DETERMINATION OF STRUCTURAL FORMS OF P53 PROTEIN BY FLOW INJECTION ANALYSIS WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION

DETERMINATION OF STRUCTURAL FORMS OF P53 PROTEIN BY FLOW INJECTION ANALYSIS WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION STANOVENÍ STRUKTURNÍCH FOREM PROTEINU P53 POMOCÍ PRŮTOKOVÉ INJEKČNÍ ANALÝZY S ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ Potěšil D. 1,2), Babula P. 1,3), Masařík M. 4), Vojtěšek B. 5), Průša R. 6), Petrlová J. 1), Kizek R. 1) 1) Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika, 2) Katedra analytické chemie, PřF MU v Brně, Kotlářská 2, 611 37 Brno, 3) Ústav přírodních léčiv, FaF VFU Brno, Palackého 1/3, 612 46 Brno, 4) Laboratoř biofyzikální chemie a molekulární onkologie, BFÚ AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno, 5) Základna experimentální onkologie, MOÚ Brno, Žlutý kopec 7, Brno 656 53, 6) Ústav klinické biochemie a pathobiochemie, 2. LF UK Praha, V Úvalu 84, 150 06 Praha. E-mail: weiclav@seznam.cz ABSTRACT In 1993, protein p53 was hailed as the Molecule of the year by Science journal. It is not surprising that nowadays the protein p53 is the most studied object in molecular oncology area. Tetramers of the protein are made at cell stress. Tetramers subsequently bind to DNA and here they regulate proteins synthesis, thereby control reparation process. Structural form of the protein has significant influence on bond between p53 and damaged DNA. Three protein forms (native, denatured and aggregated) were studied by flow injection analysis with electrochemical detection (FIA-ED). The very sensitive method for native p53 form determination was developed; detection limit (LOD) 45.8 amol. FIA-ED technique was applied on study of protein p53 structural changes (formation of denatured and aggregated form). Denatured protein gives higher electrochemical response (protein structure release) and aggregated a smaller one (protein folding) in comparison with native form. Key words: aggregation, denaturation, electrochemical detection, FIA, FIA-ED, p53, p53con, flow injection analysis, p53 structural forms, p53 binding ABSTRAKT V roce 1993 byl časopisem Science vyhlášen protein p53 molekulou roku. Není proto divu, že v současné době je protein p53 nejstudovanějším objektem v oblasti molekulární onkologie. Při buněčném stresu vznikají tetramery proteinu p53, které se váží na DNA a zde regulují

syntézu mnoha proteinů, čímž řídí samotné buněčné reparační procesy. Významný vliv na vazbu proteinu p53 na DNA má strukturní forma proteinu p53. Byly studovány tři strukturní formy proteinu p53 (nativní, denaturovaná a agregovaná) pomocí průtokové injekční analýzy s elektrochemickým detektorem (FIA-ED). Byla vyvinuta velmi sensitivní metoda pro stanovení nativní formy proteinu p53; limit detekce (LOD) 45,8 amol proteinu. Technika FIA-ED byla dále aplikována na studium a rozlišení strukturních změn proteinu p53 (vznik denaturované a agregované formy). Denaturovaný protein p53 poskytoval větší elektrochemickou odezvu (rozvolnění struktury proteinu) a agregovaný protein p53 nižší odezvu (sbalení proteinu) v porovnání s nativní formou proteinu p53. Klíčová slova: agregace, denaturace, elektrochemická detekce, FIA, FIA-ED, p53, p53con, průtoková injekční analýza, strukturní formy p53, vazba p53 ÚVOD Protein p53 je považován za jeden z nejdůležitějších regulátorů buněčného stresu. Protein vzniká translací genu TP53. Množství proteinu p53 v buňce je za běžných, nestresových podmínek udržováno na nízké hladině pomocí degradační dráhy, zahrnující degradaci proteasomem 26S za účasti zpětného regulátoru proteinu MDM2 (mouse double minute 2) [1]. Pokud je buňka vystavena buněčnému stresu, který představuje např. poškození DNA, zablokuje se tato degradační dráha a dojde ke zvýšení jaderné koncentrace p53. Protein se dále posttranslačně upravuje a oligomerizuje na tetramery, které mají vysokou afinitu k DNA, na kterou se následně váží. Protein p53 se může na DNA vázat několika způsoby, především však sekvenčně specifickou vazbou [2]. Tato vazba vzniká mezi centrální doménou proteinu a částí dvoušroubovicové DNA, tzv. p53con [2]. Po vazbě na DNA se protein p53 projevuje jako transkripční faktor. To znamená, že reguluje transkripci cílových genů, souhrnně nazývaných a označovaných jako PIGs (p53 inducible genes). Prozatím bylo popsáno více než 60 cílových genů [3]. Výsledkem regulace