Metodika testování odolnosti lokálních odrůd jádrovin k patogenu bakteriální spály růžovitých (Erwinia amylovora)

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o. Metodika testování odolnosti lokálních odrůd jádrovin k patogenu bakteriální spály růžovitých (Erwinia amylovora) Josef Korba, Jana Šillerová, František Paprštein, Jiří Sedlák CERTIFIKOVANÁ METODIKA 2014

Metodika testování odolnosti lokálních odrůd jádrovin k patogenu bakteriální spály růžovitých (Erwinia amylovora) Josef KORBA, Jana ŠILLEROVÁ, František PAPRŠTEIN, Jiří SEDLÁK CERTIFIKOVANÁ METODIKA Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o. 2014 1

Autoři: Ing. Josef Korba, PharmDr. Jana Šillerová VÚRV, v.v.i., Praha Ing. František Paprštein, CSc., Ing. Jiří Sedlák, Ph.D. VŠÚO Holovousy s.r.o. Název: Metodika testování odolnosti lokálních odrůd jádrovin k patogenu bakteriální spály růžovitých (Erwinia amylovora) Vydal: Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o. Holovousy 1, 508 01 Hořice v Podkrkonoší Vyšlo v roce: 2014 Vydáno bez jazykové úpravy. Kontakt na vedoucího autorského kolektivu: vsslany@seznam.cz Oponenti: prof. Ing. Vojtěch Řezníček, CSc., ZF MENDELU Brno, Ústav šlechtění a množení zahradnických rostlin Ing. Jaroslav Horký, CSc., ÚKZÚZ, Brno, odbor diagnostiky Olomouc Autoři fotografií: Ing. F. Paprštein, CSc., Ing. Jiří Sedlák, Ph.D. Metodika byla zpracována jako výstup z výsledků projektu QH 91148 Výzkum stupně odolnosti lokálních odrůd jádrovin ke spále růžovitých a zefektivnění testování využitím biotechnologických metod za finanční účasti MZe ČR. Využito bylo rovněž infrastruktury projektu CZ1.05/2.1.00/03.0116. Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o., 2014 ISBN: 978-80-87030-29-5 ISBN: 978-80-7427-156-4 (VŠÚO Holovousy s.r.o.) (VÚRV, v.v.i., Praha) 2

Obsah Souhrn 4 Abstract 5 Úvod 6 I. CÍL METODIKY 7 II. VLASTNÍ POPIS METODIKY 7 1/ Charakteristika bakterie Erwinia amylovora 7 2/ Infekční cyklus patogena 7 3/ Podmínky šíření infekce 8 4/ Symptomy onemocnění 9 5/ Předpovědní systémy potenciální aktivity patogena 10 6/ Rezistence 10 7/ Ověření virulence izolátů bakterie Erwinia amylovora 10 8/ Množení odrůd jádrovin kulturami in vitro 11 9/ Testování odolnosti odrůd jádrovin pomocí umělé inokulace 14 10/ Rezistence lokálních odrůd jádrovin výsledky 15 11/ Popis vybraných spále odolnějších odrůd jádrovin 18 III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ 19 IV. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY 20 V. EKONOMICKÉ ASPEKTY 20 VI. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY 21 VII. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE 21 VIII. OSVĚDČENÍ ÚKZÚZ 050585/2014 o uznání uplatněné metodiky 23 3

Souhrn Bakteriální spála růžovitých (syn. spála růžovitých rostlin; bakteriální spála jabloňovitých) je celosvětově považována za nejdestruktivnější bakteriální onemocnění rostlin z čeledi růžovitých. Pro pěstitele představuje spála jabloní a hrušní velké ekonomické ztráty. Patogenem je bakterie Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al., která podléhá karanténním opatřením podle zákona o rostlinolékařské péči Sb. zákonů 326/2004 a pozdějších předpisů (vyhláška 382/2011 Sb.). V metodice jsou shrnuty poznatky o množení lokálních odrůd jabloně a hrušně v podmínkách in vitro, o výběru vhodné metody umělé inokulace explantátových kultur virulentními izoláty bakterie Erwinia amylovora, o testování vybraných odrůd v podmínkách in vitro a v technických izolátorech v karanténních podmínkách blížících se přírodním. 4

Abstract Fire blight (also written fireblight) is considered to be the most destructive bacterial disease of the family Rosaceae worldwide. Fire blight presents big economic losses for growers of apple and pear. It is caused by Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. This bacterium is subjected to quarantine measures according to the Act on Phytosanitary Care No. 326/2004 Coll., and the later amendments (regulation 382/2011 Coll.). Newly obtained knowledge on propagation of landraces and older cultivars of apple and pear in in vitro conditions, on selection of suitable inoculation method by Erwinia amylovora virulent isolates for tissue culture conditions, on in vitro cultivar testing and testing in insulated screen-houses in quarantine conditions similar to field environment is summarized in the methodology. 5

