CHORUS Legionella Urinary Antigen 81301 (12 testů) Výrobce: DIESSE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Itálie
OBSAH 1 Úvod... 3 2 Princip testu... 4 3 Složení soupravy... 4 4 Další potřebné vybavení k provedení testu... 5 5 Skladování a stabilita komponent... 6 6 Bezpečnost práce... 6 7 Technické připomínky... 7 8 Vzorky a jejich skladování... 7 9 Pracovní postup.... 8 10 Validita testu... 8 11 Hodnocení výsledků... 8 12 Interpretace výsledků... 9 13 Charakteristika soupravy... 9 14 Literatura... 10 15 Vysvětlení symbolů... 12 2/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
Kvalitativní stanovení urinálního antigenu Legionella pneumophila v lidské moči na přístrojích Chorus/Chorus Trio pomocí jednorázového testovacího zařízení 1 Úvod Legionářská nemoc je závažné infekční onemocnění s vysokou mírou úmrtnosti. Jako legionelózu definujeme všechny formy onemocnění způsobené gramnegativní bakterií rodu Legionella. Celková míra mortality je 5 až 15 %, nicméně mortalita může dosáhnout 30 až 50 % u nozokomiálních infekcí a 70 až 80 % u pacientů ve vážném klinickém stavu a pacientů, u nichž byla léčba nasazena pozdě. Klinicky nejvýznamnějším rodem je Legionella pneumophila, ačkoliv byly izolovány i druhy jiné. Nejzávažnější formou legionelové infekce je tzv. legionářská nemoc, pro kterou je charakteristická akutní pneumonie objevující se 2 až 10 dní po kontaktu s bakterií. Dalším typickým klinickým obrazem je Pontiac horečka, akutní mimoplicní infekce. Legionely jsou velmi rozšířené, především tam, kde se vyskytují vodní plochy (jezera, řeky, termální prameny a obecně vlhké oblasti). Počínaje těmito zdroji mohou legionely kolonizovat umělé vodní zdroje (městské distribuční systémy pitné vody, vodní systémy jednotlivých budov, klimatizační zařízení, bazény, fontány atd.), které pak fungují jako rezervoáry a vektory rozšíření tohoto mikroorganizmu. Legionely mohou napadat veškeré věkové spektrum populace. Mezi rizikovou skupinu patří starší muži, kteří kouří, konzumují alkohol a jsou postiženi chronickými onemocněními (obstrukční bronchopulmonární infekce, kardiovaskulární a renální poruchy, diabetes atd.), a dále lidé se získaným imunodeficitem následkem imunosupresivní léčby (transplantace orgánu, léčba steroidy a protinádorovými léky atd.) nebo postižení HIV. 80 % všech případů legionelózy má na svědomí Legionella pneumophila sérotyp 1. V roce 1979 Berdal demonstroval přítomnost rozpustného, vysoce specifického antigenu Legionella pneumophila v moči u pacientů s legionářskou nemocí. Z tohoto důvodu patří moč mezi ideální typ vzorku pro detekci tohoto antigenu v brzkých nebo naopak pozdních stádiích nemoci. 3/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
2 Princip testu Jednorázový test připravený k použití na přístrojích Chorus umožňuje stanovení urinálního antigenu Legionella pneumophila. Test je založen na principu ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay). Monoklonální protilátka antigen specifická se naváže na pevnou fázi. V průběhu inkubace vzniká vazba mezi antigen přítomným v moči a imobilizovanými monoklonálními protilátkami. Po promytí, která eliminují nenavázané proteiny, se provádí inkubace s konjugátem. Konjugát je roztok s obsahem monoklonálních protilátek proti Legionella pneumophila značených křenovou peroxidázou. Po další sérii promytí, které odstraní nenavázaný konjugát, se přidá substrát reagující s peroxidázou. Intenzita modrého zbarvení, které vznikne, je přímo úměrné koncentraci specifických protilátek přítomných v testovaném vzorku. Jednorázový test obsahuje všechny reagencie nutné k provedení testu na přístrojích Chorus. Výsledky jsou vyjádřeny pomocí INDEXU. 3 Složení soupravy Souprava umožňuje provést 12 stanovení. Testovací jednotka 2 samostatné balení po 6 jednotlivých jednorázových testech 2 6 ks Kalibrátor 1 350 µl Inaktivovaný celobuněčný antigen L. pneumophila, ve fosfátovém pufru s konzervanty, v pracovním ředění Pozitivní kontrola 1 850 µl Inaktivovaný celobuněčný antigen L. pneumophila, ve fosfátovém pufru s konzervanty, v pracovním ředění Pracovní návod 1 ks Soupravu nechte vytemperovat na laboratorní teplotu a ze samostatných balení odeberte stanovený počet jednorázových testů pro vlastní analýzu. Zbylé jednorázové testy vraťte zpět do obalu se sušidlem (silikagel gel obsahující oxid křemičitý), vytlačte vzduch a hermeticky uzavřete stisknutím uzávěru. Skladujte při +2 C až +8 C. 4/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