jejich exprese je především zástava buněčného cyklu v G 1 fázi [4], reparace DNA [5], případně spuštění programované buněčné smrti (apoptózy) [6]. Svým působením si protein p53 vysloužil přezdívku strážce genomu [1], neboť velkou měrou ve své aktivní tetramerní formě přispívá k opravě poškozeného genomu a zamezení šíření poškozené genetické informace do dceřinných buněk, které by jinak vedlo ke zvýšené proliferaci a vzniku nádorů. Je známo, že u proteinu p53 se objevuje velké množství bodových mutací a delecí části genu TP53. Bodové mutace nemusí bezpodmínečně vést k nefunkčnosti proteinu p53, bylo zjištěno, že záleží na lokalizaci bodové mutace [7]. Bylo ovšem prokázáno, že poškození

genu TP53 je velmi častým důvodem nedostatečné odolnosti buněk vůči poškození, které může vést k replikaci poškozené DNA; statistiky uvádějí, že gen proteinu p53 je postižen bodovou či deleční mutací u více něž 50 % nádorových buněk. V případě rakoviny plic, tvoří mutace proteinu p53 dokonce 70% ze všech případů (Obrázek 1). Mimo mutace genu TP53 může vést k nefunkčnosti proteinu p53 také změna konformace jeho nativní formy. U p53 byla popsána denaturovaná (rozvolněná struktura díky absenci vodíkových vazeb) a agregovaná forma (větší množství monomerních jednotek spojených v jeden celek, agregát). postižený orgán plíce tlusté střevo močový měchýř hlava/krk žaludek jícen mízní uzliny prostata prs játra leukémie mutace p53 70% 65% 61% 60% 45% 44% 30% 30% 30% 25% 10% 0 200 400 600 800 počet případů v tisících Obrázek 1: odhadovaný počet nových případů nádorového bujení na světě za rok a podíl nádorů s mutacemi proteinu v % u jednotlivých nádorových onemocnění (upraveno dle [8]). Seřazeno podle procentuální mutace proteinu p53. V současné době se protein p53, jeho strukturní formy a schopnost vazby na DNA studují převážně gelovou elektroforézou s různými modifikacemi [9,10], ELISA metody [11] a také elektrochemické stacionární metody [12-14]. Na všechny metody je kladem stále větší tlak na zvýšení rychlosti, citlivosti, selektivity a snížení detekčních limitů. Nejinak je tomu i u metod, které hrají klíčovou roli při získávání informací o mechanismu vzniku rakoviny, způsobu působení antikancerostatik a jiných nejen s rakovinou spojených poznatků. Cílem této práce bylo vyvinutí nové metody využívající průtokovou injekční analýzu

s elektrochemických detektorem pro aplikaci na detekci velmi malých množství proteinu p53 a studium jeho strukturních forem, denaturované a agregované. METODIKA Chemikálie Acetonitril pro HPLC byl pořízen od firmy Merck (Darmstadt, Německo). Ostatní chemikálie byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich Chemical Corp. (USA). Všechny roztoky, není-li uvedeno jinak, byly připravovány v ACS deionizované vodě (Sigma Aldrich). Fosfátový pufr (1/15 mol/l) o příslušných ph hodnotách byl míchán z denně připravovaných roztoků hydrogen- a dihydrogenfosforečnanu sodného. Zásobní roztok močoviny o koncentraci 7 mol/l byl uchováván v temnu při 4 C. Lidský protein p53 byl purifikován na Masarykově onkologickém ústavů v Brně z eukaryotického expresního systému hmyzích buněk Sf6 transfekovaných bakulovirovým vektorem [10]. Čistota a koncentrace proteinu byla zjištěna gelovou elektroforézou. Pracovní roztoky proteinu p53 byly připravovány ze zásobního roztoku (0,7 mg/ml) obsahující proti nežádoucí oxidaci proteinu redukční činidlo dithiotreitol (DTT). Zásobní roztok proteinu byl uchováván při 80 C. Přístroje Průtoková injekční analýza s elektrochemickou detekcí Systém průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí (FIA-ED) je složen ze dvou chromatografických pump (Model 582, ESA, USA), směšovače mobilních fází (ESA, USA), regulátoru pulzů (ESA, USA), dávkovacího obtokového kohoutu (ESA, USA), 1 m dlouhé reakční smyčky a osmi-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Detektor obsahuje osm porézních grafitových elektrod (samotná měrná elektroda je konstruována tak, že roztok prochází skrz póry materiálu elektrody), které jsou uloženy ve dvou průtočných analytických komůrkách (Model 6210, ESA, USA). Každá komůrka (blok) obsahuje čtyři indikační elektrody. Na každou indikační elektrodu navíc připadají dvě referentní a dvě pomocné elektrody. Směšovač mobilních fází, regulátor pulzů, obtokový kohout, reakční smyčka a elektrochemický detektor jsou termostatovány (30 C). Vzorek (5 µl) byl injektován manuálně přes dávkovací ventil.

