Huminové látky v povodí Rašeliníku (obora Fláje, Krušné hory)

Výzkum možností minimalizace obsahů organických škodlivin ve zdrojích pitných vod v Krušných horách Huminové látky v povodí Rašeliníku (obora Fláje, Krušné hory) František Novák, Martina Šestauberová Říjen 2013 Biologické centrum AV ČR, v.v.i., Na Sádkách 7, 370 05 České Budějovice; e-mail: novakf@upb.cas.cz

Autor: František Novák, Martina Šestauberová Ústav půdní biologie, Biologické Centrum AV ČR, v.v.i. Na Sádkách 7, 370 05 České Budějovice E-mail: upb@upb.cas.cz, novakf@.upb.cas.cz Institute of Soil Biology, Biology Centre AS CR, v.v.i. České Budějovice, 2013 Foto: M. Krtička ISBN 978-80-86525-27-3

Obsah Cíl práce 3 Abstrakt 3 1. Úvod 3 2. Obsah huminových látek ve vodách a půdách povodí Rašeliníku 4 3. Struktura a složení huminových látek 7 3.1. Základní metody 7 3.2. 13 C NMR spektroskopie 9 3.3. FTIR spektrometrie 12 3.4 UV/VIS spektrometrie 14 3.5. Gelová (vylučovací) chromatografie 17 4. Radiouhlíkové datování rašelinných huminových látek 19 4.1. Huminové látky v povrchových vodách 19 4.2. Vzorky rašeliny z profilu rašelinného tělesa 22 5. Závěry 25 6. Literatura 27 Seznam použitých zkratek 28 Přílohy 29 2

Cíl práce Cílem této práce bylo 1) charakterizovat huminové látky, především fulvokyseliny, izolované standardní metodou dle IHSS ze vzorků vod z povodí Rašeliníku a vzorků odebraných projektovým partnerem na saské straně, 2) vyhodnotit analýzy půd v povodí, popsat složení rašeliny v profilu rašelinného tělesa a stanovit stáří rašeliniště a 3) na základě provedených analýz identifikovat původ huminových látek a navrhnout opatření ke snížení exportu DOC z povodí. Abstrakt V povodí potoka Rašeliník (Flájská přehrada, Krušné hory, Česká republika) byly studovány koncentrace, složení, struktura a stáří huminových látek (HL). Koncentrace huminových látek ve vodách přítoků potoka Rašeliník se ve sledovaném období 2010 2013 pohybovala mezi 2 60 mg.l -1. Nejvyšší koncentrace HL byly zaznamenány ve vodách levostranného přítoku č. 6 a po intenzivnějších deštích nebo při tání sněhu také v pravostranném přítoku č. 3, v němž se ve vegetační sezóně pohybovala koncentrace HL mezi 7 9 mg.l -1. Akumulace huminových látek (až 65 mg.l -1 ) byla pozorována ve vodách malých tůní, mj. při nízkých průtocích v neudržovaných odvodňovacích kanálech. Povrchové vody obsahovaly především fulvokyseliny (60 %) s molekulovou hmotností 1,8 2,1 kda. Podíl výšemolekulární frakce ve fulvokyselinách byl okolo 2 %. Ve vzorcích vod odebraných na saské straně (Galgenteich u Altenbergu, Rauschenbach) byla molekulová hmotnost Mr mezi 1,8 až 2,5 kda, podíl frakce s vyšší molekulovou hmotností byl větší (až 7 %). Radiouhlíkové datování pomocí AMS ukázalo, že v případě Rašeliníku jsou do povrchových vod vyplavovány fulvokyseliny pocházející z poměrně mladých, 150 250letých vrstev rašeliny. Ve vodách tůní po revitalizaci rašeliniště v Sasku byly zjištěny starší huminové látky (až 850 let), mobilizované v důsledku terénních úprav stanoviště. Poměr C/N s hloubkou rašeliniště postupně klesal, nejnižší však byl ve svrchních horizontech do hloubky 0,2 m, zřejmě v důsledku dlouhodobé atmosférické depozice dusíku v oblasti. Datování rašelinného tělesa v povodí Rašeliníku ukázalo stáří BP rašeliny od 3130 ± 272 let (horizont 0,1 0,2 m) do 9 122 ± 365 let v největší hloubce 2,1 m. 1. Úvod Rozpuštěný organický uhlík ( dissolved organic carbon, DOC), který se s povrchovými vodami dostává do nádrže Fláje a odtud do pitné vody, zahrnuje široké spektrum frakcí organických látek (viz Novák, 2012), z nichž pro kvalitu pitné vody představují nejvážnější problém huminové látky (HL), především fulvokyseliny, jež nelze odstranit koagulací a jsou tak prekurzorem karcinogenních trihalogenmethanů při chloraci pitné vody. Pro strukturní charakterizaci huminových látek obsažených ve vodách je nezbytné nejprve provést jejich separaci od nehuminových složek, například bakteriálních peptidoglykanů nebo exsudátů z kořenů rostlin aj., jejichž přítomnost ve vzorku by vedla ke zkreslení výsledků analýz, zejména radiouhlíkového datování. K vlastní charakterizaci vodních HL je třeba využít kombinaci klasických analytických a moderních spektrálních metod (Abbt-Braun et al., 2004), jejichž princip je v nezbytné míře u jednotlivých kapitol vyložen. V této práci jsou popsány výsledky studia složení, struktury a stáří huminových látek, především fulvokyselin, izolovaných z vod Rašeliníku standardní metodou založenou na sorpci HL na koloně plněné Amberlitem XAD-8 (Malcolm, 1991). Pro srovnání byly stejnými metodami analyzovány vzorky vod z Černého rybníka v blízkosti povodí Rašeliníku a také vzorky odebrané projektovým partnerem na saské straně v povodí potoka Rauschenbach, z nádrže Galgenteich u Altenbergu a z jejího přítoku. Základními che- 3

mickými metodami byly charakterizovány také půdy v povodí a vzorky z profilu rašelinného tělesa, u kterého bylo rovněž provedeno radiouhlíkové datování. Na základě provedených analýz lze identifikovat původ huminových látek a navrhnout opatření ke snížení exportu DOC z povodí. 2. Obsah huminových látek ve vodách a půdách povodí Rašeliníku 2.1. Materiál a metody Vzorky vod byly odebrány v povodí potoka Rašeliník ve dnech 8. 7. 2010, 27. 10. 2010, 6. 4. 2011, 11. 4. 2012, 18. 4. 2012, 10. 5. 2012, 30. 7. 2012, 24. 10. 2012, 18. 4. 2013, 9. 7. 2013 a 20. 10. 2013. Pro srovnání byly odebrány vzorky vod na saské straně 5. října a 14. prosince 2011 (tůně v povodí potoka Rauschenbach) a 18. dubna 2012 (nádrž Galgenteich u Altenbergu). V povodí Rašeliníku byla hlavní pozornost zaměřena na levostranný přítok č. 6, v jehož vodách byly trvale velmi vysoké koncentrace huminových látek, a dále na protilehlý pravostranný přítok č. 3, v jehož vodách byla po většinu roku koncentrace HL nižší. Pro srovnání byl v prvém roce řešení projektu stanoven obsah HL ve vodách všech přítoků Rašeliníku i v Radním a Mackovském potoce (viz Vávra et al., 2010). Obsah HL byl průběžně stanovován také ve vzorcích vod odebíraných na přítocích Rašeliníku pro izolaci huminových látek. Po převozu do laboratoře byly vzorky uloženy v chladničce při 4 C a následující den byly analyzovány. Absorbance filtrovaných vzorků vod v UV/ VIS oblasti spektra byly měřeny na spektrometru Varian Cary 3E v křemenných kyvetách tloušťky 0,01 m při vlnových délkách 254 nm (A 254 ), 280, 465 a 665 nm. Ve srovnávací kyvetě (blank) byla destilovaná voda. Byl vypočítán poměr absorbancí koeficient A 465, nazývaný barevný koeficient Q 4/6. Obsah huminových látek ve vodách byl stanoven extrakcí n-pentanolem podle odvětvové technické normy vodního hospodářství TNV 75 7536. Hodnoty ph vzorků vod byly stanoveny při laboratorní teplotě pomocí kombinované skleněné elektrody na ph metru Radelkis OP; vzorek před měřením ph nebyl filtrován. Kalibrace elektrody byla provedena standardními pufry o ph 4 a 7 (Elektrochemické detektory, spol. s.r.o., Turnov). Metody použité pro analýzu půd jsou popsány v práci Vávra et al. (2010). 2.2. Koncentrace HL ve vodách a její sezónní dynamika Koncentrace huminových látek ve vodách významných přítoků Rašeliníku, sledovaná v průběhu let 2010 2013, se pohybovala v širokém intervalu od 2 do 60 mg.l -1. Charakteristické hodnoty z odběru provedeného v červenci 2010 ilustruje Tab. I. Značně vysoká a přitom poměrně stabilní koncentrace HL byla pravidelně zjišťována ve vodách levostranného přítoku č. 6, poměrně vysoká koncentrace 20 mg.l -1 HL byla ve vodě pravostranného přítoku č. 2, jehož ústí do Rašeliníku není příliš vzdáleno od ústí přítoku 6 (obr. 1). Podobné koncentrace byly ve vybraných přítocích zjišťovány i při následných odběrech (Tab. II). Je zřejmé, že uvedené dva přítoky, především poměrně vodnatý levostranný přítok 6, se celoročně podílejí významnou měrou na exportu huminových látek do Flájské přehrady. Velký podíl na exportu huminových látek do Flájské nádrže však mají také epizodická zvýšení jejich koncentrace v dalších přítocích, například při tání sněhu. Při výstavbě nádrže Fláje v 60. letech 20. století byla v jejím povodí vybudována odvodňovací síť. Díky systému příkopů poklesl export huminových látek z relativně rozsáhlého území s velkým zastoupením organozemí (rašelinných půd) a současně se vytvořily příznivé podmínky pro zalesnění. V povodí měly významné zastoupení rašelinné smrčiny, které bránily dalšímu vysoušení stanoviště větrem a zadržovaly vláhu. 4