ÚVOD Bakteriální spála růžovitých (syn. spála růžovitých rostlin; bakteriální spála jabloňovitých) je celosvětově považována za nejdestruktivnější bakteriální onemocnění rostlin z čeledi růžovitých. Pro pěstitele jabloní a hrušní představuje spála velké riziko ekonomických ztrát hlavně v oblastech s vhodnými podmínkami pro šíření patogena a při odrůdové skladbě náchylných odrůd jádrovin. Celosvětově jsou ztráty v pěstitelských systémech odhadovány v řádu desítek miliónů dolarů. Novodobé šlechtitelské programy se snaží zaměřit na kombinaci vysoké kvality plodů a rezistenci vůči třem nejdůležitějším patogenům (strupovitost, padlí, spála). Výběr vhodných rodičovských kombinací pro rezistentní šlechtění dává předpoklad pro vyšlechtění nových odrůd, u kterých je omezen výskyt a šíření chorob. Při hledání genetických zdrojů pro šlechtitelské programy v posledním desetiletí se pozornost soustřeďuje na staré a lokální odrůdy. Dalším neméně důležitým hlediskem je zachování druhové rozmanitosti. Lokální odrůdy mají význam krajinotvorný a estetický. Uchovaní starých a lokálních odrůd pro další generace je součástí našeho kulturního dědictví. Zájem o staré a lokální odrůdy stoupá nejen v ČR, ale i v okolních zemích. Tyto odrůdy se vyvíjely po velmi dlouhou dobu působením místních půdně-klimatických přírodních podmínek jen s částečným zásahem člověka. Neprošly profesionálním procesem šlechtění. V těchto podmínkách jsou značně odolné běžným chorobám a škůdcům a vykazují výnosovou stabilitu. Nicméně hladina rezistence lokálních odrůd vůči patogenu bakteriální spály růžovitých nebyla známa. Ve výsadbách nebyl systematicky sledován výskyt přirozené infekce, a ani výskyt bakterie Erwinia amylovora v epifytické mikroflóře. Při vhodných podmínkách pro rozvoj epidemie bakteriální spály tak může docházet k nepředvídatelnému šíření virulentního inokula do produkčních sadů. Patogenem bakteriální spály je bakterie Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al., která podléhá karanténním opatřením podle zákona o rostlinolékařské péči Sb. zákonů 326/2004 o omezování výskytu, šíření a působení škodlivých organismů a poruch a snižování jejich škodlivosti využitím přímých i nepřímých metod ochrany s přihlédnutím k ochraně zdraví lidí, zvířat, volně žijících živočichů a životního prostředí a Sb. zákonů 215/2008 o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů ve znění pozdějších předpisů (Sb. zákonů 382/2011). Bakterie Erwinia amylovora způsobuje nekrotickou destrukci rostlin z čeledi růžovitých (podčeleď jabloňovitých) (Klement et al. 1990, Kůdela 2002, Korba a Šillerová 2010). Patogen má schopnost přežívat z jedné generace do druhé v korových pletivech hostitelských rostlin, rychle se množí a za vhodných klimatických podmínek snadno napadá květy a mladé výhony. Dochází ke snížení výnosů ovoce a v případě náchylných odrůd k odumírání celých rostlin (Zwet a Beer 1995). Pro uplatnění své invazivity na našem území má patogen velmi dobré podmínky velké množství náchylných hostitelských rostlin a vhodné klimatické podmínky. Dochází ke ztrátám v produkčních sadech a zahradách menších pěstitelů. Došlo i k významným ztrátám ve šlechtitelských výsadbách hrušní (Blažek 1999) a přímému ohrožení genofondu ostatních citlivých ovocných druhů. S proniknutím patogena bakteriální spály na naše území (Kůdela 1988) a jeho rychlým šířením (v roce 1991 objeven výskyt ve středočeské a severočeské oblasti; v roce 1996 byla spála zjištěna na severní Moravě, dnes je rozšířena po celém území ČR) bylo nutné přijmout řadu opatření. Karanténní opatření namířená proti průniku patogena na naše území selhala. Spektrum dostupných baktericidních látek je ve srovnání s širokou škálou účinných fungicidů a zoocidů velmi úzké. Účinnost těchto látek je nedostatečná, zatěžují životní prostředí a z ekonomického hlediska je navíc tento způsob ochrany nákladný. Antibiotika nejsou v Evropě povolena z důvodu rizika vzniku rezistentních kmenů bakterie Erwinia amylovora k antibiotikům, 6