ph metr Pro měření ph byl použit ph metr WTW inolab Level 3 s terminálem Level 3 (Weilheim, Německo), byl řízen počítačem pomocí programu (MultiLab Pilot). Pro měření byla použita elektroda (ph-electrode SenTix, ph 0..14/0..100 C/3mol/l KCl; Weilheim, Německo), která se před každým měřením kalibrovala pomocí sady kalibračních WTW roztoků (Weilheim, Německo). Denaturace proteinu p53 Denaturace proteinu p53 probíhala v prostředí fosfátového pufru (1/15 M; ph 7,0) a jako denaturační agens bylo použito močoviny o různých koncentracích. Denaturace probíhala po 24 hodin při teplotě 20 C a za konstantního nepřetržitého míchání (350 rpm; Thermomixer 5355, Ependorf, Německo). Paralelně se připravovaly i slepé vzorky které neobsahovaly protein p53. Upravené roztoky byly dávkovány přes obtokový kohout (5 µl) na reakční smyčku. Konečná hodnota se získala odečtením signálu slepého vzorku od signálu vzorku. Agregace proteinu p53 Agregace se v této práci dosahovalo působením močoviny v bezfosfátovém prostředí a při teplotě 37 C. Protein byl agregačním podmínkám vystaven po dobu 24 hodin při nepřetržitém míchání (350 rpm; Thermomixer 5355, Ependorf, Německo). VÝSLEDKY A DISKUZE V teoretickém úvodu byla nastíněna funkce proteinu p53 a také význam jeho stanovení a detekce, která by umožnila při rozlišení různých forem proteinu (nativní a denaturované, respektive vázající a nevázající se na DNA) studium vazby p53 na vazebnou sekvenci DNA a dále možnost studia ovlivnění této vazby různými látkami či fyzikálními faktory. V současné době se tyto studie provádí především pomocí gelové elektroforézy a ELISA technik, které jsou však časově náročné [11]. Naproti tomu průtokový systém s elektrochemickou detekcí nabízí velmi rychlou a díky elektrochemickému detektoru také velmi citlivou alternativu zmíněných metod. Prozatím byl ovšem používán pouze pro stanovení nízkomolekulárních látek (molekulová hmotnost přibližně do 10 kda), a proto je lidský protein p53 s 43 kda první vysokomolekulární látkou, která byla v průtokovém systému s elektrochemickým detektorem studována.

