěší formou viru je varianta LPAI, vstup i replikace viru jsou vázány na buňky respiračního a zažívacího traktu, což je dáno přítomností proteáz serinového typu. Nahromadění bazických aminokyselin v této oblasti umožní štěpení širokému spektru proteáz (trypsin-like), což viru umožní jeho invazi do celé řady tkání (HPAI). Vysoce patogenní viry HPAI vyvolávají generalizovanou infekci provázenou vysokou úmrtností. U ptáků postihují všechny orgány [7, 22, 23, 28, 85]. U vodních ptáků, kteří jsou přirozeným rezervoárem virů chřipky, je infekce obvykle asymptomatická a lokalizace viru je většinou omezena na trávicí trakt. Patogenita, virulence a druhová specifita viru je sice kontrolována několika geny, ale HA pravděpodobně hraje v tomto procesu klíčovou roli. Některé úseky tohoto proteinu mohou být určující pro tzv. překročení druhové bariéry, tedy při adaptaci viru ze zvířecího rezervoáru na člověka. HA patří k nejdůkladněji zmapovaným proteinům viru chřipky a jsou známy úseky HA, které vstupují při adsorbci do vazby s povrchovými receptory na hostitelských buňkách. Tento proces je považován za určující pro vznik pandemické varianty [85]. Receptory pro vazbu virů jsou specifické a odlišné pro ptačí i humánní typ buněk. Virus ptačí či koňské chřipky se váže na receptor s alfa(2,3)-kyselinou sialovou, lidské viry se váží na receptory tvořené kyselinou sialovou v alfa (2,6) spojení s galaktózou postranního cukerného řetězce. Prase má na povrchu buněk trachey receptory s oběma typy vazby [7]. Toto zjištění podporovalo hypotézu o roli prasete jako tzv. míchací nádoby, vhodné pro vznik pandemického kmene. Prase je tedy možno infikovat jak viry ptačími, tak viry lidskými. Klíčovým místem HA (ne však jediným) je aminokyselina na pozici 226, která určuje predominantní afinitu na ptačí (glutamin), respektive savčí (leucin) typ povrchového receptoru. Přítomnost glutaminu na pozici 226 ale neznamená, že virus není schopen infikovat člověka za blíže nejasných podmínek. Tento fakt potvrzují opakované případy (od roku 1997) infekce člověka virem ptačí chřipky subtypu H5N1 v jihovýchodní Asii, což zpochybňuje hypotézu nutného mezičlánku (prasete) při přenosu viru chřipky na člověka. Na tomto místě je třeba podotknout, že celý proces infekce je komplexní, proto i vznik pandemické varianty je pravděpodobně výsledkem celého souhrnu postupných adaptačních změn.
16 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie Neuraminidáza Jedná se o integrální membránový protein hrající roli v sestavení kompletní virové částice a jejího následného uvolnění z buňky. Protilátky tvořené proti tomuto antigenu i proti HA jsou virus neutralizační. Nukleokapsidový protein (NP) Je složkou zodpovědnou za aktivaci imunitní reakce zprostředkované cytotoxickými lymfocyty T. Po syntéze v cytoplazmě putuje NP do jádra, kde tvoří komplex s virovou negativní genomovou RNA a zahajuje transport RNP do cytoplazmy. Zdá se, že tento protein hraje klíčovou roli v regulaci virového cyklu, a to přepínáním z replikační fáze do fáze sestavení viru. Matrix protein M2 Tvoří iontový kanál v membráně viru a je cílem pro specifickou terapii, amantadin, resp. Rimantadin. Hraje zřejmě roli ve svlečení viru, tedy uvolnění RNP do cytoplazmy. Protein NS1 Protein NS1 je exprimován ve velkém množství v infikovaných buňkách, ale je prakticky nedetekovatelný ve virové partikuli, je nestrukturním multifunkčním proteinem zodpovědným za regulaci životního cyklu viru, ovlivňuje cytokinovou reakci organizmu a hraje tak významnou roli v patogenezi nemoci. HA seskupení virových částí, zabalení, pučení u cytoplazmatické membrány uvolnění viru z infikované buňky M2 NA adsorpce Amantadine inhibitory neuraminidázy sirna (regulace translace) mrna svlečení RNA endocytóza a fúze Obr. 1.3 Životní cyklus a replikace viru