Obrázek 1 Schéma jednorázového testu Pozice 8 Pozice 7 Pozice 6 Místo pro štítek s čárovým kódem Prázdná pozice Mikrotitrační jamka s potaženým antigenem Monoklonální protilátka proti L. pneumophila Pozice 5 Nepotažená mikrotitrační jamka Pozice 4 TMB Substrát 0,35 ml Tetrametylbenzidin 0,26 mg/ml a 0,01% H2O2 stabilizovaný v 0,05 mol/l citrátového pufru (ph 3,8) Pozice 3 Monoklonální protilátka 0,35 ml Protilátky proti L. pneumophila značené biotinem, v roztoku TRIS Pozice 2 Konjugát 0,35 ml Roztok streptavidinu značeného peroxidázou ve fosfátovém pufru obsahujícím 0,05% fenol a 0,02%Bronidox Pozice 1 Prázdná jamka Do této jamky se přidá neředěné vyšetřovaný vzorek 4 Další potřebné vybavení k provedení testu Tyto reagencie nejsou součástí balení. Promývací roztok 83606 Čistící roztok 2000 83609 Sanitační roztok 83604-83608 Destilovaná nebo deionizovaná voda Běžné laboratorní sklo: odměrné válce, zkumavky atd. Mikropipety na přesný odběr 50 až 200 μl roztoku Jednorázové rukavice Roztok chlornanu sodného (5 %) Nádoby na potenciálně infekční materiál 5/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
5 Skladování a stabilita komponent Reagencie se musí skladovat při teplotě +2 C až +8 C. V případě skladování při nesprávné teplotě se musí zopakovat kalibrace a validovat test pomocí kontrolního séra (viz 10, Validita testu). Datum exspirace je uvedeno na každé komponentě a na štítku soupravy. Po otevření mají reagencie omezenou stabilitu. Jednorázový test 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C Pozitivní kontrola 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C Kalibrátor 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C 6 Bezpečnost práce Souprava je určena pouze pro diagnostické účely in vitro. Tato souprava obsahuje materiály lidského původu, které byly testovány a vykázaly negativní výsledky při použití metod schválených FDA pro stanovení přítomnosti HbsAg a anti-hiv-1, anti-hiv-2 a anti-hcv protilátek. Protože však žádný diagnostický test nemůže poskytnout úplnou záruku, že infekční agens nejsou přítomna, je třeba s veškerým materiálem lidského původu zacházet tak, jako by byl potenciálně infekční. Při zacházení s materiálem lidského původu je nutné dodržovat všechny místní předpisy týkající se bezpečnosti práce. Likvidace zbytků pro provedení testu S použitými vzorky, kalibrátory, jednorázovými testy je třeba zacházet jako s potenciálně infekčním materiálem a likvidovat je v souladu s platnou legislativou. Zdravotní a bezpečnostní informace 1. Nepipetujte ústy. Používejte rukavice na jedno použití a ochranu očí. Po umístění jednorázového testu do přístroje Chorus si důkladně umyjte ruce. 2. Některé reagencie obsahují nízké koncentrace škodlivých nebo dráždivých látek Pokud se některá s těchto reagencií dostane do kontaktu s kůží nebo očima, důkladně omyjte dané místo vodou. Konjugát obsahuje fenol TMB Substrát je roztok kyseliny 3. Neutralizované kyseliny nebo jiný tekutý odpad by se měl dekontaminovat přidáním dostatečného množství chlornanu sodného tak, aby konečná koncentrace dosahovala minimálně 1,0 %. Pro zajištění účinné dekontaminace ponechejte tento odpad 30 minut v 1% chlornanu sodném. 4. Rozlitý potenciálně infekční materiál je třeba okamžitě odstranit pomocí absorpčního papírového ručníku a kontaminovanou oblast umýt, například 1,0% chlornanem sodným, a to předtím, než budete v práci pokračovat. Chlornan sodný 6/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