Optimalizace metody Složení mobilní fáze Pro studium nativního proteinu je potřebné zajistit vhodné vodné prostředí, aby nedocházelo např. k denaturačním či jiným strukturním změnám. Z tohoto důvodu byl použit pro průtokovou analýzu 1/15 M fosfátový pufr (ph 7,0) jako součást mobilní fáze. V tomto definovaném prostředí byly získány velmi dobře vyvinuté elektrochemické signály proteinu p53 o koncentraci 7 µg/ml. Bylo testováno, zda přítomnost organické složky mobilní fáze - acetonitrilu (ACN) ovlivní proudovou odpověď detektoru. Je známo, že ACN je často používanou součástí mobilní fáze při separaci na kolonách, proto je důležité znát jeho vliv na elektrodový děj probíhající v elektrochemickém průtokovém detektoru. Z tohoto důvodu byl hledán vhodný poměr fosfátového pufru a ACN. Nejlépe vyvinutý signál o nejvyšší proudové intenzitě (výška píku) byl získán při použití mobilní fáze složené z 98 % fosfátového pufru a 2 % acetonitrilu (při čistém fosfátu byl signál přibližně 96%; při vyšších koncentracích ACN lineárně klesal až na 80% při 10% ACN). Negativní vliv vyšší koncentrace ACN na studovaný signál proteinu je pravděpodobně způsoben změnou struktury p53, případně negativním vlivem organické složky na transport látky k detektoru nebo na vlastní detekci p53 na povrchu pracovní elektrody. Průtok mobilní fáze Významným parametrem ovlivňující charakter odezvy ve FIA-ED systému je celkový průtok mobilní fáze. Při studiu proteinu p53 se testoval průtok mobilní fáze v rozsahu od 0,1 do 0,8 ml/min. Z důvodu sledování možného rozmývání zóny analytu byla vyhodnocována nejen výška, ale i plocha a šířka získaného signálu. Maximální výšky i plochy píku bylo dosaženo při průtoku 0,5 ml/min (závislost pro výšku je na Obrázku 2A). Nárůst plochy píku nebyl při nízkých hodnotách průtoku tak razantní, jak je v případě výšky vidět na obrázku 2A, naopak při vyšším průtoku se plocha snižovala se zápornější směrnicí než-li výška (není ukázáno). Šířka píku se snižovala spolu se zvyšující se rychlostí průtoku v celém testovaném rozmezí průtoku, nejvyšší pokles byl zaznamenán při nižších hodnotách průtoku (není ukázáno). To nasvědčuje tomu, že s rostoucím průtokem dochází ke zmenšování zóny analytu, ale na druhou stranu také dochází vlivem zkracování času, kdy je roztok analytu v dostatečně blízkém okolí elektrody, k menší prekoncentraci proteinu na povrchu pracovních elektrod, což má za následek oxidaci menšího množství molekul proteinu a tedy i nižší analytický signál. Jako optimální byl vybrán průtok mobilní fáze 0,5 ml/min.

A B C 100 100 proudová odezva (µa) 100 [900 mv] 60 [800 mv] 2 µa [700 mv] [600 mv] [500 mv] [400 mv] [300 mv] 1 min 20 [200 mv] 0 0,3 0,6 0,9 průtok mobilní fáze (ml/min) relativní kumulativní proudová odezva (%) nekumulativní kumulativní 50 0 100 400 700 1000 aplikovaný potenciál (mv) 50 0 relativní proudová odezva (%) Obrázek 2: A: analytický signál elektrochemického detektoru v závislosti na velikosti průtoku mobilní fáze. B: ukázka signálů proteinu p53 v závislosti na jeho koncentraci; průtok 0,5 ml/min. C: závislost relativní proudové odezvy a relativní kumulativní proudové odezvy na potenciálu elektrody (hydrodynamické voltampérogramy); průtok 0,5 ml/min. Společné podmínky: koncentrace proteinu 7 µg/ml; nástřik vzorku 5 µl; mobilní fáze 1/15 M fosfátový pufr (ph 7.0):acetonitril, 98:2; teplota detektoru a reakční smyčky 30 C. Potenciál pracovních elektrod Dále byl studován vliv velikosti potenciálu pracovní elektrody na intenzitu odezvy elektrochemického detektoru. Pro nalezení maximální odpovědi byl na grafitové porézní elektrody detektoru vkládán potenciál 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 a 900 mv. Proudová odpověď na jednotlivých elektrodách detektoru je ukázána na Obrázku 2B. Pro volbu vhodného analytického potenciálu se vychází z hydrodynamického voltampérogramu (Obrázek 2C), který se sestrojí vynesením závislosti relativní proudové odezvy nebo relativní kumulativní proudové odezvy na potenciálu elektrody. Jako nejvhodnější se volí potenciál z oblasti největšího proudového rozdílu a nejmenšího potenciálového rozdílu. Tomuto kriteriu nejlépe vyhovoval potenciál 900 mv vkládaný na poslední pracovní elektrodu detektoru. Kalibrační závislost proteinu p53 V naší další práci jsme studovali závislost proteinu p53 na koncentraci při optimálních FIA-ED podmínkách. Pro sestrojení závislosti byla ze zásobního roztoku proteinu p53 (c = 0,7 mg/ml) připravena postupným ředěním ACS deionizovanou vodou sada pěti roztoků proteinu p53 o koncentracích 7; 3,5; 1,75; 0,87 a 0,437 µg/ml. Závislost proudové odezvy elektrochemického detektoru na koncentraci byla striktně lineární (R 2 = 0,9998; y = 1,1682x