hlavně ke streptomycinu. V boji se spálou růžovitých jsou proto přijímána opatření zaměřená na zamezení dalšího šíření patogena do dosud nenapadených výsadeb (zejména likvidace napadených stromů a částí stromů) s cílem minimalizace ekonomických a ekologických škod. Do roku 1992 nebyly v ČR žádné zkušenosti s reakcí u nás pěstovaných odrůd a hostitelských rostlin z čeledi růžovitých na virulentní kmeny bakterie Erwinia amylovora. Navíc se literární prameny u odrůd světového sortimentu rozcházejí s výsledky našich pokusů a se zkušenostmi našich pěstitelů. Z tohoto důvodu jsou odrůdy a novošlechtění českého původu testovány na hladinu rezistence/náchylnosti k patogenu v porovnání se světovými standardy. Pro testování odolnosti lokálních odrůd jádrovin vůči spále růžovitých pomocí umělé infekce mají velký potenciál využití in vitro kultury (Pinet-Leblay et al. 1996, Hevesi et al. 2002, Hanke a Geider 2002). Množení kulturami in vitro je moderní způsob produkce rostlinného materiálu. Za podmínky nalezení vhodných typů kultivačních médií a kombinace fytohormonů regulátorů růstu cytokininů, auxinů atd. lze těmito postupy namnožit velkou část druhů a odrůd ovocných plodin. Výhodou oproti klasickým školkařským metodám je rychlá a celoroční produkce vybraných odrůd nebo genotypů na menší ploše (Sedlák a Paprštein 2009) jako výchozího rostlinného materiálu pro testování. I. CÍL METODIKY Cílem této metodiky bylo nalezení metod odběru, sterilizace a namnožení in vitro kultur starých a lokálních odrůd jádrovin, příprava vhodného typu in vitro explantátu pro testování rezistence k bakterii Erwinia amylovora, výběr vhodné metody umělé inokulace a otestování vybraných odrůd in vitro i in vivo na náchylnost/rezistenci k patogenu bakteriální spály růžovitých rostlin. Metodika je výsledkem řešení výzkumného projektu QH 91148 Národní agentury pro zemědělský výzkum MZe ČR. II. VLASTNÍ POPIS METODIKY 1/ Charakteristika bakterie Erwinia amylovora Bakterie Erwinia amylovora je jednobuněčný prokaryotický organismus patřící do říše Bacteria, třídy Gammaproteobacteria, řádu Enterobacteriales, čeledi Enterobacteriaceae, rodu Erwinia Jsou to rovné tyčinky o velikosti 1,1 1,6 x 0,6 0,9 µm, gramnegativní, bičíkaté, fakultativně anaerobní, nesporulující. Bakterie Erwinia amylovora roste v teplotním rozpětí od 3 5 C do 37 C. Optimální teplota je 25 27 C. Bakterie je fakultativně anaerobní, oxidáza negativní a kataláza pozitivní. Mechanismus narušení infikovaných pletiv rostlin podčeledi Maloideae není zcela objasněn. Nebyla prokázána žádná aktivita pektolytických, celulolytických ani xylolytických enzymů. 2/ Infekční cyklus patogena Brzy na jaře v době rašení pupenů se bakterie Erwinia amylovora přežívající v zimních ložiscích nekrotických hostitelských korových pletiv v hypobiotickém stavu dokáže namnožit a ve formě lepkavého bělavého slizu se protlačí na povrch rostlin. Odsud se hmyzem, větrem, deštěm, kontaminovaným pylem a dalšími vektory roznáší do květů a na vyrašené letorosty. Na povrchu květu a v květu bakterie žije po nějakou dobu epifyticky na blizně a množí se. Zvlášť vhodné prostředí pro namnožení patogena je v nektaru nacházejícím se v květní číšce. 7

Průměrná denní teplota se musí pohybovat kolem 16 C a výše. Přenosem z květu na květ v období kvetení se inicializuje fáze květové spály v sadech. Dovnitř květů pronikají bakterie přes nektarové žlázy a poranění. Symptomy onemocnění se projevují po 5 až 30 dnech v závislosti na denních teplotách, četnosti a intenzitě dešťových srážek. Mladé vyvíjející se plody jsou relativně rezistentní. Velmi náchylným orgánem jsou vyrašené letorosty zejména ve fázi prodlužovacího růstu. Po odkvětu se bakterie může šířit vektory po sadu a dovnitř rostliny pronikají jak přirozenými otvory (hydatody, průduchy), tak různými poraněními. Zvláště nebezpečné jsou kroupy a větrné deště, protože dochází i k ovlhčení listů, a tím i k lepším podmínkám pro následné množení bakteriálních buněk. Po průniku bakterie do vnitřních pletiv se bakterie množí v mezibuněčných prostorech. Okolní napadené buňky plasmolyzují a nekrotizují. Bakterie se velmi intenzivně množí při teplotách 24 29 C. Při stejné teplotě se rychle dělí i vodivá pletiva letorostů. Pletiva v této fázi mají vysoký podíl vody. Bakterie se rychle šíří, a to jak mezibuněčnými prostory parenchymatických korových pletiv a floémem, tak i xylémem. Charakteristickým příznakem napadení letorostů je hákovitý ohyb jejich vrcholů. Výhony a kosterní větve mohou být infikovány jednak průnikem bakterie přes květy, květní stopky a brachyblasty, a jednak přes letorosty. Infekce se může zastavit nebo pokračovat až do kmene. Pokud obepne léze výhon, uschne vrcholová část výhonu. Pokud infekce zasáhne kmen stromu, je tento následně velmi oslaben nebo celý odumírá. Květy i listy po napadení zůstávají na stromě viset. Zdrojem nákazy pro další vegetaci jsou neodstraněné nekrotické léze korových pletiv, kde na rozhraní zdravého dřeva a léze dokáže spálová bakterie přežívat z jedné sezóny do druhé. Zdrojem nové infekce v následujícím období jsou dále latentní infekce a epifytická mikroflóra nadzemních orgánů, kde bakterie dokáže přežít v rezidentské fázi. K velkým ztrátám na výnosu jádrovin dochází v letech s vhodnými povětrnostními podmínkami pro vznik a průběh epidemií spály. Ztráty z posledních dvou velkých epidemií (1998 USA, Nový Zéland, Itálie; 2008 Německo, Švýcarsko, Rakousko) jsou ve výši několika desítek miliónů dolarů a EUR. Produkční sady se s epidemiemi takového rozsahu vyrovnávají po několik následujících let. 3/ Podmínky šíření infekce Pro šíření spálových bakterií je rozhodující teplota, vlhkost a průběh počasí za vegetace. Průběh počasí je téměř nejdůležitějším faktorem v epidemiologii spály. Bakterie Erwinia amylovora je schopna růst při teplotách +4 C až 37 C. Schopnost množit se je nejintenzivnější při teplotách mezi 24 29 C. Při teplotách kolem 25 C se vodivá pletiva hostitelských rostlin nejrychleji dělí, mají vysoký obsah vody, a tedy jsou pro rozvoj spálového onemocnění nejnáchylnější. K nejprudšímu a nejškodlivějšímu nástupu spály dochází v oblastech, kde je počátek vegetace deštivý a následně další průběh počasí je teplý až horký, ale zároveň vlhký. Pokud je počátek vegetace bez deště a bez vysoké relativní vlhkosti, škody způsobené spálou nebývají velké. Nejnáchylnějším orgánem pro vstup bakterie Erwinia amylovora jsou květy. Je-li v období kvetení teplé a deštivé počasí, mohou být škody na pěstitelských výsadbách a následně na produkci katastrofální. K epidemickému rozvoji onemocnění dochází i v případě, že dešťové srážky chybí, ale je vysoká relativní vlhkost vzduchu (nad 70 %) v důsledku rosy nebo mlhy. 8