nepoužívejte na rozlité tekutiny s obsahem kyseliny, ty musíte nejprve otřením vysušit. 5. Materiály použité k čištění potřísněných povrchů, včetně rukavic, se musí likvidovat jako potenciálně životu nebezpečný odpad. Materiály obsahující chlornan sodný nevkládejte do autoklávu. 7 Technické připomínky Pro získání spolehlivých výsledků je nutné přesné dodržování návodu. Soupravu nechte vytemperovat na laboratorní teplotu (+18 C až +30 C) a test proveďte do 60 minut. Zkontrolujte a dodržujte následující informace: Substrát obsažený v pozici 4 je bezbarvý. Nepoužívejte jednorázové testy, které toto nesplňují. Testovaný vzorek je dokonale na dně jamky rozprostřen. Zkontrolujte zdali všechny reagencie v testu jsou přítomny a jestli není jednorázový test poškozen. Nepoužívejte testy, které nemají reagencie. Jednorázové testy jsou určeny pro použití na přístroji Chorus. Důkladně dodržujte pokyny pro použití a řiďte se návodem k obsluze přístroje. Chorus přístroj správně nastavený (viz návod k obsluze). Neměňte čárový kód umístěný na držadle jednorázového testu. Nepoužívejte testy s poškozenými štítky s čárovými kódy. Defektní čárové kódy lze vložit do přístroje manuálně. Během skladování a použití nevystavujte jednorázové testy silnému světlu ani výparům chlornanu. Použití silně hemolytických vzorků nebo vzorků s mikrobiální kontaminací může vést k nereprodukovatelným výsledkům. Než vložíte jednorázový test do přístroje, zkontrolujte, že reakční jamka neobsahuje cizí tělesa. Nepoužívejte jednorázový test po uplynutí expiračního data. Zkontrolujte prosím, zda-li byl k přístroji Chorus připojen Promývací roztok 83606. 8 Vzorky a jejich skladování Jako vzorek k vyšetření může být použita lidská moč. Zachází se s ním v souladu se všemi opatřeními předepsanými správnou laboratorní praxí. Vzorek musí být odebrán do sterilní nádoby. Vzorek lze skladovat 24 hodin při +2 C až +8 C. Moč je možné uchovávat při -20 C a lze je rozmrazit maximálně 3krát. Neskladujte vzorky v mrazácích s funkcí vlastního rozmrazování. 7/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
Rozmrazené vzorky je potřeba před použitím důkladně protřepat. Kvalita vzorku může být vážně narušena kontaminací, která vede k chybným výsledkům. 9 Pracovní postup. 1. Otevřete balení, vyjměte požadovaný počet jednorázových testů a zbytek uzavřete zpět do sáčku poté, co vytlačíte vzduch. 2. Zkontrolujte stav jednorázového testu (viz 7 Technické připomínky). 3. Pipetujte 125 μl neředěného vzorku do pozice 1 každého testu. Při každé změně šarže soupravy použijte jednorázový test pro kalibraci. 4. Jednorázový test umístěte do přístroje. Proveďte kalibraci (je-li nutná) a vlastní stanovení podle pokynů uvedených v návodu k obsluze Chorus přístroje. 10 Validita testu Pomocí pozitivní kontroly ověřte správnost získaných výsledků. Použijte je v souladu s instrukcemi uvedenými v návodu na obsluhu. Pokud test ukáže, že se hodnota pozitivní kontroly pohybuje mimo přijatelné rozmezí, kalibraci je třeba opakovat. Předchozí výsledky budou automaticky opraveny. Pokud je výsledek kontrolního séra i nadále mimo přijatelné rozmezí, kontaktujte prosím: Tel: +39-0577-319554 Fax: +39-0577-366605 Email: scientificsupport@diesse.it 11 Hodnocení výsledků Přístroj Chorus vyjadřuje výsledky jako INDEX (je to poměr mezi naměřenou hodnotou absorbance testovaného vzorku a CUT-OFF hodnotou). Hodnocení výsledků je popsáno v tabulce (Tabulka 1). Tabulka 1 Hodnocení výsledků INDEX menší než 1 Hodnocení negativní 1 hraniční větší než 1 pozitivní V případě hraničního výsledku zopakujte test. Pokud zůstává test nadále hraniční, je vhodné opakovat z nového odběru, který bude proveden s určitým časovým odstupem. 8/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