0,0101; Obrázek 3). Na insetu Obrázku 3 jsou ukázány signály (detekční potenciál 900 mv) při rozdílných koncentracích p53. Limit detekce (limit detekce = 3 hodnota šumu koncentrace p53 ; šum detektoru 0,3 na; počítáno z nejnižší hodnoty výška signálu kalibračního grafu) proteinu p53 byl roven 0,767 ng/ml, neboli při nástřiku vzorku 5 µl 3,84 pg respektive 45,8 amol proteinu p53. Pro porovnání, mez detekce gelové elektroforézy bývá v desetinách µg proteinu nanášeného na gel. Ze získaných výsledků jasně vyplývá, že námi vypracovaná metoda je rychlá a velmi senzitivní pro analýzu velmi malého množství vzorku. Obrázek 3: kalibrační závislost proudové odezvy na koncentraci proteinu. Průtok mobilní fáze (fosfát:acetonitril 98:2) 0,5ml/min; nástřik vzorku 5µl; potenciál ; teplota 30 C 9 y = 1,1682x - 0,0101 Proudová odezva (µα) 6 3 R 2 = 0,9998 2 µa 1 min 0 0 2 4 6 Koncentrace p53 (µg/ml) Studium strukturních změn proteinu p53 Studium strukturních změn proteinů má značný biologický význam. Porovnávali jsme tři rozdílné formy proteinu p53, nativní, denaturovanou a agregovanou. Denaturovaná i agregovaná forma proteinu p53 je neaktivní, neboť dochází ke změně struktury proteinu [15]. Studium různých forem proteinu se běžně provádí většinou pomocí gelové elektroforézy [16], ale je také možné využívat fluorescenčních metod [15]. Denaturace proteinu Proteiny jsou v nativním stavu udržovány v konformaci pomocí nekovalentních vazeb a iontových interakcí. Při denaturaci proteinů dochází účinkem tepla, chemické látky (např. soli) nebo vlivem ph ke změně rovnováhy těchto nevazebných interakcí, která vede ke změně

sekundární struktury [17]. Denaturovaná sekundární struktura je díky absenci většiny intramolekulárních interakcí mnohem méně uspořádaná než nativní forma proteinu [18]. V denaturované formě se protein stává biologicky neaktivním. Denaturace centrální domény proteinu p53 (p53cd, aminokyseliny 102 až 292) byla studována v práci [15]. Míra denaturace zde byla sledována spektrofotometricky a závislost míry denaturace proteinu byla testována v závislosti na koncentraci močoviny, která za specifických podmínek způsobuje denaturaci proteinu. V této práci bylo testováno, zda-li se projeví denaturace močovinou na velikosti signálu celého proteinu p53 (fl-p53). Ve studii denaturačních změn u centrální domény proteinu p53 [15] byl testován vliv koncentrace močoviny 0 až 6 mol/l. Získaná závislost měla sigmoidní charakter (Obrázek 4B) a maximum podílu denaturované formy proteinu bylo pozorováno při koncentraci močoviny přibližně kolem 4 mol/l. Z tohoto důvodu byla pro účel zjištění vlivu denaturace na elektrochemickou odezvu proteinu p53 vybrána koncentrace močoviny 4 mol/l. Denaturace se testovala pro dvě koncentrace proteinu p53 7 µg/ml a 3,5 µg/ml. Protein p53 byl denaturován močovinou ve 1/15 M fosfátovém pufru o ph 7,0 po 24 hodin při 20 C a 350 rpm. Získaný denaturovaný protein p53 byl studován pomocí optimalizované metody FIA-ED. Ukázka získaných signálů je na obrázku 4A, kde je záznam jednoho FIA-ED stanovení (první tři signály patří nativní formě proteinu p53, která nebyla podrobena denaturaci a další dva jsou signály roztoku po denaturaci; signál slepého vzorku byl přibližně 2 % ze signálu denaturovaného proteinu o koncentraci 7 mg/ml). Z obrázku je patrné, že signál denaturovaného proteinu je přibližně třikrát větší než signál nedenaturovaného a to u obou studovaných koncentrací (7 a 3,5 µg/ml) proteinu. Tento nárůst souvisí pravděpodobně v samotném způsobu vzniku oxidačního signálu, za který u proteinu p53 na elektrochemickém detektoru pravděpodobně odpovídá oxidace aminokyselinových zbytků proteinu p53, konkrétně tyrosinu a tryptofanu. Molekula proteinu přitom obsahuje jen 9 molekul tyrosinu a 4 molekuly tryptofanu z celkového počtu 363 aminokyselin [19], a proto se dá očekávat, že proudový signál vznikající oxidací těchto aminokyselin bude velmi závislý na jejich přístupnosti na povrch elektrody. Denaturovaná sekundární struktura proteinu p53 tedy pravděpodobně umožňuje lepší přístup tyrosinu a tryptofanu k povrchu elektrody a tím i přibližně trojnásobné zvýšení elektrochemické odezvy na elektrochemickém detektoru.