Úvod do problematiky 17 Nestrukturní protein NS2 Obvykle se nachází v komplexu s matrixovým proteinem M1 a je považován za dalšího prostředníka zodpovědného za export RNP z jádra infikované buňky do cytoplazmy v průběhu virové replikace. Ve virionu se vyskytuje jen v limitovaném množství a někdy se označuje jako NEP nukleus export protein. Adsorpce a vstup viru do buňky a jeho svlečení Virus se váže na specifické buněčné receptory (adsorpce) a do buňky vstupuje virus endocytózou zprostředkovanou receptorem. Dochází k vazbě HA na mukoproteiny s koncovou N-acetylovou neuraminidovou kyselinou na jejich proximálním konci (tzv. NANA). Internalizované vehikuly (váčky) fúzují s endozomy, tedy s buněčnými organelami s kyselým vnitřním prostředím, kde dochází ke svlečení viru a následně k uvolnění nukleokapsidy do cytoplazmy. RNP pak vstupuje do buněčného jádra, kde dochází k vlastní virové replikaci (viz obrázek 1.3). Import RNP do jádra, replikace viru A Nukleokapsida (RNP) je transportována do jádra infikované buňky, kde dochází k aktivaci virového enzymatického aparátu a k vlastní replikaci viru (tvorba RNA). Veškerá syntéza RNA probíhá v jádře infikované buňky, a z části využívá hostitelský aparát. Virus je zcela adaptován na specifický eukaryotický transkripční systém. Prostřednictvím komplexu replikačních enzymů (PB 2, PB1, PA), které jsou součástí virové partikule, dokáže zcela využít hostitelský aparát pro zahájení syntézy mrna (tedy matrice pro virové proteiny) a pro replikaci vlastní virové jednořetězové (ss) RNA. Z každého vlákna ssrna- se přepisují 2 typy pozitivní RNA; mrna je exportována do cytoplazmy, adenylována a slouží jako matrice pro překlad proteinů a dále kompletní vrna. Ta pak představuje tzv. progenomovou matrici pro syntézu negativního vlákna genomové RNA, která je asociována s proteiny a exportována do nově se tvořící virové partikule Tvorba virové partikule a její pučení a uvolnění viru z hostitelské buňky Novotvořené RNA jsou exportovány z jádra do cytoplazmy (NS1, NEP). V cytoplazmě dochází k syntéze proteinů pomocí buněčného aparátu na membránách endoplazmatického retikula a k jejich tzv. posttranslační modifikaci, např. přidání cukerné složky, glykosylaci za pomoci buněčného aparátu (Golgi GA). Jednotlivé komponenty jsou dopraveny prostřednictvím GA pod buněčnou membránu, kde dochází k seskupení všech virových složek (tedy segmentů RNP, NA, HA, M2), k pučení a následnému uvolnění viru z buňky. Proces vlastní tvorby virové částice není ještě definitivně znám, ale je zásadní pro vznik nového subtypu a tedy pro vznik případné pandemické varianty. Původní domněnka, že zabalení segmentů do virionu je náhodným procesem, není platná, čemuž odpovídá i chování viru. Na správném zabalení se zřejmě podílí cytoplazmatická HA [5] a za uvolnění viru z povrchu infikované buňky je zodpovědná NA. Uvolnění kompletního viru
18 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie * z buňky zabraňují inhibitory NA, syntetické látky tohoto typu se používají k léčbě a prevenci chřipky nejznámější preparáty na této bázi jsou zanamivir a oseltamivir (komerční název prepatátu je Relenza a Tamiflu). Antigenní shift versus antigenní drift, vznik pandemické varianty Mechanizmus replikace a následného sestřihu RNA přispívá k vysokému počtu mutací viru a tedy k možnosti jeho úniku obranným mechanizmům hostitele. V podstatě jde o výměnu jednotlivých aminokyselin ve struktuře genu procesem nazývaným drift, což je postupná změna