Rozsáhlé odumírání lesů způsobené imisemi však vedlo v průběhu 80. let 20. století k intenzivnější degradaci stanoviště vlivem prosychání svrchních půdních horizontů a jejich následnému promývání vodou z dešťových srážek a tání sněhu, což byla zřejmě jedna z příčin zvýšení exportu DOC z povodí. Současně s odumíráním lesů postupně ztrácely funkčnost neudržované odvodňovací kanály. V některých melioračních strouhách byla při velmi nízkém průtoku pozorována výrazná akumulace huminových látek v tůňkách (50 65 mg.l -1, tab. II), z nichž mohou být HL při větších srážkových úhrnech nebo při tání sněhu vyplavovány a mohou způsobovat epizodická maxima koncentrace HL ve vodách Rašeliníku. Při zvýšeném průtoku po jarním tání sněhu byl v letech 2012 a 2013 opakovaně pozorován pokles koncentrace HL v celoročně vodnatém přítoku č. 6 z 50 60 mg.l -1 až na 30 mg.l -1. Naproti tomu v protilehlém přítoku č. 3 byly koncentrace HL v průběhu roku nízké (7 9 mg.l -1 ), při zvýšených průtocích po tání sněhu se však výrazně zvyšovaly (na 16 až 50 mg.l -1 ). Podobné tůně s vyšší koncentrací HL se vyskytují také na plochách vedle odvodňovacích příkopů. V důsledku vyplavování většího množství HL při tání sněhu bylo pozorované zvýšení koncentrace HL na výtoku z vybudované přehrázky až na 20 mg.l -1. Získané hodnoty lze využít ke srovnání s výsledky paralelně probíhajícího kontinuálního monitoringu (Beránek et Zahrádka, 2013), který nemohl postihnout dynamiku změn koncentrace huminových látek na jednotlivých přítocích Rašeliníku. Tab. I. Absorbance při 280 nm, ph a obsah huminových látek ve vzorcích vod z přítoků potoka Rašeliník (odběr v červenci 2010). Přítoky jsou číslovány shodně podle botanického průzkumu dílčích povodí potoka Rašeliník (Vávra et al., 2010), č. 8 odpovídá Rašeliníku před vyústěním do přehrady. Tučně jsou vyznačeny hodnoty pro dva přítoky s nejvyšším obsahem HL. Přítok A 280 ph HL / mg.l -1 1 0,135 7,05 5 2 0,365 6,61 20 3 0,171 7,39 7 4 0,252 7,20 11 5 0,355 7,47 14 6 1,076 6,48 57 7 0,136 7,38 4 8 0,174 7,60 7 5

Tab. II. Obsah HL ve vodách vybraných přítoků Rašeliníku (mg.l -1 ). Datum odběru Dílčí povodí potoka Rašeliník 1 2 3 6 7 Přehrázka* tůňky 8. 7. 2010 5 20 7 57 5 7 27. 10. 2010 35 6. 4. 2011 50 11. 4. 2012 22 16 18. 4. 2012 30 6 9 50 10. 5. 2012 60 30. 7. 2012 9 24. 10. 2012 7 5 18. 4. 2013 10 50 40 14 20 65 29. 5. 2013 2 52 55 15 25 9. 7. 2013 8 59 8 20. 10. 2013 2 12 40 35 9 15 * odběr v místě přehrázky, vybudované v rámci projektu v roce 2011. Obr. 1. Koncentrace huminových látek ve vodách potoka Rašeliník a jeho přítoků v letech 2010 2012 (červené sloupce, jejich výška je úměrná koncentraci HL v mg.l -1 ) a obsah huminových látek ve svrchním půdním horizontu, extrahovatelných 0,01M chloridem vápenatým [v mg HL na kg sušiny]. Pokud bylo stanovení HL v přítocích provedeno ve více termínech, je v příslušném bodě znázorněno více sloupců (2 4). Zelenými kroužky jsou vyznačeny body odběru půdních vzorků, znázorněny jsou rovněž hranice mezi žlutě číslovanými dílčími povodími 1-7. 6

ph CaCl 2 7 6 5 4 3 3,72 3,57 3,34 5,92 5,43 5,97 3,34 3,93 3,77 4,06 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 transekt 6-3 Obr. 2. ph půdního extraktu v 0,01M CaCl 2 (Zbíral, 2000) ze vzorků půd odebraných v povodí potoka Rašeliník v transektu mezi levostranným přítokem 6 a pravostranným přítokem 3 ze svrchního horizontu (0 0,05 m). V důsledku aplikace vápence, provedené v povodí pravděpodobně v 80. letech 20. století, se dosud udrželo vyšší ph v blízkém okolí potoka Rašeliník na obou jeho březích (v bodech 4 6). Současně s vyhodnocením obsahu HL v přítocích byly zpracovány výsledky chemických analýz svrchního horizontu půd (horizonty O h a A) v povodí potoka Rašeliník. Z hodnot ph půdních extraktů v 0,01M roztoku CaCl 2 (Vávra, 2010) můžeme soudit, že v povodí byl v 80. letech 20. století aplikován vápenec. Tomu odpovídá mj. pozorovaný výskyt hrubších zrn vápence v půdních vzorcích. Zvýšené ph půdního výluhu, způsobené aplikací vápence, se dosud výrazněji projevuje v blízkém okolí potoka Rašeliník na obou jeho březích (v odběrových bodech 4 6, obr. 2). Dlouhodobá účinnost aplikovaného vápence nebo dolomitu byla potvrzena v řadě zahraničních prací (např. Hindar et al., 2003). Někdejší vápnění lokality se dosud projevuje také ve vyšším ph vod v přítocích potoka Rašeliník (Tab. I.); přitom byla zjištěna zajímavá sezónní dynamika ph vod v přítocích č. 3 a 6. Zatímco v létě a na podzim bylo ph vod vyšší (až 6,9 na přítoku 3 a 6,2 na přítoku 6), na jaře byly vody kyselejší (ph až 4,9 a 4,6) i při event. nižším obsahu huminových látek. Na obr. 1 jsou vyneseny hodnoty obsahu huminových látek extrahovatelných 0,01M CaCl 2 ve svrchních horizontech půd. Vysoký obsah HL CaCl2 byl zjištěn v rašelinných biotopech; vůbec nejvyšší hodnota 1 108 mg.kg -1 byla stanovena ve vzorku z malého rašeliniště, které však pro svou izolovanost nepřispívá k exportu HL do povodí (na obr. 1 vpravo dole). Mezi vybranými vlastnostmi půd byly zjištěny statisticky významné korelace. Celkový obsah organického uhlíku koreloval kladně s obsahem celkového dusíku (r = 0,82), síry (0,56), s poměrem C/N (0,49), vlhkostí půdy (0,88), obsahem huminových látek extrahovatelných 0,01M CaCl 2 (0,78) a pyrofosfátem (0,88), záporně koreloval s ph CaCl2 půdního extraktu (-0,41). Poměr C/N ve svrchním horizontu koreloval kladně s vlhkostí půdy (0,37) a obsahem huminových látek extrahovatelných 0,01M CaCl 2 (0,56). Dále byla nalezena statisticky významná korelace mezi vlhkostí půdy a obsahem HL extrahovatelných chloridem vápenatým (0,74) a pyrofosfátem sodným (0,71). Průkazné negativní korelace byly zjištěny mezi ph CaCl2 půdního extraktu a obsahem humusových látek v půdě extrahovatelných 0,01M CaCl 2 (r = -0,32) i pyrofosfátem (-0,39). 3. Složení a struktura huminových látek 3.1. Základní metody Huminové látky byly ze vzorků vod izolovány standardní metodou (Malcolm, 1991). Vzorek (20 40 litrů) byl po filtraci na bakteriálním filtru Whatman 0.45 µm 1 okyselen kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu ph 2. Filtrací byla oddělena sraženina huminových kyselin (HK), filtrát obsahující fulvokyseliny byl postupně nanášen na kolonu plněnou Amberlitem XAD-8, kde probíhala sorpce fulvokyselin. Po promytí kolony destilovanou vodou byly huminové látky eluovány roztokem 0,1M NaOH. Jímaný vzorek obsahující fulvát sodný byl čištěn a koncentrován ultrafiltrací, poté převeden do 1 Na filtru bylo zachyceno do 10 % organických látek zřejmě bakteriálního původu. 7