A denaturovaný protein p53 nativní p53 3.5 µg/ml 7 µg/ml 7 µg/ml 3.5 µg/ml [900 mv] 7 µg/ml B procenta denaturované formy (%) 100 50 0 0 2 4 6 koncentrace močoviny (mol/l) [800 mv] [700 mv] [600 mv] [500 mv] [400 mv] [300 mv] [200 mv] 4 µa C relativní proudová odezva (%) 100 50 0 0 2 4 6 1 min koncentrace močoviny (mol/l) Obrázek 4: A: Signály nativního a denaturovaného proteinu p53 při dvou koncentracích proteinu 7 a 3,5 µg/ml. První tři signály patří nativní formě proteinu p53, která nebyla podrobena denaturaci a další dva jsou signály roztoku po denaturaci. Signál blanku je zanedbatelný (přibližně 2 % ze signálu denaturovaného proteinu o koncentraci 7 µg/ml). B: závislost procentuelního zastoupení denaturované formy na koncentraci močoviny. Sestaveno dle [15] C: naměřená závislost relativní proudové odezvy ED v závislosti na koncentraci močoviny. Odečítáno z poslední elektrody, na kterou byl aplikován potenciál 900mV. Denaturační podmínky: protein byl denaturován 4M močovinou v přítomnosti fosfátového pufru při teplotě 20 C po 24 hodin. Závislost denaturace na koncentraci močoviny Po zjištění, že je významný rozdíl elektrochemického chování denaturované a nativní formy proteinu p53 (fl-p53) byla proměřena také závislost denaturačních změn v závislosti na koncentraci močoviny. Pro experiment se připravilo 6 roztoků o totožné koncentraci proteinu (7 µg/ml) a koncentraci močoviny 1, 2, 3, 4, 5 a 6 mol/l. Získaná závislost procentuelní relativní výšky píku na koncentraci močoviny je uvedena na Obrázku 4C. Minimální hodnota na ose y při nulové koncentraci močoviny odpovídá nedenaturované, maximální hodnoty (při koncentraci močoviny 4, 5 a 6 mol/l) naopak denaturované formě. Jak je vidět, námi naměřená závislost je podobná denaturační křivce v práci [15]; porovnej obrázek 4B a 4C. Obě křivky dosahují maxima při koncentraci močoviny 4 mol/l, rozdíl je pouze v první části křivky, kdy v případě p53cd (obrázek 4B) je nárůst denaturace záležitostí pouze úzkého pásu koncentrací močoviny, kdežto u fl-p53 se denaturace projevuje již při nejnižší koncentraci močoviny. Toto může být způsobeno např.

