2. Stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu v medu pomocí kapilární elektroforézy Med je vodný přesycený roztok sacharidů, který se skládá převážně z fruktózy, glukózy a sacharózy. Kromě toho med obsahuje některé minoritní složky, jako jsou minerální látky a jiné sacharidy, bílkoviny, enzymy, aminokyseliny, vitamíny, organické a fenolické kyseliny, flavonoidy, karotenoidy či těkavé látky. Při zpracování je med obvykle zahříván, aby se snížila jeho viskozita, a aby se zabránilo krystalizaci nebo fermentaci. Teploty kolem 32-40 C neovlivňují kvalitu medu, avšak vystavení medu ještě vyšším teplotám vede k tvorbě degradačního produktu, 5-hydroxymethylfurfuralu (nebo 5-(hydroxymethyl) furan-2-karbaldehydu), 5-HMF. Obr. 1. Struktura 5-hydroxymethylfurfuralu. 5-HMF vzniká jako meziprodukt Maillardovy reakce při dehydratací fruktosy (karamelizace) nebo v průběhu tepelné úpravy potravin. 5-HMF může vznikat i při nízkých teplotách v kyselém prostředí, ale jeho koncentrace se výrazně zvyšuje s nárůstem teploty tepelné úpravy nebo při delším skladování. Množství 5-HMF vznikajícího v potravinách je kromě teploty závislé také na typu cukru, ph, množství vody a koncentrací dvojmocných kationtů. Codex Alimentarius Světové zdravotnické organizace a Evropské unie stanovuje maximální množství 5-HMF v medu na úrovni 40 mg/kg (Alinorm 01/25, 2001; směrnice 2001/110/ES). 5-HMF je podezříván z cytotoxických, mutagenních, karcinogenních a genotoxických účinků na lidský organismus. Stanovení 5-HMF v potravinách se obvykle provádí spektrofotometricky. Bylo vyvinuto několik dalších metod využívajících vysoce účinnou kapalinovou chromatografie (HPLC) s UV detekcí nebo plynovou chromatografií spojenou s hmotnostní spektrometrií (CG-MS). Pro analýzu 5-HMF v medu, dětských potravinách, džemech, pomerančové šťávě a pekařských výrobcích byly využity také elektrochemické biosenzory.
Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC, micellar electrokinetic chromatography) je mód kapilární elektroforézy, ve kterém se uplatňuje separační mechanismus na základě rozdělování separovaných látek mezi pseudostacionární fázi, nejčastěji micel tenzidů, a okolní elektrolyt (mobilní fázi). Je tedy vhodná pro separaci např. látek nenesoucích náboj. Pro vytvoření pseudostacionární fáze je potřeba do základního elektrolytu přidat tenzid o dostatečně vysoké koncentraci (tzv. micelární kritické koncentraci), aby došlo k vytvoření agregátů molekul tenzidů (viz Obr. 2). Micely se vyznačují hydrofóbním vnitřkem, polární skupiny tenzidu jsou orientovány ven do základního elektrolytu, čímž je struktura stabilizována. Separované látky podle míry hydrofobicity pronikají do micel, které díky vlastnímu náboji unášejí látky ve směru své migrace, a umožňují tak pohyb i nenabitých látek v elektrickém poli. Dodecylsíran sodný (SDS, sodium dodecylsulphate) je nejčastěji používaným aniontovým tenzidem. Záporně nabité micely migrují k anodě, zatímco elektroosmotický tok generovaný na povrchu kapiláry směřuje ke katodě. Podle hodnoty ph základního elektrolytu, a tedy rychlosti elektroosmotického toku je nutné zvolit polaritu eletrod, a tedy pozici detektoru v nízkém ph se slabým elektroosmotickým tokem se detektor nachází u anody; ve vysokém ph s elektroosmotickým tokem rychlejším než je migrace micel je detektor u katody. Obr. 2. Schéma separačního uspořádání micelární elektrokinetcké chromatografie. Praktická část Vybavení: Agilent HP 3D CE s UV detektorem, vypalovač detekčních okýnek, ultrazvuk, váhy
Pomůcky: Kádinky, odměrné baňky, odměrný válec, nylonové filtry s velikostí pórů 0,45 µm, křemenná kapilára (s vnitřním průměrem 50 µm a celkové délky 32,5 cm), řezátko, vialky, eppendorfky Chemikálie: Boritá kyselina, dodecylsíran sodný, NaOH, standardy 5-HMF a kofeinu, deionizovaná voda Pracovní postup Příprava elektrolytu: - 10 mm boritá kyselina NaOH ph 9,3; 120 mm dodecylsíran sodný - odpovídající množství borité kyseliny rozpusťte v deionizované vodě - přidejte odpovídající množství NaOH pro přípravu pufru o ph 9,3 - v plastové nádobce připravte 10 ml 120 mm roztoku dodecylsíranu sodného v připraveném roztoku borité kyseliny a NaOH Příprava standardů: - ze zásobních roztoků odpipetujte odpovídající množství pro přípravu standardů 5-HMF o koncentraci 10, 20, 40, 60 a 80 mg/l spolu s kofeinem jako interním standardem o koncentraci 200 mg/l Příprava vzorku: - navažte 5 g medu do 10 ml odměrné baňky, rozpusťte v deionizované vodě a přidejte standard kofeinu na koncentraci 200 mg/l, doplňte objem po rysky baňky - umístěte do ultrazvuku na 5 minut a poté přefiltrujte přes nylonový filtr do vialky
Příprava separační kapiláry: - podle pokynů vedoucího cvičení uřízněte potřebnou délku separační kapiláry - ve vzdálenosti 8,5 cm odstraňte pomocí vypalovače vrstvu polyimidu a okénko otřete gázou navlhčenou v metanolu - podle pokynů vedoucího cvičení umístěte kapiláru do interface a vložte kapiláru do přístroje - kapiláru promyjte 5 minut 1M NaOH, 5 minut vodou, a následně separačním elektrolytem; nastavte parametry metody (15 kv, detekce při 284 nm, nástřik 50 mbar 3 sekundy) Měření vzorků: - proměřte kalibrační roztoky 5-HMF a kofeinu jako interního standardu - proměřte vzorky medu, v případě potřeby vzorek nařeďte - pomocí kalibrační křivky stanovte množství 5-HMF v medu Vyhodnocení: Vyhodnoťte plochy píků z měření roztoků 5-HMF o různých koncentracích. Vytvořte kalibrační závislosti podílu ploch 5-HMF a kofeinu na koncentraci 5-HMF. Porovnejte záznamy standardního roztoku a vzorku, na základě migračních parametrů rozhodněte, který ze signálů patří 5-HMF a vypočítejte jeho množství v medu (mg/kg). Otázky k prozkoušení: 1. Jakým způsobem vzniká 5-hydroxymethyl furfural a proč je jeho množství sledováno? 2. Vysvětlete princip separačního mechanismu micelární elektrokinetické chromatografie. 3. Jaké další metody by mohly sloužit pro stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu?
Doporučená literatura: 1. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 2. Analytické separační metody, Karolinum Praha 2004, Štulík K. a kol. 3. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické listy, 91 (1997) 320 329, V. Kašička. 4. Simpson B.K.: Food Biochemistry and Food Processing, 2012. 5. Damodaran S.: Fennema's Food Chemistry, Fourth Edition, 2007. 6. Msagati T.A.M.: The Chemistry of Food Additives and Preservatives, 2012.