H + formy na koloně plněné silným katexem Dowex WX4, lyofilizován a uložen potmě a v suchu při laboratorní teplotě. Podíl huminových kyselin ve vzorcích vod, stanovený semikvantitativně při preparaci fulvokyselin, byl maximálně 40 % z HL. Ve vzorcích vod z přítoků Rašeliníku tedy převažovaly fulvokyseliny (~ 60 %). Poněkud vyšší zastoupení fulvokyselin, 70 % oproti 30% HK, zjistili ve vodách jezera Hohloh Abbt-Braun et al. (2004). Zahrneme-li do bilance ztrátu fulvokyselin v důsledku adsorpce na koloně (~5 % z HL), jsou získané výsledky srovnatelné s citovanou prací. Elementární analýza (CHNS) lyofilizovaných preparátů huminových látek byla provedena v Centrálních laboratořích VŠCHT Praha na přístroji Elementar vario EL III firmy Elementar. Přesnost metody je výrobcem stanovena pro souběžnou analýzu 5 mg standardu kyseliny 4-aminobenzensulfonové v modulu CHNS na < 0,1% absolutně pro každý prvek. Každý vzorek byl analyzován dvakrát, obsah prvku je uveden jako hmotnostní zlomek prvku v bezpopelové sušině, vyjádřený v procentech. Poměr C/N byl vypočítán jako poměr hmotnostních zlomků obou prvků. Obsah popelovin byl stanoven žíháním vzorku při 550 C. V případě, že bylo k dispozici jen malé množství vzorku, bylo stanovení vlhkosti a popelovin provedeno termogravimetricky (TGA) v Centrálních laboratořích VŠCHT Praha na termováze Stanton Redcroft TG-750 v teplotním intervalu 30 850 C při rychlosti ohřevu 10 C. min -1 a dynamické atmosféře (vzduch 50 ml. min -1 ). Příklad průběhu termického rozkladu je v příloze na obr. 1. Výsledky elementární analýzy huminových látek izolovaných z povrchových vod na české i saské straně jsou shrnuty v tab. III. Je zřejmé, že elementární složení HL je velmi podobné, obsah uhlíku se pohyboval od 53,0 do 56,7 %, vodíku mezi 3,9 4,6 %, kyslíku mezi 37,1 42,2 %. Větší rozdíly, zjištěné u dusíku, mohou být důsledkem vysokého stavu zvěře v oboře Fláje, což se projevuje také sezónními rozdíly v obsahu dusíku i nižším poměrem C/N ve zdejších HL. Poměr C/N v půdě i huminových látkách je indikátorem saturace ekosystému dusíkem, zvláště citlivým u ekosystémů s půdami na dusík chudými, jako jsou horské lesní a rašelinné půdy. Nejvyšší poměr C/N byl zjištěn u fulvokyselin v rašelinné tůňce v povodí potoka Rauschenbach, nižší byl ve fulvokyselinách izolovaných z vod v povodí nádrže Galgenteich u Altenbergu. Podobnou hodnotu C/N = 75 uvádějí pro fulvokyseliny z jezera Hohloh Abbt-Braun et al. (2004). Na české straně byl zjištěn nejvyšší poměr C/N u fulvokyselin z Černého rybníka (63), fulvokyseliny izolované z přítoků potoka Rašeliník měly poměr C/N nižší (až 45,6). U huminových kyselin izolovaných z vod přítoků č. 3 a 6 byl zjištěn poměr C/N 29 a 37, tedy nižší než u odpovídajících FK. Huminové látky izolované z přítoků Rašeliníku obsahovaly maximálně 1,4 % síry, u většiny vzorků však obsah nepřekročil 0,5 %. 8

Tab. III. Elementární složení huminových látek izolovaných z povrchových vod (bezpopelová sušina, hmotnostní zlomek vyjádřený v procentech). FK, fulvokyseliny; HK, huminové kyseliny. Vzorek Fláje Datum odběru C H N O S C/N % FK, Černý rybník III. 2010 54,61 3,92 0,86 40,61 n.d.* 63,2 FK, Rašeliník 6 VII. 2010 55,10 3,95 1,15 38,37 1,438 48,1 FK, Rašeliník 6 X. 2010 54,58 3,90 1,04 39,51 0,968 52,3 FK, Rašeliník 6 IV. 2011 55,04 3,79 0,99 39,35 0,831 55,7 FK, Rašeliník 3 IV. 2012 56,25 4,04 0,93 38,77 <0,5 60,2 FK, Rašeliník 3 VII. 2012 55,27 4,33 1,19 38,81 0,408 46,4 FK, Rašeliník 3 IX. 2012 54,75 4,49 1,20 39,15 0,400 45,6 FK, Rašeliník 3 X. 2012 56,66 4,54 1,23 37,14 0,434 46,2 FK, Rašeliník 3 IV. 2013 55,57 4,17 1,05 38,82 0,390 53,0 HK, Rašeliník 3 IV. 2013 53,57 4,56 1,86 39,45 0,560 28,8 FK, Rašeliník 6 VII. 2013 55,24 4,15 1,06 39,20 0,348 52,1 HK, Rašeliník 6 VII. 2013 55,15 4,52 1,48 38,41 0,454 37,3 Org.**, Rašeliník 6 VII. 2013 56,62 4,76 1,97 36,18 0,461 28,7 Německo FK, Rauschenbach XII. 2011 52,95 4,06 0,75 42,24 <0,5 70,5 FK, Galgenteich 1 IV. 2012 55,07 3,87 0,92 40,14 <0,5 60,0 FK, Galgenteich 2 IV. 2012 56,11 4,19 0,98 38,72 <0,5 57,2 *) n.d., nebylo detekováno **) Koloidní organické látky 3.2. 13 C NMR spektroskopie 13 C NMR je spektrometrická metoda, která umožňuje studovat strukturu organických sloučenin měřením interakce elektromagnetických vln s jádry atomů 13 C v silném magnetickém poli. Měřením získáme 13 C NMR spektrum vzorku, znázorňující závislost intenzity této interakce na frekvenci elektromagnetických vln, která je vyjádřena jako tzv. chemický posun δ vůči standardu (například tetramethylsilanu, TMS) v jednotkách ppm. Protože vlastnosti jader 13 C jsou ovlivněny jejich nejbližším okolím, lze z 13 C NMR spektra zjistit podrobné informace o struktuře molekul. Díky tomu je 13 C NMR spektroskopie základní metodou studia struktury huminových látek. 13 C NMR spektra HL lze měřit v roztoku i v pevné fázi. Při rutinním měření 13 C NMR huminových látek v pevném stavu, jež umožňuje měřit i nerozpustné frakce huminových látek a vyhnout se případným změnám jejich struktury při rozpouštění, bývá preferována technika CP/MAS NMR (Cross Polarization, Magic Angle Spinning, zkřížená polarizace při rotaci vzorku pod magickým úhlem). Na přístrojový čas náročnější 13 C NMR spektroskopie v roztoku má naproti tomu vyšší rozlišení a také problémy spojené se stanovením jednotlivých typů atomu uhlíku jsou lépe prostudovány (Novák et Hrabal, 2011). K získání dostatečně kvalitního spektra HL s vysokým odstupem signálů od šumu je při měření v roztoku nezbytná poměrně dlouhá doba akumulace dat. Typická doba měření 13 C NMR spektra huminových kyselin je 12 hodin. Výsledný záznam FID (Free In- 9