4/ Symptomy onemocnění Symptomy spály jsou u většiny hostitelských rostlin velmi podobné. Mohou se projevit na kterémkoliv orgánu rostliny. U jabloní a hrušní se s prvními příznaky spály setkáváme nejčastěji u květů a následně u mladých letorostů. Typické příznaky a jejich intenzita se mění podle způsobu, místa a doby pronikání bakterií do vnitřních pletiv. Dále závisí na stupni virulence patogena, stupni rezistence rostlin k patogenu a vnějších podmínkách. Obecně platí, že hrušně jsou náchylnější než jabloně. Název spála charakterizuje typické příznaky onemocnění, které připomínají ožehnutí ohněm nebo spálení sluncem. Napadené rostlinné orgány nejprve vodnatí, květy vadnou, zbarvují se světle až tmavě hnědě a následně usychají; infikované plůdky jsou hnědé až černé, později sesychají a zůstávají viset na stromě. Na napadených letorostech je charakteristické hákovité ohnutí vrcholu (tzv. pastýřská hůl); na listech jsou viditelné tmavé žilky a řapík, později čepele ztmavnou a většinou neopadávají. Květy: Infekce postupuje přes brachyblasty a květní stopky nebo přímo přes bliznu a žlázy, kterými je vylučován nektar. Jednotlivé květy nebo celá květenství vodnatí, vadnou, zbarvují se světle až tmavě hnědě a nakonec usychají. Za teplého a vlhkého počasí jsou pokryty lesklým lepkavým slizem bílé až nažloutlé barvy. Infikované květy většinou zůstávají viset na stromě. U náchylných odrůd postupuje infekce do brachyblastů a výhonů. Spála brachyblastových letorostů je mnohdy jediným důkazem rané infekce květů. Výhony: Při průniku spálové bakterie do mladých letorostů mají jejich vodivá pletiva světlejší zelené zabarvení a jsou viditelně vodnatá. Následně se infikovaná pletiva zbarvují od žlutozelené až po hnědé až černé, sesychají. Při vysoké relativní vlhkosti se objevuje sliz. Nejprve je bílý, následně jantarový až červenohnědý. Letorosty s neukončeným prodlužovacím růstem jsou hákovitě ohnuté. Tento příznak je pro spálu růžovitých typický, je však potřeba rozlišit hákovité ohnutí způsobené spálou od ostatních poškození (intenzivní sluneční záření, houbová infekce, napadení hmyzem, mechanická poranění, herbicidy), protože k ohnutí dochází i při rychlé a náhlé ztrátě vody ve vrcholových pletivech mladých letorostů. Listy: Do listů proniká patogen přímo přes přirozené otvory (průduchy, hydatody), ale nejčastěji přes poranění, která vznikají při zvláště nepříznivých klimatických podmínkách (prudký déšť, vítr, bouřky a krupobití). Častá je i infekce přes řapík, který je velmi náchylný. Dochází k ní hlavně z infikovaných letorostů a výhonů. Typickým příznakem infekce postupující z letorostů a výhonů bývá zhnědnutí pletiv čepele listu ve tvaru klínu. Následně listy postupně od řapíku hnědnou a uvadají. Větve a kmen: Typickým příznakem je vytvoření nekrotické léze nejčastěji v místech poranění nebo prasklin, které se při ukončení vegetace scvrknou a vklenou. Na okraji takovýchto lézí mohou spálové bakterie přežívat do následující vegetace. Při příznivém průběhu počasí pro spálu u náchylných odrůd je průnik a šíření patogena velmi rychlý. Dochází k vytvoření nekróz, které mohou obepnout celé větve i kmen. Dochází k odumírání části koruny nebo i celého stromu. Příznaky výskytu slizu jsou podobné jako u spály letorostů. 9