větší náchylností fl-p53 k denaturaci močovinou, ale mohou také plynout z rozdílnosti použitých detekčních metod. V práci [15] (Obrázek 4B) se denaturace určuje na základě měření fluorescence, která má pro denaturovanou a nativní formu jinou závislost intenzity fluorescence tryptofanových reziduí na vlnové délce excitace. V této naší práci studujeme denaturaci proteinu p53 v závislosti na výšce oxidačního signálu proteinu, která je, jak již bylo zmíněno, pravděpodobně velmi silně závislá na prostorovém uspořádání proteinu p53. Získaná závislost (Obrázek 4C) tedy naznačuje, že s pomocí optimalizované metody FIA-ED je možné rozlišit nativní a denaturovanou formu proteinu fl-p53. Agregace proteinu Po prokázání možnosti rozlišení nativní a denaturované formy proteinu p53 na elektrochemickém detektoru v průtokovém systému (FIA-ED), se dalo očekávat, že bude možné rozlišit i další formy proteinu p53. Proto jsme se v naší práci dále zabývali rozlišením agregované formy p53 pomocí optimalizované FIA-ED metody. Agregát představuje shluk monomerních jednotek proteinu navzájem propojených intermolekulárními vazbami. V případě centrální domény proteinu p53 jde konkrétně o prstencovité, zrnité nebo fibrilární struktury v závislosti na agregačních podmínkách a času agregace [20]. Ve zde již citovaných pracích byly tvorba agregátů centrální domény p53 (p53cd) zajištěna zvýšenou teplotou, případně tlakem [20] a nebo mírnějšími denaturačními podmínkami (koncentrace močoviny 1 až 2 mol/l, přítomnost EDTA vyvazující atom zinku), nebo působením močovinou bez přítomnosti fosfátového pufru při teplotě 37 C [15]. V této naší práci, kde bylo studováno chování celého proteinu p53 (fl-p53), bylo na protein působeno močovinou o koncentraci v intervalu 1 až 6 mol/l, bez přítomnosti fosfátového pufru a při teplotě 37 C. Protein byl vystaven popsaným podmínkám po 24 hodin. relativní proudová odezva (%) 100 50 0 0 2 4 6 koncentrace močoviny (mol/l) Obrázek 5: závislost relativní proudové odezvy ED v závislosti na koncentraci močoviny. Pokles signálu zřejmě souvisí tvorbou shluků monomerních jednotek proteinu, u

kterých je horší přístup oxidovatelných aminokyselin k povrchu pracovní grafitové elektrody. Podmínky agregace: koncentrace proteinu 7 µg/ml, teplota 37 C, doba indukce 24 hodin. Získanou závislost výšky píku proteinu p53 na koncentraci močoviny ukazuje obrázek 5. Jak je vidět, naměřená závislost je sigmoidního charakteru a ve své první polovině klesá až na téměř 50 % výšky signálu neagregovaného proteinu (koncentrace močoviny 3 mol/l). Pokles hodnoty oxidačního signálu proteinu je zřejmě způsoben charakterem struktur detekovaných na elektrochemickém detektoru. Ty jsou objemnější než samotný monomer (první hodnota je výška signálu neagregovaného proteinu). Tím dochází k zmenšení počtu molekul proteinu, které se dostanou do dostatečné blízkosti k elektrodě a u kterých dojde k oxidaci aminokyselinových zbytků. To má za následek menší proudovou odezvu. V práci [20] jsou popsány agregáty centrální domény proteinu p53. Jejich tvar je závislý na délce působení a charakteru daných agregačních podmínek (teplota, tlak). Tvar agregátů byl prstencový (indukovaný vyšším tlakem; po 24 hodinách), granulovitý (indukce vyšší teplotou; 24 hodin) nebo fibrilární (indukované tlakem; po jednom měsíci). Při našem experimentu by teoreticky mohly vznikat objekty podobné granulovitým útvarům vzhledem k charakteru agregačních podmínek a časovému intervalu expozice proteinu. Na Obrázku 5 je možné si také povšimnout mírného nárůstu elektrochemické odezvy. Tato situace nastává při vyšších koncentracích močoviny (3 mol/l a výše), kdy může hypoteticky docházet k více rozdílným dějům ovlivňující oxidaci tyrosinových a tryptofanových reziduí. Teoreticky možné je