duction Decay, volně doznívající indukce) se před Fourierovou transformací matematicky upravuje s použitím vážící funkce. Tato vhodně zvolená klesající exponenciální funkce zvyšuje poměr signálu k šumu rozšířením základní linie spektra (line broadening, LB) bez výrazného snížení rozlišení. V 13 C NMR spektrech huminových kyselin se rozlišují čtyři základní oblasti: oblast alifatických atomů C (0 45 ppm), oblast O-alkylových a peptidových C (45 110 ppm), aromatických a fenolických C (110 160 ppm) a karboxylových a karbonylových atomů C (160 200/230 ppm). Hranice aromatického C se vedle hodnoty 110 ppm, obvyklé při měření v pevné fázi, volí při měření v roztoku v lokálním minimu mezi 105 108 ppm, neboť je ovlivněna podmínkami měření (koncentrací, ph, iontovou silou roztoku). Podobně se při měření v roztoku volí horní hranice aromatické oblasti při 165 ppm. V alifatické oblasti 0 45 ppm nalézáme signály alkanových uhlíků mastných kyselin a vosků, výrazný signál při 22 ppm patří uhlíkům CH 3 skupin. Uhlíkové atomy proteinů přispívají signály v oblasti 20 60 ppm a karbonylovou skupinou při 175 ppm. Signály methylenových skupin při 27, 31 a 40 ppm pocházejí z uhlíků methylenových řetězců v alkanech a mastných kyselinách, signály při 31 a 40 ppm patří methylenové skupině na fenolickém nebo aromatickém kruhu včetně methylenových můstků mezi aromatickými kruhy. V oblasti 60 90 ppm jsou dominující signály celulosy a hemicelulos, určitý podíl připadá také na atomy C postranních alifatických řetězců ligninu, především charakteristický signál skupiny O-CH 3 vázané na aromatické jádro ligninu s posunem při 57 ppm. Pás při 55 56 (58) ppm přiřazujeme O CH 3 skupinám methylovaných sacharidů v hemicelulosách, do této oblasti přispívají také α-c atomy aminokyselin (56 62 ppm) a alifatické CH2 skupiny, vázané na aromatický kruh v ligninu. Výrazný pás s maximem při 72 ppm odpovídá atomům C-2, C-3 a C-5 celulosy; maximum pásu C-1 celulosy je při 105 ppm, rameno pásu při 103 ppm pochází od C-1 atomu hemicelulos. Pás v oblasti přibližně 95 105 ppm přísluší anomerním uhlíkům v sacharidech, pásy mezi 62 až 80 ppm různým alifatickým alkoholům a sacharidům. Aromatické strukturní jednotky huminových látek jsou odvozeny od ligninu, složeného z monomerních jednotek 4-hydroxycinnamylalkoholu, koniferylalkoholu a sinapylalkoholu. V aromatické oblasti spektra můžeme rozlišit tři výraznější signály při hodnotách chemických posunů 115, 130 a 145 150 ppm, přičemž poslední odpovídá fenolickým atomům C. Atomy C-2 a C-6 sinapylových (syringylových) jednotek přispívají k pásu při 105 ppm. Karboxylové uhlíky se projevují výrazným pásem v oblasti 165 190 ppm s maximem při 173 175 ppm. Část signálu karboxylů může pocházet z uronové kyseliny v hemicelulose nebo proteinů sorbovaných HK. V oblasti 190 230 ppm bývá pozorován méně intenzívní pás karbonylových atomů uhlíku, který se může projevit také jako rameno pásu karboxylů. Hlavním strukturním údajem, získaným z NMR spekter HK, je jejich aromaticita f a, vyjadřovaná jako jako podíl součtu aromatických a fenolických atomů C ke všem atomům C s výjimkou karboxylových a karbonylových, které nelze přiřadit ani alifatickým, ani aromatickým strukturám: a I = I 106 165 0 165 3.2.1. Materiál a metody f 100% 13 C NMR spektra vzorků huminových látek byla měřena v Centrálních laboratořích VŠCHT Praha na NMR spektrometru DRX 500 Avance firmy BRUKER s pracovní frekvencí pro jádro 13 C 125,76 MHz. Měření byla prováděna v 5mm kyvetách na sondě citlivé pro jádra 1 H/ 13 C/ 19 F/ 31 P. Pro potlačení nežádoucích deformací základní linie byla využita pulsní sekvence Antiring. Experi- 10

mentální parametry: šířka spektra 298,9 ppm, délka 90 deg pulsu 5,7 μs, akviziční čas 0,43 s, relaxační doba mezi jednotlivými skeny 4,0 s, počet opakování (akumulací) 12 000. Naměřená data ve formě FID byla pro zlepšení poměru signál/šum vynásobena exponenciální funkcí s rozšířením čáry 25 Hz (LB). Fourierovou transformací byla data převedena do formy spekter, následně byla provedena korekce fáze a vyrovnání základní linie proložením polynomem 5. stupně. Stupnice chemických posunů je vztažena na interní standard (DSS, sodná sůl 2,2-dimethyl-2-silylpentansulfonové kyseliny, posun 0 ppm). 3.2.2. Výsledky a diskuse Vybraná spektra huminových látek jsou na obr. 3 a 4. Strukturní charakterizace HL je shrnuta v Tab. IV. Ve spektrech je charakteristický výrazný pás karboxylových atomů uhlíku při 170 190 ppm, doprovázený slabším pásem karbonylových atomů uhlíku. Aromatická oblast má maximum při 128 ppm, signály fenolických atomů C se nacházejí při posunech 145 160 ppm. Pás O-alkylových atomů C má maximum při 72 ppm a charakteristický signál O-CH 3 skupin vázaných k aromatickému kruhu (56 57 ppm), přechází v pás alifatických atomů C (45 5 ppm). Charakter 13 C NMR spekter vzorků huminových látek izolovaných z vod v povodí Rašeliníku i odebraných v Sasku je charakteristický pro fulvokyseliny rašelinného původu (Novák et Hrabal, 2011). Pro srovnání jsou v Tab. IV uvedeny také strukturní charakteristiky huminových kyselin a fulvokyselin z rašeliny, odebrané z těženého rašeliniště (závod Branná, Rašelina Soběslav, a.s.), které byly připraveny ve větším množství a používány jako standard a modelová látka v řadě experimentů. Obr. 3. 13 C NMR spektrum huminových látek, izolovaných z vody z pravostranného přítoku Rašeliníku (č. 3), odebraných v září 2012. Nad spektrem jsou vyznačeny oblasti pásů (signálů) hlavních strukturních jednotek (karbonyly, karboxyly, aromatické atomy C, O-alkylové a alifatické atomy C). Obr. 4. 13 C NMR spektra huminových látek, izolovaných z rašelinných vod odebraných na saské straně (v rašelinných tůních v povodí potoka Rauschenbachu, v nádrži Galgenteich u Altenbergu a z jejího přítoku). 11