Popis příznaků spálového onemocnění uvedený výše nepostihuje celou škálu možných symptomů. Na hostitelských rostlinách dalších druhů z čeledi růžovitých se příznaky mohou lišit (zbarvení listů napadených bakteriální spálou). 5/ Předpovědní systémy potenciální aktivity patogena Pro praktickou ochranu je rozhodující přesné stanovení doby ošetření rostlin účinnými přípravky ochrany rostlin. Předpokladem cílené ochrany je znalost doby infekce. Doporučované metody postřiků během kvetení v pětidenních intervalech nezaručují účelné využití používaných přípravků. V některých případech jsou zbytečně nákladné i škodlivé, protože se spála neobjeví. Vzhledem k postupujícímu geografickému šíření spály je v současnosti ve všech zemích věnována předpovídání potenciální aktivity patogena zvláštní pozornost. V České republice byl vytvořen pracovišti VÚRV a ČHMÚ program SPALA, který byl předán SRS. Programem SPALA je možné ve sledovaném období určit inkubační den s přesností na jeden den. Předností systému je přehledné grafické znázornění potenciální aktivity patogena v průběhu celé vegetační doby. 6/ Rezistence Nejúčinnějším způsobem regulace infekčního agens v přírodních podmínkách a omezení výskytu bakteriální spály růžovitých v produkčních výsadbách je pěstování rezistentních odrůd na rezistentních podnožích. Ne všechny druhy okrasných rostlin a divoce rostoucích růžovitých rostlin i odrůd jádrovin jsou stejně náchylné k patogenu bakteriální spály. Odrůdy hrušně jsou celkově k spále náchylnější než odrůdy jabloně. Šlechtitelské programy se již od poloviny 19. století zaměřují na odrůdy a podnože s vysokou hladinou rezistence k bakterii Erwinia amylovora. Hlavním důvodem je snížení ekonomických ztrát v produkčních výsadbách a velmi omezené prostředky ochrany proti bakteriální spále. Kromě antibiotik, která v Evropě nejsou povolena z důvodu rizika vzniku rezistentních kmenů bakterie Erwinia amylovora, nejsou spolehlivé baktericidní prostředky pro potlačení choroby. V současnosti bylo v ČR otestováno na rezistenci k bakterii Erwinia amylovora 64 odrůd a novošlechtění jabloní a 52 odrůd a novošlechtění hrušní včetně odrůd světového sortimentu. Testování rezistence se provádí v karanténních technických izolátorech pokrytých protihmyzovou sítí na detašovaném pracovišti VÚRV, v.v.i. ve Slaném v průběhu pěti po sobě následujících let. Stanovená hladina náchylnosti/rezistence je srovnatelná s náchylností/rezistencí odrůd ve výsadbách v době vysokého infekčního tlaku. 7/ Ověření virulence izolátů bakterie Erwinia amylovora Pro umělou inokulaci rostlinného materiálu byla testována virulence izolátů bakterie ze sbírky oddělení bakteriologie odboru rostlinolékařství VÚRV, v.v.i. Praha-Ruzyně a výzkumné stanice ve Slaném. V každém roce bylo otestováno minimálně 15 izolátů, které byly oživeny z mikrobanek skladovaných v hlubokomrazícím boxu (-75 C) kultivací na pevných agarových médiích (masopeptonový agar MPA a King B) při teplotě 27 C. Následně byly čisté kolonie rozočkovány na masopeptonový agar MPA a kultivovány při teplotě 27 C po dobu 48 hodin. Takto nakultivované kultury byly použity do následných testů, které ověřily virulenci izolátů. Z ověřených izolátů byla následně připravena suspenze pro testování hladiny rezistence krajových a starších odrůd jádrovin k bakterii Erwinia amylovora. 10