antigenních vlastností viru v průběhu cirkulace viru v lidské populaci. Segmentovaný genom a poměrně široké hostitelské spektrum viru chřipky typu A u lidí a zvířat umožňuje tvorbu zcela nových kombinací genů (shift), čímž vznikne náhle virus nových antigenních nebo biologicky odlišných kvalit. K takzvanému antigennímu shiftu může dojít při smíšené infekci jedné buňky dvěma a více subtypy viru. Při procesu balení virové částice může dojít ke kombinaci různých segmentů RNP v rámci tvorby jedné partikule a tedy k zabalení cizích genů do příslušné virové partikule (tzv. reasortment). Při zabalení jiného typu HA či NA dochází k dramatické změně antigenních vlastností viru, popřípadě hostitelského spektra a virulence (díky novému typu HA) a tedy ke vzniku zcela nové varianty viru v populaci antigenní shift [10]. Důsledkem antigenního shiftu může být (a opakovaně byl) vznik pandemických variant, jak znázorňuje obrázek 1.4. Obr. 1.4 Vznik shiftových pandemických variant viru chřipky V pandemii roku 1918 není jasné, zda všech 8 segmentů RNP bylo přeneseno z ptačího rezervoáru, a rovněž role prasete v transmisi viru na člověka není prokázána; virus této takzvané pandemie Španělské chřipky (označovaný dnes jako H1N1) byl pravděpodobně zavlečen vojáky v době 1. světové války
Úvod do problematiky 19 ze Severní Ameriky do Evropy a současně se začal šířit po celém světě. V roce 1957 tzv. Asijský pandemický virus získal kromě PB1 další dva důležité nové geny z ptačího viru, takže mohla vzniknout dokonalá shiftová varianta A(H2N2) s oběma zcela novými obalovými antigeny H a N. Po adaptaci na člověka byla schopna snadno vyvolat pandemii ve zcela neimunní světové populaci. V roce 1968 se objevila pandemie tzv. Hongkongské chřipky A(H3N2), která měla pouze 2 geny PB1 a HA z ptačího zdroje a N2 shodný s kmeny z předchozí pandemie [2]. Tento shift vznikl velmi pravděpodobně reasortmentem ptačího a lidského kmene. S rozšířením subtypu A(H3N2) vymizel subtyp A(H2N2). V roce 1977 došlo k epidemii tzv. Ruské chřipky a pandemickému rozšíření staronového subtypu A(H1N1); původ a způsob vzniku nebyl jednoznačně objasněn. Nevylučuje se ani únik viru z laboratoře při používání živé protichřipkové vakcíny. V současnosti v lidské populaci cirkulují oba subtypy A(H1N1) a A(H3N2) a jejich téměř 40letý výskyt provázejí stále driftové změny, které při velkých driftech komplikují ochranný efekt vyráběných vakcín [4, 9, 10]. Mutační potenciál chřipkového viru je značný u lidských kmenů, ale ptačí kmeny se z evoluční stáze do vývojové fáze dostávají teprve při přechodu na nového hostitele; příkladem mohou být kmeny H5N1 v epizoociích u kuřat v Hongkongu a dalších zemích [15a]. Mechanizmus, který tento proces přechodu na nového hostitele (převážně savce) ovlivňuje, není zcela jasný, předpokladem jsou změny ve struktuře HA a NA, které byly prokázány nejen u kmenů H5, H7 a H9 [33], ale i v dalších genech. Vysoká variabilita a časté změny obalových antigenů, jako je antigenní drift, což je typická vlastnost lidských a některých savčích kmenů (prasat a koní), nebyla potvrzena u ptačích virů, které nejsou ovlivňovány při své replikaci selekčním tlakem protilátek. Změny sekvencí aminokyselin proteinů nacházejících se jak na povrchu, tak uvnitř virionu byly však prokázány, ale nejsou vždy provázeny odlišným projevem viru v patogenezi onemocnění. Výměna antigenů HA a NA je ale naopak velmi častá a logicky vyplývá ze způsobu života ptáků a časté příležitosti k nové infekci odlišnými kmeny i subtypy; ty jsou zjišťovány v endemických oblastech a u volně žijících druhů. Změny pouze vnitřních genů beze změn HA a NA bývají