12 Interpretace výsledků Test nelze použít pouze jako jedinou metodu pro stanovení klinické diagnózy. Negativní výsledky nemusí vylučovat eventuální infekci. Serologický nález je třeba vždy interpretovat pouze v kontextu s výsledky ostatních laboratorních testů a s klinickým obrazem pacienta. 13 Charakteristika soupravy 13.1 Analytická specifita Analytická specifita byla testována na 5 vzorcích (2 negativní, 1 CUT-OFF, 2 pozitivní) obsahujících potenciálně interferující látky: Bilirubin (0,15 až 0,6 mg/dl) Hemoglobin (0,01 až 0,04 mg/ml) Glukóza (30 až 120 mg/dl) Kyselina askorbová (5 až 20 mg/dl) Šťavelan vápenatý (2,5 až 10 mg/dl) Albumin (40 až 160 mg/dl) Přítomnost interferujících látek v testovaných vzorcích nemá vliv na výsledek testu. 13.2 Zkřížená reaktivita Byly testovány vzorky pozitivní na Escherichia coli, Proteus, Streptococcus faecalis, Staphylococcus spp, Streptococcus B, Streptococcus D, Lactobacillus, skupina bakterií rodu Klebsiella, Serratia a Enterobacter, Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae Nebyla prokázána žádná významná zkřížená reaktivita. 13.3 Diagnostická citlivost a specifita Pro stanovení citlivosti a specifity bylo využito srovnání výsledků na jiné referenční soupravě. Při srovnání bylo testováno 104 vzorků. Výsledky srovnání jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 2). Tabulka 2 Výsledky srovnání zařazení testovaných vzorků Referenční souprava DIESSE Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní 44 0 44 Negativní 8 52 60 Celkem 52 52 106 Souprava vykazuje 100% specifitu (CI95% 93,1 až 99,9) a 84,6% citlivost (CI95% 72,4 až 91,9). Shoda mezi oběma metodami je vynikající s Cohen Kappa 0,96. 9/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
13.4 Přesnost měření Intra-assay a Inter-assay stanovení: testované vzorky byly opakovaně změřeny; průměr naměřených hodnot, variační koeficient (%) jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 3). Tabulka 3 Intra-assay a Inter-assay stanovení Vzorek Průměr (AU/ml) Intra-assay Variační koeficient (%) Průměr (AU/ml) Inter-assay Variační koeficient (%) 1 0,4 20 0,3 16,7 2 0,3 20 0,3 16,7 3 0,6 6,7 0,6 13,3 4 0,8 10 0,6 11,7 5 1,2 9,2 1,1 10 6 2,1 2,4 2,1 5,2 7 8,3 8,8 7,7 6,4 8 4 3,3 3,8 5 9 4,4 4,3 4,3 3,7 Přesnost mezi jednotlivými šaržemi a přesnost mezi použitými přístroji: všechny testované vzorky byly analyzovány; průměr naměřených hodnot, variační koeficient (%) každého vzorku jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 4). Tabulka 4 Přesnost mezi šaržemi a přesnost mezi přístroji Vzorek Průměr (AU/ml) Přesnost mezi šaržemi Variační koeficient (%) Přesnost mezi použitými přístroji Průměr (AU/ml)) Variační koeficient (%) 1 0,4 15 0,4 15 2 0,3 0,3 3 0,5 0,5 4 0,6 10 0,6 10 5 1,2 5 1,2 5 6 2,4 9,5 2,3 6,5 7 9,3 8,2 9,4 3,4 8 3,4 14,4 3,4 1,8 9 4,4 10,2 4,4 7 10/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
14 Literatura 1. Fraser DW, Tsai TR, Orenstein W, Parkin WE, Beecham HJ, Sharrar RG, Harris J, Mallison GF, Martin SM, McDade JE, Shepard CC, Brachman PS. 1977. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297:1189-1197. 2. Reingold AL, Thomason BM, Brake BJ, Thacker L, Wilkinson HW, Kuritsky JN. 1984. Legionella pneumonia in the United States : the distribution of serogroups and species causing human illness. J Infect Dis. 149(5):819. 3. Berdal BP, Farshy CE, Feeley JC. 1979. Detection of Legionella pneumophila antigen in urine by enzyme-linked immunospecific assay. J Clin Microbiol. May; 9(5) :575-8 11/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015
15 Vysvětlení symbolů Datum výroby Použít do data Nepoužívat opakovaně Čtěte přiložené dokumenty Výrobce Počet testů Skladovací teplota Čtěte návod k použití Biologická rizika Katalogové číslo Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Číslo šarže Diesse Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy Tel. 0577-587111 12/12 Rif. IO-09/351-C; IFU 81301 Ed. 31.07.2015