Hydrofobní chromatografie

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Hydrofobní chromatografie"

Simona Němcová
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Hydrofobní chromatografie

2 Hydrofobicita proteinu insulin malwmrllpl lallalwgpd paaafvnqhl cgshlvealy lvcgergffy tpktrreaed lqvgqvelgg gpgagslqpl alegslqkrg iveqcctsic slyqlenycn

3 vliv soli na protein Stacionární fáze vazba hydrofobních oblastí na povrchu proteinu v H 2 O slabé interakce přídavek soli méně hydrofobní než RPC Mobilní fáze H 2 O/sůl (~1 M) nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4

slabé interakce přídavek soli méně hydrofobní než

4 Eluce klesajícím gradientem soli (1 M 0 M) stacionární fáze nejméně hydrofobní látka středně hydrofobní látka velmi hydrofobní látka velmi hydrofobní kontaminace

5 Přehled typů stacionární fáze Phenyl, Butyl nebo Octyl Sepharose Fast Flow (FF), FPLC kolony Phenyl Superose fy Pharmacia Biotech na polysacharidové (agarosové) bázi Macro-Prep t-butyl HIC Support fy Bio-Rad na methakrylátové bázi Spheron 100 (300, 1000) fy Lachema založené na bázi kopolymeru hydroxyethylmethakrylátu a ethylendimethakrylátu Separon HEMA-S 1000, Separon HEMA-Bio 1000 Phenyl fy TESSEK jsou vyráběny na bázi hydroxyethylmethakrylátu

methakrylátové bázi Spheron 100 (300, 1000) fy Lachema založené na bázi kopolymeru hydroxyethylmethakrylátu a

6 výběr ligandu Ether < Isopropyl < Butyl < Octyl < Phenyl

7 efekt ligandu na purifikaci efekt mobilní fáze A B C

8 typy gradientů

11 stacionární fáze kolona vysoké rozlišení (gradientová eluce) Experiment skupinová separace (kroková eluce) velikost částic µm velikost částic 30 µm nebo větší vyšší průtok délka 1-10 cm (krátká kolona nevhodná pro pozvolný gradient) mobilní fáze mm pufry v rozmezí ph 4-8 (ph má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4 ) nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok mm pufry v rozmezí ph 4-8 (ph má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4 ) objem vzorku na objemu nezáleží na objemu nezáleží množství vzorku 5-10 % celkové vazebné kapacity (bez ztráty rozlišení) ~ 40 % celkové vazebné kapacity

(nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4 ) nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok 20 50 mm pufry v rozmezí ph 4-8 (ph má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji

12 vysoké rozlišení (gradientová eluce) separace proteinů na základě jejich hydrofobicity vhodná jako první nebo střední purifikační krok použití hydrofobní chromatografie skupinová separace (kroková eluce) koncentrace naředěného vzorku vhodná jako purifikační krok po precipitaci síranem amonným

hydrofobní chromatografie skupinová separace (kroková eluce) koncentrace

13 Jako první krok purifikace alkoholdehydrogenasy z Pseudomonas sp. jste zvolili srážení síranem amonným (Mr 132,14 g/mol) a to do 50 %. Alkoholdehydrogenasu jste po srážení detekovali v supernatantu (objem supernatantu je 20 ml). Jako další krok purifikace chcete zvolit hydrofobní chromatografii na koloně Butyl-Sepharose. Jak byste postupovali?

Alkoholdehydrogenasu jste po srážení detekovali v supernatantu (objem supernatantu je

14 Chromatografie na reversní fázi

15 Chromatografie na normální fázi stacionární fáze - hydrofilní (polární) mobilní fáze - hydrofobnější nebo méně polární než stacionární fáze Chromatografie na reversní fázi stacionární fáze - hydrofobní (nepolární) mobilní fáze - polárnější než stacionární fáze

stacionární fáze Chromatografie na reversní fázi stacionární

16 separace látek na základě jejich hydrofobicity hydrofobní chromatografie x chromatografie na reversní fázi hydrofobní interakce musí být podpořena solí eluce snižující se koncentrací soli lysozym stacionární fáze je vysoce substituovaná CH řetězci vysoká hydrofobicita proteiny, peptidy a oligonukleotidy se adsorbují i v čisté H 2 O desorbce organická rozpouštědla (např. acetonitril v H 2 O) vysoká hydrofobicita nižší hydrofobicita vysoce hydrofilní méně hydrofilní

substituovaná CH řetězci vysoká hydrofobicita proteiny, peptidy a oligonukleotidy se adsorbují i v čisté H 2 O