vysvětlení, že se při vyšších koncentracích močoviny v nepřítomnosti fosfátového pufru a při vyšší teplotě tvoří v prvé řadě agregáty proteinu fl-p53, ovšem delším působením vyšších koncentrací močoviny následně dochází k povrchové denaturaci (rozrušení povrchové struktury) agregátu (schematicky zobrazeno na Obrázku 6). Toto vysvětlení by odpovídalo zvyšující se proudové odezvě, která ovšem ani při nejvyšších koncentrací močoviny nedosahuje hodnot výšek nativního proteinu. agregace vyšší koncentrací močoviny agregace vyšší koncentrací močoviny po delší dobu neinteragující monomery p53 agregát agregát s porušenými postranními řetězci

Obrázek 6: hypotetický model vysvětlující agregační závislost na koncentraci močoviny. Na začátku máme monomerní jednotky proteinu p53. Účinkem vysoké koncentrace močoviny bez přítomnosti fosfátového pufru za vyšší teploty (37 C) dochází nejdříve k seskupování monomerních jednotek do agregátů, delším účinkem však dochází k narušování postranních řetězců se zachováním agregované formy. Tato forma poté poskytuje vyšší signál než-li agregovaná forma, ovšem díky stabilnímu agregátu nedostaneme natolik vysoký signál jako v případě denaturace. ZÁVĚR Protein p53 je v posledních několika dekádách velice studovanou molekulou díky svému výjimečnému antiproliferativnímu chování, díky kterému je stále zvažován jako marker výskytu rakovinového onemocnění. Vazbou na DNA reguluje expresi mnoha proteinů a brání tak vzniku nádorového bujení. Velkou roli při jeho aktivitě hraje jeho struktura. V této práci byla optimalizována metoda pro stanovení proteinu p53 (limit detekce 45,8 amol p53), která byla dále aplikována na studium strukturních forem (nativní, denaturovaná a agregovaná) p53. Bylo zjištěno, že denaturovaná forma poskytuje vyšší signál než nativní a agregovaná naopak menší. Poděkování Příspěvek vznikl za podpory grantů FRVŠ 164/2004, IGA MZLU 3/2004, GAČR č. 525/04/P132, IGA FaF VFU IG342012. LITERATURA [1] D.P. Lane, Nature 385 (1992). [2] W.S. El-Deiry, S.E. Kern, J.A. Pietenpol, K.W. Kinzler, B. Vogelstein, Nat. Genet. 1 (1992) 45. [3] J. Šmardová, J. Šmarda, J. Koptíková, Biol. Listy 69 (2004) 191. [4] C.J. Sherr, Science 274 (1996) 1672. [5] M.L. Smith, I.T. Chen, Q.M. Zhan, I.S. Bae, C.Y. Chen, T.M. Gilmer, M.B. Kastan, P.M. O'Connor, A.J. Fornace, Science 266 (1994). [6] S. Bates, K.H. Vousden, Cell. Mol. Life. Sci. 55 (1999) 28. [7] P. Hainaut, T. Soussi, B. Shomer, M. Hollstein, M. Greenblatt, E. Hovig, C.C. Harris, R. Montesano, Nucleic Acids Res. 25 (1997). [8] V. Brázda, E. Paleček, Biol. Listy 64 (1999) 161.

[9] S. Bosari, A. Marchetti, F. Buttiatta, D. Graziani, G. Borsani, M. Loda, G. Bevilacqua, G. Coggi, Diagn. Mol. Pathol. 4 (1995) 249. [10] V. Brázda, J. Paleček, S. Pospíšilová, B. Vojtěšek, E. Paleček, Biochem. Bioph. Res. Co. 267 (2000) 934. [11] E. Jagelská, V. Brázda, S. Pospíšilová, B. Vojtěšek, E. Paleček, J. Immunol. Methods 267 (2002) 227. [12] M. Brázdová, R. Kizek, L. Havran, E. Paleček, Bioelectrochemistry 55 (2002) 115. [13] R. Kizek, L. Trnková, E. Paleček, Anal. Chem. 77 (2001) 4801. [14] L. Trnková, R. Kizek, J. Vacek, Bioelectrochemistry 56 (2002) 57. [15] A.N. Bullock, J. Henckel, B.S. DeDecker, C.M. Johnson, P.V. Nikolova, M.R. Proctor, D.P. Lane, A.R. Fersht, P. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997). [16] R.M. Wartell, S. Hosseini, S. Powell, J. Zhu, J. Chromatogr. A 806 (1998). [17] D. Voet, J.G. Voet, Biochemie, Victoria Publishing, Praha, 1995. [18] C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern, Biochemistry, San Francisco, 2000. [19] in. [20] D. Ishimaru, L.R. Andrade, L.S.P. Teixeira, P.A. Quesado, L.M. Maiolino, P.M. Lopez, Y. Cordeiro, L.T. Costa, W.M. Heckl, G. Weissmüller, D. Foguel, J.L. Silva, Biochemistry 42 (2003) 9022.