Virulence izolátů byla ověřena vznikem hypersenzitivní reakce po inokulaci jednotlivých izolátů o hustotě 10 6 cfu/ml do listů tabáku Nicotiana tabacum Burley. Test byl hodnocen po 24 hodinách následující stupnicí. 0 žádná hypersenzitivní reakce na tabáku 1 slabá hypersenzitivní reakce 2 střední hypersenzitivní reakce 3 silná hypersenzitivní reakce Dále byla z kultur starých 48 hodin připravena suspenze ve sterilní destilované vodě o hustotě 10 6 cfu/ml pro stanovení virulence a toxicity na výhonech hlohu náchylného k patogenu bakteriální spály (Crataegus x monogyna). Mladé letorosty hlohu Crataegus x monogyna, zbavené listů a nastříhané na 4 cm dlouhé kousky, byly ponořeny po pěti do lahviček (20 ml) se suspenzí jednotlivých bakteriálních kmenů o hustotě 10 6 cfu/ml na 2 hodiny a následně přeneseny do Petriho misek s filtračním papírem navlhčeným sterilní destilovanou vodou. Letorosty byly kultivovány při teplotě 27 C a test byl vyhodnocen po 5 dnech. U každého výhonu byla změřena délka výhonu a délka léze. Vyhodnocení virulence kmenů bylo stanoveno poměrem délky bakteriální léze k celkové délce výhonu (4 cm) vyjádřené v procentech podle níže uvedeného vzorce. délka léze v cm Intenzita napadení v % = ------------------------------- x 100 délka výhonu v cm Vybrané izoláty bakterie Erwinia amylovora byly použity pro přípravu směsné suspenze v testech in vivo pro stanovení hladiny rezistence pomocí umělé infekce v technických izolátorech. Pro testování hladiny rezistence krajových odrůd v in vitro kulturách byl použit izolát bakterie Erwinia amylovora 8/95. 8/ Množení odrůd jádrovin kulturami in vitro Pro získání in vitro rostlin jádrovin jako výchozího materiálu pro pozdější pokusy s umělou inokulací bakterií Erwinia amylovora je nutná chemická laboratoř vybavená zařízením pro sterilizaci agarových médií (například parní tlakový sterilizátor autokláv), horkovzdušnou sušárnou (teplota nejméně 120 C) a zařízením pro úpravu vysoce čisté demineralizované vody na bázi tlakové reverzní osmózy nebo elektrodestilace. Dále je nutná kultivační místnost s řízenými pěstebními podmínkami (teplo, světlo) pro růst in vitro kultur. Pro opakované subkultivace (pasážování) spojené s přenosem in vitro rostlin na nově připravená média je nutný laminární box (flow box) s proudícím sterilním vzduchem umožňující dodržovat zásady aseptické práce. Pro vybrané lokální odrůdy byla vyvinuta metoda množení in vitro na živných agarových médiích. Výhony pro založení kultury je vhodné odebírat v době vegetačního klidu (leden až březen). Po provedení šikmého řezu na spodní straně ponoříme výhony do vody a necháme je rašit 2 až 3 týdny při pokojové teplotě. Z rašících vegetačních pupenů s diferencovaným růstovým vrcholem vypreparujeme v aseptickém prostředí flow boxu vrcholy o velikosti 5 10 mm. Kromě období vegetačního klidu lze odebírat a vypreparovat aktivně rostoucí růstové vrcholy v případě potřeby i přímo z polních podmínek, nejlépe na 11

počátku vegetace (od poloviny dubna do poloviny června) v období intenzivního prodlužovacího růstu. Jako sterilizační činidlo pro sterilizaci primárního rostlinného explantátu lze využít různé chemické prostředky (chlorid rtuťnatý, chlornan sodný). Na základě našich výsledků doporučujeme jako sterilizační činidlo chlorid rtuťnatý v koncentraci 0,15 % se sterilizační dobou jedna minuta. Pomocí tohoto postupu byly v závislosti na odrůdě odstraněny kontaminace u 93 % až 100 % počátečních explantátů jádrovin. Naopak nejhoršího výsledku bylo dosaženo při použití chlornanu sodného v koncentraci 0,5 % se sterilizační dobou jedna minuta u genotypů jabloně, kde byly odstraněny kontaminace pouze u 15 % počátečních explantátů. Chlornan sodný se pro sterilizaci počátečních explantátů jádrovin neosvědčil. Po sterilizaci a založení kultury jsou primární explantáty množeny ve sterilním prostředí na živném médiu s převahou růstových regulátorů cytokininů, které mají pozitivní vliv na proliferaci postranních prýtů. Cílem je v podmínkách in vitro vyvolat působením vhodné koncentrace cytokininů vývoj nových rostlin tak, aby byly k dispozici v dostatečném množství pro následné pokusy s umělou infekcí bakterií Erwinia amylovora. Jako nejvhodnější médium doporučujeme pro nasazení počátečních explantátů a pro množení médium typu MS dle Murashige a Skoog (1962), které se osvědčuje pro většinu rostlin z čeledi růžovitých včetně jabloně a hrušně. Celkové složení MS média s modifikovaným přídavkem fytohormonů (zejména cytokininů), vitamínů a cukrů je uvedeno v tabulce 1. Tabulka 1. Modifikované výchozí MS médium pro kultivaci in vitro kultur. Složky jsou uvedeny v mg na 1 litr média. Složka mg l -1 Složka mg l -1 NH4NO3 1650 CuSO4 5H2O 0,025 KNO3 1900 Na2EDTA 2H2O 37,3 H3BO3 6,2 FeSO4 7H2O 27,8 KH2PO4 170 Thiamin 0,1 KI 0,83 Pyridoxin 0,5 Na2MoO4 2H2O 0,25 Kyselina nikotinová 0,5 CoCl2 6 H2O 0,025 Glycin 2 CaCl2 2H2O 440 Sacharóza 30000 MgSO4 7H2O 370 Myo-inositol 100 MnSO4 4H2O 22,3 Agar 7000 ZnSO4 7H2O 8,6 Kyselina askorbová 4 ph média 5,8 Pro zjištění a porovnání schopnosti multiplikace u jednotlivých odrůd jádrovin je vhodné stanovit koeficient množení. Koeficient množení vypočítáme jako průměrný počet nově vytvořených výhonů (délky nejméně 10 mm) z původního explantátu po 30 dnech růstu v kultivační místnosti. Rychlost množení je důležitá pro termín zahájení a pro naplánování průběhu pokusů s umělou inokulací bakterií Erwinia amylovora. Po inokulaci dojde u převážné většiny in vitro výhonů k nekrotizaci a odumření. Výhony nelze opakovaně použít. Z tohoto důvodu je nutno mít od každé zkoumané odrůdy před zahájením testování desítky až stovky dostatečně dlouhých in vitro rostlin s diferencovaným růstovým vrcholem a kvalitním olistěním. Výsledky množení dosažené u odrůd jádrovin vybraných pro výzkum umělé inokulace jsou uvedeny v tabulkách 2 a 3. 12