Tab. IV. 13 C NMR strukturní analýza huminových látek z povodí Rašeliníku a z vod odebraných v Sasku. Zastoupení jednotlivých typů atomů uhlíku a aromaticita f a jsou uvedenty v %. Vzorek Fláje Datum odběru f a % COOH-C Arom. C O-alkyl C Alif. C % FK, Černý rybník III. 2010 41,8 31,4 28,7 12,5 27,4 FK, Rašeliník 6 VII. 2010 42,5 22,4 32,9 25,4 19,3 FK, Rašeliník 6 X. 2010 53,5 35,5 34,5 22,1 7,8 FK, Rašeliník 6 IV. 2011 51,1 26,3 37,7 24,2 11,8 FK, Rašeliník 3 IX. 2012 36,7 21,3 28,9 27,0 22,8 FK, Rašeliník 6 VII. 2013 49,5 26,0 36,6 21,3 16,1 HK, Rašeliník 6 VII. 2013 41,0 27,4 29,8 29,0 13,8 FK, rašelina Branná 2010 22,4 18,3 18,3 32,3 31,2 HK, rašelina Branná 2010 44,8 15,4 37,9 26,0 20,7 Německo FK, Rauschenbach XII. 2011 53,5 28,2 38,4 18,2 15,2 FK, Galgenteich 1 IV. 2012 41,4 22,9 31,9 26,7 18,4 FK, Galgenteich 2 IV. 2012 42,4 26,8 31,1 24,7 17,5 3.3. FTIR spektrometrie Navzdory složité struktuře huminových látek pozorujeme v jejich infračervených spektrech řadu absorpčních pásů, charakteristických pro specifické molekulární struktury. I přes nejednoznačné přiřazení některých pásů poskytuje infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací (FTIR, Fourier Transform InfraRed Spectroscopy) důležité informace o povaze huminových látek, jejich reaktivitě, prostorovém uspořádání kyslíkatých funkčních skupin, podílu sacharidických a proteinových složek i o obsahu vázaných anorganických příměsí. Obecně v IR spektrometrii, podobně jako u jiných optických metod, platí Lambert-Beerův zákon, a proto při použití speciálních postupů (např. Fourierovské dekonvoluce nebo matematické separace absorpčních pásů) má tato metoda dobré předpoklady pro kvantitativní analýzu funkčních skupin HL. Vedle měření FTIR spekter v pevné fázi (KBr tablety) se dnes široce uplatňuje také měření difúzně reflektančních IR spekter (DRI- FTS, často též DRIFT) huminových látek, pro kvantitativní účely je však vhodnější transmitanční metoda nebo jednoodrazová reflexe na nástavci ATR (Attenuated Total Reflection). Velkou předností FTIR spektrometrie je malé množství spotřebovaného vzorku, podstatně rychlejší měření než například u 13 C NMR spektrometrie, možnost klasifikace huminových látek podle jejich FTIR spektra a srovnání spektra neznámého vzorku s vlastní knihovnou spekter. 3.3.1. Metody FTIR spektra byla měřena na spektrometru Nicolet 6700 s jednoodrazovým ATR nástavcem Smart Miracle s Si krystalem při rozlišení 4 cm -1, 64 akumulacích v oblasti vlnočtů 4000 630 cm -1. U spekter byly provedeny korekce na CO 2, ATR korekce a korekce základní linie spektra. Zpracování a vyhodnocení spekter bylo provedeno programem OMNIC 8.0.342 (Thermo Fisher Scientific Inc.). 12

3.3.2. Výsledky Infračervená spektra huminových látek jsou uvedena v Příloze 1. Srovnání FTIR spekter huminových látek izolovaných z vod přítoků Rašeliníku (obr. 5) i z rašelinných vod odebraných na saské straně (obr. 6) s databází FTIR spekter huminových látek ukázalo, že vody obsahují fulvokyseliny rašelinného původu (Tab. V), strukturou podobné také půdním fulvokyselinám z rašelinných nebo podmáčených horských smrčin. Velká podobnost byla zjištěna také s fulvokyselinami, izolovanými z rašeliny, těžené v ložisku Branná u Třeboně (Rašelina Soběslav, a.s.). FTIR spektrum huminových kyselin, izolovaných z vody pravostranného přítoku Rašeliníku č. 3, odebrané v dubnu 2013, se nejvíce podobalo spektrům fulvokyselin z organických horizontů rašelinného podzolu horských smrčin (skóre 96,0 95,4 %). Oproti fulvokyselinám z rašelinných vod měly HK ve spektru FTIR zřetelné pásy při vlnočtech 1082 cm -1 (C O vazebné vibrace polysacharidů nebo polysacharidům podobných látek, event. vazebné vibrace C C alifatických skupin), 1121 a 1164 cm -1 ( C OH vazebné vibrace alifatických OH), výraznější byl také pás při 1040 cm -1, zřejmě pocházející od stop síranů, sorbovaných huminovými látkami v průběhu preparace. Intenzity hlavních pásů FTIR spekter studovaných HL jsou uvedeny v příloze (Tab. XI). Absorbance 0.30 0.24 0.20 0.16 0.12 0.08 0.04 0.00-0.04-0.08 3401.9 2941.7 Obr. 5. FTIR spektra huminových látek izolovaných ze vzorků vod odebraných z levostranného přítoku (č. 6) potoka Rašeliník v červenci a říjnu roku 2010 a v dubnu 2011. Absorbance 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00-0.10 3565.1 3363.7 3000 2944.8 3000 July 2010 October 2010 April 2011 Obr. 6. FTIR spektra huminových látek izolovaných ze vzorků vod, odebraných na saské straně v rašelinných tůních v povodí potoka Rauschenbach v prosinci 2011 a v přítoku a nádrži Galgenteich u Altenbergu v dubnu 2012. 1714.4 1614.41621.4 1515.8 2000 1500-1 Wavenumbers (cm ) Rauschenbach Altenberg 2 Altenberg 1 1715.2 1650.3 1615.0 1515.6 2000 1500-1 Wavenumbers (cm ) 1397.7 1392.9 1231.5 1226.4 1043.0 1000 1000 772.3 772.1 13

Tab. V. Vzájemná podobnost studovaných huminových látek stanovená na základě FTIR spekter v oblasti vlnočtů 3495 650 cm -1. Míra podobnosti spekter je vyjádřena jako skóre (match) v procentech, látky jsou seřazeny podle podobnosti v klesajícím pořadí (skóre 100 % znamená látku s identickým spektrem). Do srovnání byly zahrnuty i archivní vzorky HL, (v tabulce odlišené barvou). Lokalita Datum odběru Rauschenbach Říjen 2011 Rašeliník (6) Duben 2011 Rauschenbach Říjen 2011 Rašeliník (6) Říjen 2010 Rauschenbach Říjen 2011 Rašeliník (6) Červenec 2010 Rašeliník (6) Duben 2011 Mumlavská hora 1995 Mumlavská hora 1995 Rašeliník (6) Říjen 2010 Pašer. chodník 1996 Rašelina Branná 2009 Popis vzorku a lokalita, [kód vzorku] Skóre HL izolované z rašelinné vody odebrané z tůně po revitalizaci rašeliniště v povodí 100,0 potoka Rauschenbach (Sasko) [FL1110_1HL_D] HL izolované z vody levostranného přítoku potoka Rašeliník [FL114] 98,8 HL izolované z rašelinné vody odebrané z tůně po revitalizaci rašeliniště v povodí 98,7 potoka Rauschenbach (Sasko) paralelní izolát pro kontrolu [FL1110_2HL_D] HL izolované z vody levostranného přítoku č. 6 potoka Rašeliník [FL1010b] 98,5 HL izolované z rašelinné vody odebrané z tůně po revitalizaci rašeliniště v povodí 98,4 potoka Rauschenbach (Sasko) paralelní izolát pro kontrolu, opakované kontrolní měření FTIR spectra [FL1110_2HL_D(b)] HL izolované z vody levostranného přítoku č. 6 potoka Rašeliník [FL107HL] 98,3 HL izolované z vody levostranného přítoku č. 6 potoka Rašeliník [FL114(c)] 98,2 Fulvokyseliny, izolované z B hs horizontu podzolu v horské rašelinné smrčině (archívní vzorek z Mumlavské hory v Krkonoších) [H75FK] 98,0 Fulvokyseliny, izolované z B s horizontu podzolu v horské rašelinné smrčině (archívní vzorek z Mumlavské hory v Krkonoších) [H85FK] 98,0 HL izolované z vody levostranného přítoku č. 6 potoka Rašeliník [FL1010] 97,6 Fulvokyseliny, izolované z B horizontu podzolu v horské smrčině (archívní vzorek, výzkumná plocha Pašerácký chodník, Krkonoše) [D76FK (b)] Fulvokyseliny, izolované standardním postupem z rašeliny, těžené z ložiska Branná (vzorek rašeliny byl poskytnut firmou Rašelina Soběslav, a.s.) [RB29FK] 97,6 97,5 3.4. UV/VIS spektrometrie Huminové látky absorbují elektromagnetické záření v UV/VIS oblasti (190 900 nm). Zvlášť silná absorpce v oblasti UV je vyvolána přítomností aromatických chromoforů a dalších organických látek. Charakteristické absorpce při 254 nm se využívá pro kvantitativní stanovení aromatických vazeb C=C, protože v substituovaných benzenových kruzích nebo polyfenolech má právě u této vlnové délky maximum pás přenosu elektronu (π π*). Směrem k větším vlnovým délkám se absorpce HL plynule snižuje. K absorpci v UV oblasti přispívají ketonické skupiny C=O, které v menší míře absorbují také ve viditelné oblasti spektra, a chinony. Absorpce při 260 280 nm je vyvolána ligninem v počátečním stadiu rozkladu a chinony. Ve viditelné oblasti spektra je absorpce ovlivněna stupněm substituce aromatických kruhů, případně stupněm jejich kondenzace. Absorpce v oblasti 400 500 nm je vyvolána obsahem organických látek v počátečním stadiu humifikace, podle Kononové (Kononova, 1963) indikuje vyšší absorbance při 600 670 nm silně humifikované organické látky s vyšším stupněm kondenzace aromatických kruhů. Spektra preparovaných HL se standardně 14