17 Mechanismus adsorbce malé organické molekuly +/- rozpustné ve stacionární fázi Peptidy i proteiny mohou interagovat s hydrofobním nosičem Větší velikost nemohou být kompletně pohlceny hydrofobní stacionární fází Velká pravděpodobnost interakce více míst molekuly

hydrofobním nosičem Větší velikost nemohou být kompletně pohlceny

18 Pokles polarity mobilní fáze oslabuje hydrofobní interakce Eluční křivka odpovídá distribuci mezi stacionární a mobilní fázi.

19 Stacionární fáze nosiče Silikagel poresní silika gel zvýšení efektivního povrchu inertní materiál stabilní v ph 2-7,5 Polymerní nosič poresní polymer zvýšení efektivního povrchu nepolární stabilní v ph 2-11

stabilní v ph 2-7,5 Polymerní nosič poresní polymer

20 Stacionární fáze - funkční skupiny

21 Vliv funkční skupiny a velikosti částic na rozlišení

22 Mobilní fáze Organické rozpouště dlo Vhodné pro: Viskosita Poznámka Methanol Org. molekuly Střednínízká možná destabilisa ce struktury Ethanol Org. molekuly Střednínízká možná destabilisa ce struktury Isopropanol Proteiny Peptidy Vysoká nejmenší efekt na strukturu Acetonitril (ACN) Org. molekuly Proteiny Peptidy Nízká nízký efekt na strukturu

23 Vliv typu mobilní fáze Mobilní fáze Vliv koncentrace rozpouštědla

24 Isokratická eluce vliv koncentrace organického rozpouštědla Gradientová eluce

25 Spektrofotometrické vlastnosti rozpouštědel

26 rozpouštědlový pík gradient Pufr A: 0,1 % TFA + H 2 O Pufr B: 0,1 % TFA + acetonitryl A214nm retenční čas / min Čas % A % B Sekvence RGGGGVGLGK RGGGGVGVGK RGGGGLGLGK R T 15,0 10,5 20,5

27 stacionární fáze Experiment vysoké rozlišení (gradientová eluce) velikost částic µm - pro purifikace 5-12 µm - pro analytiku polymerní lepší pro separaci proteinů (lze čistit pomocí NaOH) skupinová separace (kroková eluce) velikost částic 30 µm nebo větší vyšší průtok kolona délka 1-10 cm nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok mobilní fáze objem vzorku množství vzorku Oligonukleotidy alkalické podmínky Peptidy ACN, TFA ~ ph 2 0,5-5% objemu kolony při isokratické eluci bez omezení při gradientové eluci 5-10 % celkové kapacity kolony (dobré rozlišení) nemá významný vliv (50 %ACN) na objemu nezáleží 40 % celkové kapacity kolony

28 vysoké rozlišení (gradientová eluce) separece peptidů, proteinů a oligonukleotidů podle jejich hydrofobicity Vhodná jako střední purifikační krok nebo závěrečný purifikační krok Purifikace syntetických peptidů Technika pro analysu peptidů a peptidové mapování použití RPC skupinová separace (kroková eluce) Zakoncentrování oligonukleotidů a peptidů Vhodná pro odsolování peptidů a oligonukleotidů Tipy pro přípravu pufru Upravte ph před přidáním organického rozpouštědla Upravte ph pufru při teplotě experimentu Ověřte stabilitu proteinu Pro analytické experimenty použijte HPLC grade chemikálie Tipy pro přípravu vzorku Zfitrujte nebo stočte vzorek před aplikací na kolonu ph a iontová síla (!velký objem vzorku!) stejná jako ve startovacím pufru (PD10) Teplota vzorku stejná jako startovacího pufru (!velký objem vzorku!)

Podobné dokumenty

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost Chromatofokusace separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost Polypufry - amfolyty Stacionární fáze Polybuffer 96 - ph 9-6