Tabulka 2. Koeficienty množení jednotlivých genotypů jabloně Cytokinin (mg l -1 ) Boikovo Matčino Blenheimská reneta Chodské Malinové holovouské Citrónové zimní BAP 1,0 1,7 ± 0,1 1,2 ± 0,0 1,5 ± 0,1 2,0 ± 0,1 1,7 ± 0,1 1,4 ± 0,1 2,0 2,4 ± 0,1 2,1 ± 0,1 3,5 ± 0,2 4,1 ± 0,1 2,3 ± 0,1 1,9 ± 0,1 4,0 1,8 ± 0,1 2,6 ± 0,1 2,7 ± 0,2 5,0 ± 0,2 2,6 ± 0,1 2,1 ± 0,1 TDZ 0,5 2,0 ± 0,1 yz 3,3 ± 0,2 yz 3,9 ± 0,1 z 3,1 ± 0,1 1,7 ± 0,1 2,7 ± 0,1 1 2,1 ± 0,1 yz 1,7 ± 0,1 yz 2,4 ± 0,1 z 4,3 ± 0,1 4,3 ± 0,2 1,3 ± 0,1 z 2iP 10 1.8 ± 0.1 y 1,8 ± 0,1 1,9 ± 0,1 z 1,2 ± 0,0 xy 2,5 ± 0,1 z 1,1 ± 0,0 xy z = abnormálně zúžené nevyvinuté listy y = vysoká tvorba kalusu na bázi explantátů x = žluté zabarvení a nekrózy Tabulka 3. Koeficienty množení jednotlivých genotypů hrušně Cytokinin Hájenka Merodova Špinka Jakubka Solanka (mg l -1 ) česká BAP 1,0 1,7 ± 0,1 1,2 ± 0,0 1,0 ± 0,0 1,2 ± 0,1 1,0 ± 0,0 2,0 2,7 ± 0,2 1,9 ± 0,2 1,2 ± 0,0 1,7 ± 0,1 1,6 ± 0,1 4,0 3,3 ± 0,2 2,5 ± 0,2 2,1 ± 0,1 1,9 ± 0,1 1,8 ± 0,1 TDZ 0,5 2,4 ± 0,1 yz 1,6 ± 0,1 yz 2,3 ± 0,1 yz 1,7 ± 0,1 yz 1,6 ± 0,1 yz 1 2,3 ± 0,1 yz 2,0 ± 0,1 yz 4,7 ± 0,1 yz 1,2 ± 0,0 yz 2,2 ± 0,1 yz 2iP 10 2,3 ± 0,1 2,5 ± 0,2 2,3 ± 0,1 1,3 ± 0,1 1,4 ± 0,1 z = abnormálně zúžené nevyvinuté listy y = vysoká tvorba kalusu na bázi explantátů Z fytohormonů doporučujeme použít pro indukci multiplikace samostatně BAP (6-benzylaminopurin) v koncentraci 2 až 4 mg l -1. Z důvodu vysoké tvorby kalusu se pro iniciaci multiplikace neosvědčil fytohormon TDZ (thidiazuron). Fytohormon TDZ v koncentraci 1 mg l -1 lze použít pouze na počátku množení pro iniciaci multiplikace pro odrůdy jádrovin s nižším multiplikačním koeficientem ( Citrónové zimní, Špinka, Solanka ) na médiích s BAP. Tímto postupem bylo v našich pokusech dosaženo u 6 odrůd jabloně ( Blenheimská reneta, Chodské, Malinové holovouské, Boikovo, Citrónové zimní, Matčino ) a 4 odrůd hrušně ( Merodova, Solanka, Hájenka, Špinka ) více než dvojnásobného zmnožení výchozího explantátu za jeden měsíc. U těchto odrůd jádrovin bylo možno provést více než 25 cyklů multiplikace, aniž by začal klesat multiplikační koeficient pod hodnotu 1,5. Nejvyšší koeficient množení (5,0) byl v našich pokusech zaznamenán u odrůdy jabloně Chodské na MS médiu s koncentrací BAP 4 mg l -1. U hrušně byl nejvyšší koeficient množení (4,7) zaznamenán u odrůdy Špinka na médiu s fytohormonem TDZ v koncentraci 1 mg l -1. Pro kořenění doporučujeme použít modifikované MS médium s 1 mg l -1 auxinu IBA nebo NAA. Termolabilní auxiny přidáváme dodatečně po sterilizaci v parním tlakovém 13