měří v roztoku 0,05 M NaHCO 3. Parametrem nezávislým na koncentraci HL je poměr absorbancí při 465 a 665 nm, tzv. barevný koeficient Q 4/6 = A 465. U huminových kyselin bývá poměr A 465 menší (4 8), u půdních fulvokyselin jsou hodnoty zpravidla vyšší než cca 13 15, mohou se blížit i 20 (Baes et Bloom, 1990). Hodnota barevného koeficientu negativně koreluje s molekulovou hmotností huminových látek, ale také s jejich aromaticitou (Chen et al., 1977). 3.4.1. Metody Vzorky vod byly před měřením zbaveny pevných nečistot odstředěním. UV/VIS spektra vzorků vod i roztoků huminových látek o koncentraci 160 mg.l -1 v 0,05M roztoku hydrogenuhličitanu sodného (Lachema Brno) v rozsahu vlnových délek 200 900 nm byla měřena při laboratorní teplotě na UV/VIS spektrofotometru Varian Cary 3E v křemenných kyvetách tloušťky 0,01 m. Při měření vzorků vod byla ve srovnávací kyvetě (blank) destilovaná voda, při měření roztoků izolovaných huminových látek 0,05M NaHCO 3. 3.4.2. Výsledky a diskuse UV/VIS spektra vzorků vod jsou znázorněna na obrázcích 7 (Rašeliník) a 8 (Galgenteich, Altenberg). Poměr A 465 ve vzorcích vod z Rašeliníku se pohyboval v intervalu 7,8 12,3 (Tab. VI). Ve vodě z lesního potoka u Altenbergu byl zjištěn poměr A 465 9,5. Nižší hodnotu (6,5) měla voda z nádrže Galgenteich. U vzorků vod je sice tento koeficient ovlivněn ph vody a přítomností dalších (nehuminových) látek, výraznější změny absorbance huminových látek ve vodách však nastávají až v silně bazickém prostředí. Pro přesnější srovnání kvality huminových látek obsažených ve vodách byly tyto HL izolovány standardní metodou a jejich absorbance byly měřeny za standardních podmínek (Baes et Bloom, 1990). Frakce fulvokyselin, izolovaných z vod přítoků Rašeliníku, měly poměr absorbancí A 465 v rozmezí 12,9 15,4, odpovídající fulvokyselinám (Tab. VII). Ještě vyšší hodnota byla zjištěna pro FK z vod sousedního Černého rybníka. Nižší poměr A 465 byl zjištěn u FK izolovaných z tůní v povodí potoka Rauschenbach; hodnota byla patrně ovlivněna přítomností určitého podílu huminových kyselin. Fulvokyseliny z lesního potoka u Altenbergu měly hodnotu podobnou jako FK z Rašeliníku, o něco vyšší hodnotu A 465 vykazovaly i FK z nádrže Galgenteich. U huminových kyselin, izolovaných z vod pravostranného přítoku č. 3, byl stanoven poměr A 465 11,97, velmi blízký hodnotě pro huminové kyseliny z protilehlého přítoku 6 (Tab. VII). Tyto hodnoty byly poněkud nižší než u fulvokyselin ze stejného vzorku vody, nicméně značně vyšší, než je obvyklé pro huminové kyseliny. Pro srovnání byly změřeny také koeficienty A 465 huminových látek izolovaných z rašeliny lomu Branná (Rašelina Soběslav, a. s.); huminové kyseliny měly poměr A 465 8,3, fulvokyseliny 16,5. A 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 SB 3 6 0.0 200 300 400 600 800 λ / nm Obr. 7. a) UV/VIS spektra vzorků vod odebraných dne 18. 4. 2013 na přítocích Rašeliníku č. 3 a 6 a v malé tůňce (SB, small basin). a) A 5 4 3 2 1 0 FA 200 300 H 15

a) 5 b) 2.0 1.8 1 4 1.6 1.4 3 1.2 1.0 A 2 HA A 0.8 2 1 FA 0.6 0.4 0.2 600 800 0 200 300 400 600 800 λ / nm 0.0 200 300 400 600 800 λ /nm Obr. 7. b) UV/VIS spektra vzorků huminových kyselin a fulvokyselin izolovaných z vody, odebrané 18. 4. 2013 na přítoku č. 3 potoka Rašeliník. Obr. 8. UV/VIS spektra vzorků vod odebraných v dubnu 2012 u obce Altenberg z potoka v lese (1) a na výtoku z nádrže Galgenteich (2). Tab. VI. Absorbance vzorků rašelinných vod v UV a VIS oblasti, jejich ph a obsah huminových látek (HL) ve vodách, odebraných 18. 4. 2012. Vzorky byly měřeny 2krát. Místo odběru A 254 A 280 A 465 A 665 A 465 ph HL* mg/l Fláje Pravostranný přítok Rašeliníku (na mapě mezi odběr. místy 7-4 a 7-5) 1,0862 1,0934 Levostranný přítok do přítoku 3 (tůňka) 1,2621 1,2650 Pravostranný přítok Rašeliníku pod silnicí 0,5117 0,5211 Levostranný přítok Rašeliníku, č. 6 0,7738 0,7789 Rašeliník, před přítokem č. 6 0,3462 0,3400 Tůňka na pravostr. přítoku do 6 1,1095 1,1161 Poslední pravostranný přítok Rašeliníku před přehrádkou (č. 7) 0,1688 0,1684 Potok Rašeliník, na vtoku do přehrádky 0,2386 0,2404 Německo 0,7867 0,7981 0,9579 0,9653 0,3779 0,3793 0,5938 0,5994 0,2679 0,2614 0,8486 0,8591 0,1286 0,1272 0,1812 0,1834 0,0351 0,0354 0,0550 0,0566 0,0182 0,0180 0,0350 0,0356 0,0182 0,0172 0,0486 0,0492 0,0074 0,0070 0,0110 0,0112 0,0035 0,0034 0,0064 0,0063 0,0020 0,0020 0,0034 0,0036 0,0022 0,0022 0,0048 0,0050 0,0006 0,0006 0,0012 0,0012 10,03 10,41 8,59 8,98 9,10 9,00 10,29 9,89 8,27 7,82 10,13 9,84 12,33 11,67 9,17 9,33 4,36 4,33 5,22 5,24 5,20 5,14 5,25 5,25 6,82 6,80 4,63 4,60 6,96 6,98 6,92 6,89 D-12-1, lesní potok,altenberg (A) 0,9653 0,7349 0,0436 0,0046 9,48 4,72 35 D-12-1, lesní potok Altenberg (A) 0,9763 0,7512 0,0440 0,0046 9,57 4,72 35 D-12-2, nádrž Galgenteich (B) 0,5200 0,3904 0,0220 0,0034 6,47 5,63 15 D-12-2, nádrž Galgenteich (B) 0,5147 0,3873 0,0212 0,0032 6,63 5,67 15 25 50 12 30 12 50 6 9 Pozn.: Číslování přítoků Rašeliníku (míst odběru) odpovídá bodům na mapě z průzkumu dr. Vávry (Vávra, 2010). Viz též obr. 1. 16