výsledkem reasortmentu a nebo změn v uspořádání aminokyselin, jak byly zaznamenány při četných epizoociích v jihovýchodní Asii u kmene H5N1 a H9N2. Variabilitě podléhá také polymerázový komplex, zejména protein PB1 a PB2. Ptačí PB1 se nalézá v obou pandemických kmenech z let 1957 a 1968, což jsou, jak bylo potvrzeno, reasortanty. Viry chřipky (včetně ptačích) byly původně klasifikovány pouze podle antigenů HA a NA. Teprve rozvoj molekulárně biologických metod analýzy genomu umožnil přesnější určení především ptačích virů izolovaných z různých druhů ptáků a savců. Tyto analýzy tak umožnily nahlédnout do vývoje a příbuznosti genů kódujících nejen obalové, ale i vnitřní proteiny a pomohly pochopit vztahy mezi
20 Ptačí chřipka trvalá hrozba pandemie kmeny z různých hostitelů a oblastí. Velice to posunulo proniknutí do ekologie viru v celé její složitosti tak, jak je uvedeno v následující části 2.4. Nicméně zcela nové zkušenosti z let 1997 2006 ukázaly, že stále známe pouze fragment z toho, co bychom chtěli a potřebovali vědět pro pochopení vzniku shiftových variant patogenních pro člověka a použitelných pro lepší a účinnější prevenci pandemií chřipky. Zásadně se například změnil názor na vznik pandemie 1918 a prvních postpandemických kmenů izolovaných z lidí a prasat; analýzy z rekonstruovaných kmenů z plic zemřelých osob v pandemii roku 1918 naznačují, že jejich ptačí původ je nejpravděpodobnější. 1.2 Pandemie Podle starých historických pramenů se pandemie objevují 3 4krát za století, některé prameny uvádějí rozpětí 30 50 let. Za současných znalostí je to nutno brát jako čistě hypotetický odhad, i když je založen na základě rozboru starých písemných údajů [41]. Teprve ve druhé polovině 20. století byl celosvětový výskyt chřipky odborně dokumentován a přinesl ověřená data, z nichž můžeme vycházet. Mimo jiné i to, že podle definice byly skutečné pandemie v minulém století dvě, respektive tři; v letech 1957 a 1968 s ohniskem v Číně a historicky doložená a uznávaná pandemie v rozmezí let 1918 1920. Podle některých zpráv i tato pandemie vznikla v Číně, odkud byla zanesena migrací čínských přistěhovalců za prací do Ameriky, kde se pak začala šířit a odtud i se dostala i do Evropy. Název Španělská je zcela mylný, sem totiž chřipka dorazila, když už byly lokální výskyty potvrzeny v přístavech Francie a Anglie. Další dva celosvětové výskyty 1946 1948 a 1976 až 1977 jsou dodnes sporné, protože nesplňují všechna kritéria pandemií. V roce 1946 (po 2. světové válce) byl první virus izolován v Austrálii a jeho původ z Číny byl doložen později, což nebylo považováno za důvěryhodné; šíření bylo pomalé a ne explozivní [81], průběh onemocnění byl mírný s nízkou mortalitou [82]. Definitivně se později ukázalo, že virus vznikl extenzivní mutací z předchozího subtypu H1, dříve také označovaného H0. Návrat H1N1 v roce 1977 startoval ze tří provincií v Číně. K nám se informace dostala se zpožděním z Ruska; postiženi byli mladiství pod 20 let a virus byl identifikován jako antigenně shodný s kmeny z let 1950 1956. Při znalostech vývoje driftových změn u lidských chřipkových virů a relativní stabilita ptačích kmenů vylučují uznání této, byť celosvětově rozšířené epidemie, za pandemii. Navíc se mohlo jednat o kmen, který se podle citovaných informací [6] dostal do populace při vakcinaci vojsk na Dálném Východě, a to živou protichřipkovou vakcínou. Uvádí se mimo jiné ještě jedna možnost, jak může virus v zakonzervované podobě přežít, a to je ve zmrzlém stavu [35]. Z původních dvou hypotéz vzniku pandemie se v současnosti uvažuje výhradně o ptačím původu příštího pandemického kmene. Francisova hypotéza (opakování