3.5. Gelová (vylučovací) chromatografie (GPC, SEC) Jednou ze základních charakteristik huminových látek je jejich molekulová hmotnost (MW). Na rozdíl od chemicky čistých látek je však v případě přírodních makromolekulárních frakcí, jako jsou huminové látky, molekulová hmotnost intervalem hodnot s určitou distribucí (rozdělením). Nejpoužívanější metoda pro stanovení MW huminových látek je nízkotlaká vylučovací chromatografie (SEC), dělící látky na základě rozdílné velikosti a tvaru molekul (molekulové hmotnosti). Stacionární fáze je tvořena gelem, jímž je inertní zesítěná nerozpustná polymerní matrice, vytvářející v gelu póry různé velikosti. Jako mobilní fáze (neboli eluční roztok) se používá voda, fyziologický roztok fosfátového pufru nebo například Britton-Robinsonův pufr o vhodném ph. Roztok analyzované HL se nanese na gel umístěný ve skleněné koloně, jíž protéká konstantní rychlostí eluční činidlo. Molekuly zkoumané látky procházejí kolonou různou rychlostí molekuly větší než póry gelu procházejí rychleji, menší molekuly pronikají do pórů gelu, jejich postup kolonou se tak zpomaluje a jsou z kolony vyloučeny později. Eluát se jímá do zkumavek, v nichž se stanoví objem a relativní koncentrace HL jako absorbance při vlnové délce 280 nm, nebo se provádí kontinuální měření absorbance při výstupu eluátu z kolony. 3.5.1. Metody Měření bylo provedeno na skleněné koloně (485 18 mm) plněné Sephadexem G-50, mobilní fází byl pufr dle Britton-Robinsona o ph 9,0. Kalibrace kolony byla provedena pomocí standardů polystyrensulfonátu (PSS) a blue-dextranu. Na kolonu bylo naneseno 0,5 ml roztoku, připraveného rozpuštěním 5 mg vzorku huminové látky v 1 ml mobilní fáze. Relativní koncentrace standardu i vzorku v eluátu byla měřena jako absorbance při 280 nm v 0,01 m křemenné kyvetě na UV/ VIS spektrofotometru Libra S 22. Průměrná molekulová hmotnost se vypočítá dle vzorce i N M i W M r+ 1 r i i i i M = = r r 1 NiM i Wi M i i i kde M i je molekulová hmotnost i-té frakce, N i je počet a W i celková hmotnost molekul s molekulovou hmotností M i. Jako M r se označuje molekulová hmotnost frakce s nejvyšší absorbancí A 280. Pro r = 1 je výsledná průměrná molekulová hmotnost označována M w ( weight-average ). 3.5.2. Výsledky a diskuse Pomocí vylučovací chromatografie byly stanoveny relativní molekulové hmotnosti M r a průměrné molekulové hmotnosti M w huminových látek, izolovaných z vod přítoků Rašeliníku, z Černého rybníka, z tůní v povodí potoka Rauschenbach v Sasku i z nádrže Galgenteich u Altenbergu. Chromatogramy všech HL izolovaných z vod měly typický bimodální průběh, přičemž vysokomolekulární látky, jimž odpovídal první pík, byly vylučovány při mezerovém objemu kolony V 0. U všech studovaných vzorků výrazně převažovala frakce s nižšími molekulovými hmotnostmi M r mezi 1,77 a 2,51 kda její podíl byl u fulvokyselin 93,0 99,2 % a u huminových kyselin 90,4 91,1 % (Tab. VII). Průměrné molekulové hmotnosti M w byly v průměru 1,3krát vyšší než M r, dosahovaly hodnot 2,29 3,28 kda. Podíl vysokomolekulární frakce, jíž odpovídalo malé maximum (pík) na chromatogramu a která pravděpodobně obsahovala bakteriální peptidoglykany adsorbované na huminové látky, byl nízký, v průměru 3 % u fulvokyselin a 9 % u huminových kyselin. Větší podíl vysokomolekulární frakce byl zjištěn u fulvokyselin z tůní v povodí Rauschenbachu (5,3 a 7 %), jejichž voda měla zřejmě zvýšený obsah huminových kyselin (tomu odpovídá i nižší hodnota podílu absorbancí A 465 u tohoto 17

vzorku). Fulvokyseliny z povodí Rašeliníku měly obsah vysokomolekulární frakce nižší, mírně větší zastoupení zde bylo zjištěno v letním období a v říjnu (Tab. VII). Huminové kyseliny z přítoků č. 3 a 6 potoka Rašeliník měly molekulovou hmotnost M r poněkud vyšší než fulvokyseliny izolované ze stejných vzorků vod, podíl vysokomolekulární frakce se u HK pohyboval mezi 9 10 %, byl tedy vyšší než u fulvokyselin. Huminové kyseliny měly průměrné molekulové hmotnosti M w podobné jako fulvokyseliny, což bylo zřejmě způsobeno částečnou sorpcí HK na Sephadexu, v jejímž důsledku vycházejí průměrné molekulové hmotnosti HK nižší. Mezi uvedenými sledovanými charakteristikami fulvokyselin byly zjištěny významné korelace (Tab. VIII). Je zřejmé, že s klesající relativní molekulovou hmotností M r i M w fulvokyselin se snižuje také podíl frakce s vyšší molekulovou hmotností (která ovšem není do výpočtu M w zahrnuta) a současně se zvyšuje poměr absorbancí A 465 (obr. 9 a 10), což odpovídá zvyšujícímu se podílu fulvokyselin, které mají poměr absorbancí A 465 vyšší než huminové kyseliny (Stevenson, 1994). Tab. VII. Výsledky vylučovací chromatografie fulvokyselin a huminových kyselin izolovaných z vod, odebraných na Flájích (Rašeliník a jeho přítoky) a na saské straně (Rauschenbach, Altenberg). Podíl huminových látek s nižší molekulovou hmotností (1 5 kda, LM HS), jejich molekulová hmotnost M r, průměrná molekulová hmotnost M w (weight-averaged) a poměr absorbancí A 465 roztoku HL v 0,05M NaHCO 3. Vzorek Datum odběru LM HS % M r kda M w kda A 465 Fláje FK, Černý rybník III. 2010 99,2 1,96 2,42 18,03 FK, Rašeliník 6# VII. 2010 97,0 1,92 2,70 13,81 FK, Rašeliník 6# X. 2010 95,4 2,06 2,89 14,32 FK, Rašeliník 6# IV. 2011 97,6 2,12 2,92 13,88 FK, Rašeliník 6# VII. 2013 95,6 1,98 2,77 12,91 HK, Rašeliník 6# VII. 2013 90,4 2,19 2,74 11,89 FK, Rašeliník 3* IV. 2012 98,0 2,09 2,77 13,32 FK, Rašeliník 3* VII. 2012 97,1 1,85 2,41 13,36 FK, Rašeliník 3* IX. 2012 98,6 1,87 2,38 15,38 FK, Rašeliník 3* X. 2012 97,9 1,83 2,33 13,76 FK, Rašeliník 3* IV. 2013 98,7 1,86 2,29 15,23 HK, Rašeliník 3* IV. 2013 91,1 2,42 2,81 11,97 Německo FK, Rauschenbach X. 2011 94,7 2,29 2,99 11,46 FK, Rauschenbach XII. 2011 93,0 2,51 3,28 11,22 FK, Galgenteich 1 (lesní potok) IV. 2012 94,8 2,27 3,09 13,10 FK, Galgenteich 2 (nádrž) IV. 2012 98,9 1,77 2,45 14,67 * pravostranný přítok Rašeliníku, dílčí povodí č. 3; # levostranný přítok Rašeliníku, dílčí povodí č. 6. 18

Tab. VIII. Korelace vlastností fulvokyselin izolovaných z vod. LM HS, podíl nížemolekulární frakce huminových látek; M r, relativní molekulová hmotnost; M w, průměrná molekulová hmotnost; A 465, poměr absorbancí při vlnových délkách 465 a 665 nm (tzv. barevný koeficient). Tučně vyznačené korelace jsou významné na hladině p < 0,05; n = 12. M r, M w / kda Obr. 9. Korelace molekulových hmotností M r, M w a podílu nížemolekulární frakce (LM HS) ve vzorcích fulvokyselin izolovaných z vod. A 465 LM HS M w A 465 M r LM HS 1-0,78 0,75-0,78 M w -0,78 1-0,67 0,94 A 465 0,75-0,67 1-0,63 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 M r -0,78 0,94-0,63 1 19 18 17 16 15 14 13 12 11 (r 2 = 0,72; prob>f 0,000476) (r 2 = 0,74; prob>f 0,000326, n = 12) 93 94 95 96 97 98 99 100 LM HS / % (r 2 = 0,60; prob>f 0,00293) 93 94 95 96 97 98 99 100 LM HS / % Obr. 10. Korelace podílu absorbancí A 465 a procentuálního zastoupení nížemolekulární frakce (LM HS) ve vzorcích fulvokyselin izolovaných z vod. 4. Radiouhlíkové datování rašelinných huminových látek 4.1. Huminové látky v povrchových vodách Pro stanovení stáří materiálu biologického původu se používá radiouhlíková (radiokarbonová) metoda datování, založená na postupném poklesu počtu atomů izotopu uhlíku 14 C po odumření organismu. Radioaktivní izotop uhlíku 14 C se na Zemi vyskytuje, přestože poločas rozpadu jeho jádra je z hlediska geologických procesů krátký. Je to způsobeno interakcí kosmického záření, především protonů s extrémně vysokou energií, pocházejících z mezihvězdného prostoru, s atomy dusíku v atmosféře za vzniku izotopu 14 C (tzv. kosmogenní produkce). V průměru je celková rychlost produkce radioaktivního izotopu 14 C na Zemi v rovnováze s rychlostí jeho rozpadu, proto relativní 2 koncentrace 14 C v atmosféře a v živých organismech zůstává přibližně konstantní. Vznikající atomy 14 C vstupují do cyklu uhlíku, cirkulují v atmosféře především ve formě oxidu uhličitého ( 14 CO 2 ), který může být asimilován rostlinami při fotosyntéze nebo rozpuštěn ve vodě a cirkulovat ve vodách oceánů (transport z atmosféry do větších hloubek oceánů ovšem vyžaduje stovky let, proto je koncentrace 14 C v hloubce oceánu výrazně nižší než v atmosféře). Poměr izotopů 14 C/ 12 C je obvykle uváděn ve vztahu ke světově uznávanému standardu moderní biosféry, proto se koncentrace 14 C vyjadřuje v procentech moderního standardu uhlíku (pmc). V prvém přiblížení lze stáří vzorku pomocí radiouhlíkového datování stanovit porovnáním poměru 14 C/ 12 C ve sledovaném vzorku s poměrem v moderní biosféře. Izotopu 14 C ve vzorku postupně ubývá, protože atomy 14 C vyzařují částici beta, přičemž se mění na izotop dusíku 14 N. Poločas této přeměny (rozpadu) 14 C je 5 730 roků, s dostatečnou přesností tak lze datovat 2 Relativní koncentrací 14 C rozumíme podíl atomů izotopu 14 C ke všem atomům uhlíku. Jedná se o číslo poměrně malé, protože v atmosféře připadá jeden těžký atom 14 C na více než 1 000 000 000 000 atomů uhlíku 12 C. 19

vzorky do stáří přibližně 10 poločasů rozpadu, tj. cca 50 60 tisíc let. Izotopická frakcionace je výsledkem závislosti rychlosti chemických reakcí a fyzikálních procesů na hmotnosti izotopu. Například fotosyntézy se účastní všechny izotopy uhlíku, pro lehčí atomy uhlíku je však tento proces rychlejší. Proto je poměr 14 C/ 12 C v rostlinách vždy menší než v atmosféře. Tuto skutečnost je třeba vzít při radiouhlíkovém datování v úvahu. Rozsah izotopické frakcionace u fosilních vzorků může být posouzen z poměru 13 C/ 12 C, který v organismu závisí také na izotopické frakcionaci, a protože oba izotopy ( 13 C i 12 C) jsou stabilní, jejich poměr se po smrti organismu nemění. Stanovení poměru 13 C/ 12 C ve vzorku tak umožňuje provést korekci poměru 14 C/ 12 C, neboť u většiny procesů je izotopická frakcionace pro 14 C téměř přesně dvojnásobná než pro 13 C. Nejjednodušší je předpokládat, že poměr 14 C/ 12 C byl v okamžiku odumření organismu stejný jako v moderní biosféře. Tento předpoklad však vždy neodpovídá skutečnosti, proto se při běžném datování používá několika korekcí, nejčastěji zahrnujících izotopické frakcionace, variace atmosférického 14 C v minulosti a u vodních ekosystémů také vliv nádrže (tzv. reservoir effect ). Například vlivem změn toku kosmického záření přicházejícího do atmosféry (v jednotkách procent) se mění relativní poměr radioaktivního uhlíku. Potřebné korekce, nezbytné pro stanovení stáří s vyšší přesností, lze provést z údajů o zastoupení 14 C v minulosti, získaných například z letokruhů stromů. Při tradičním (konvenčním) způsobu stanovení izotopu 14 C se registruje β záření (elektrony), emitované při rozpadu. Nevýhodou tohoto postupu je obtížnější detekce emitovaných nízkoenergetických elektronů a nezbytnost většího množství vzorku (několik gramů až desítek gramů uhlíku) pro analýzu. Uhlík ze vzorku se převádí na CO 2, který se umístí ve stíněné detekční trubici. Jinou možností je detekce β záření pomocí kapalinových scintilačních detektorů, u nichž vyzářené elektrony vyvolávají scintilaci, která se měří pomocí fotonásobiče, nebo proporcionálních detektorů, kdy je počet primárních iontů znásoben sekundární ionizací o několik řádů. Novější metodou měření 14 C je urychlovačová hmotnostní spektrometrie (AMS = Accerelated Mass Spectrometry), u níž stačí k analýze vzorek obsahující desítky mikrogramů až miligram uhlíku. Tím se rozšířily možnosti radiouhlíkového datování i na vzorky ze životního prostředí, často dostupné jen v omezeném množství, například na frakce půdní organické hmoty nebo rozpuštěného uhlíku. V České republice dosud není metoda AMS dostupná, analýzy však lze objednat v některé ze zahraničních laboratoří. Jednou z technik, používaných při 14 C AMS, je spálení vzorku na oxid uhličitý, který se poté redukuje vodíkem na grafit. Redukce, katalyzovaná železem, probíhá v křemenné trubici. Redukovaný uhlík se usazuje na povrchu horkého železa, vznikající vodní pára je odstraňována vymražením. Reakce je ukončena po dvou až třech hodinách a směs Fe/C je lisována do katodového držáku. Katody jsou uloženy v ochranné atmosféře argonu do doby, než je provedeno měření na AMS spektrometru. Průmyslová revoluce způsobila v posledních staletích pokles zastoupení 14 C v atmosféře vlivem spalování fosilních paliv, která izotop 14 C neobsahují a produkovaný CO 2 tak snižuje koncentraci 14 C v atmosféře (tzv. Suessův efekt). Naproti tomu zkoušky termonukleárních zbraní od druhé poloviny 50. let minulého století způsobily rychlý nárůst zastoupení 14 C až na 200 %. Po omezení těchto zkoušek a jejich zákazu se zastoupení 14 C začalo snižovat až na hodnotu cca 10 % nad původní úrovní koncem osmdesátých let. Toto zvýšení o tzv. bombový 14 C umožnilo stanovit v biologickém materiálu velice mladý uhlík a rozšířit využití radiouhlíkového datování například při studiu poměrně rychlých procesů v ekosystému. Výsledky radiouhlíkového datování se obvykle uvádějí v rocích BP (BP = before pre- 20