sterilizátoru přes mikrobiální mikrofiltry. U celkem 10 odrůd jádrovin (hrušeň Solanka, Merodova, Jakubka česká, Hájenka, Špinka, jabloň Blenheimská reneta, Boikovo, Šálové, Car Alexandr, Matčino ) se změnou obsahu hormonů v živném agarovém médiu (vysoký obsah auxinu, vynechání cytokininů) podařilo indukovat tvorbu kořenů. Procento zakořeněných jedinců se pohybovalo v závislosti na odrůdě od 3 do 26 %. Pro postupný převod in vitro rostlin do běžných kultivačních podmínek se pro postupnou aklimatizaci osvědčil kultivační box s řízenou teplotou (v rozsahu 26 ± 1 C) a světelný režim 16 hodin světlo, 8 hodin tma a standardizované rašelinové kontejnery typu JF pot. V první fázi aklimatizace doporučujeme umístit rostliny do miniskleníku s regulovatelným odvětráváním, které slouží k postupnému snižování vlhkosti ze 100 % na hodnoty běžné vzdušné vlhkosti 45 až 50%. Získané rostliny v projektu použitých odrůd jádrovin sloužily jako výchozí materiál pro pokusy s testováním odolnosti vůči spále v podmínkách in vitro kultur. Protože procentická hodnota zakořenění byla v našich pokusech relativně nízká, doporučujeme použít pro testování hladiny rezistence k bakterii Erwinia amylovora pomocí umělé infekce in vitro rostliny jádrovin bez kořenů. 9/ Testování odolnosti odrůd jádrovin pomocí umělé inokulace In vivo U rostlinného materiálu in vivo se používá ověřená metoda umělé inokulace střihem růstového vrcholu ve fenologické fázi prodlužovacího růstu letorostů nůžkami namočenými v bakteriální suspenzi bakterie Erwinia amylovora. Inokulace se provádí během měsíce května ve fenologické fázi růstu jednoletých výhonů za vhodných klimatických podmínek pro růst bakteriální spály. Relativní hladina rezistence byla stanovena po 40 dnech po inokulaci poměrem délky bakteriální léze k celkové délce výhonu vyjádřené v procentech. Vypočtená intenzita napadení byla převedena na šestibodovou stupnici, která určuje zařazení genotypu do kategorií 1/ velmi rezistentní (0 7,0 %), 2/ rezistentní (7,1 13,0 %), 3/ středně rezistentní (13,1 26,0 %), 4/ středně náchylný (26,1 60,0 %), 5/ náchylný (60,1 80,0 %), 6/ velmi náchylný (80,1 100,0 %). In vitro Z testovaných médií se pro in vitro kultivaci materiálu pro umělou inokulaci bakterií Erwinia amylovora osvědčilo médium typu MS podle Murashige a Skoog (1962) zejména s fytohormonem BAP v koncentracích 1 až 2 mg l -1. Z fytohormonů lze dále použít do stejného média auxin IBA v koncentraci 1 mg l -1, který kromě kořenění indukoval i prodlužovací růst použitých in vitro kultur jádrovin. Tímto způsobem byly získány in vitro rostliny dostatečně dlouhé (2 4 cm) pro měření rychlosti postupu a intenzity infekce. Pro pokusy s inokulací nelze naopak použít z důvodu vysoké tvorby kalusu a krátkých zduřelých výhonů fytohormon TDZ. Dále nedoporučujeme fytohormon 2iP z důvodů nedostatečného prorůstání a množení testovaných in vitro kultur jádrovin. Některé odrůdy jabloně ( Citrónové zimní, Chodské ) vykazovaly na médiu s 2iP navíc žluté zabarvení a nekrózy. 14

Obr. 1 In vitro kultura hrušně na MS médiu s 1 mg l -1 BAP v optimální velikosti pro testování umělou inokulací. Foto: J. Sedlák Jako nejvhodnější metoda inokulace in vitro kultur byla pro testování použita metoda střihu apikálního výhonu cca 0,2 mm sterilními nůžkami a nanesení kapky bakteriální suspenze (20 μl) na střižený růstový vrchol. Metoda byla zpřesněna použitím bakteriální suspenze izolátu Ea 8/95 ve 3 koncentracích (10 3, 10 6 a 10 8 cfu/ml). Bakteriální suspenze izolátu Ea 8/95 byla připravena z kultury narostlé na masopeptonovém agaru (MPA) č. 2 (48 hodin). Hodnocení bylo provedeno po 3, 5 a 9 dnech. Hladina náchylnosti jednotlivých genotypů jabloní a hrušní byla stanovena podle indexu napadení a výsledky byly zpracovány zjednodušenou neparametrickou metodou založenou na pořadí jednotlivých variant. Testování lokálních odrůd jádrovin vůči bakterii Erwinia amylovora bylo provedeno na explantátových kulturách čtyř odrůd hrušně a osmi odrůd jabloně metodou odstřižení apikálního vrcholu (popsáno výše). 10/ Rezistence lokálních odrůd jádrovin výsledky Hodnocení hladiny rezistence u lokálních odrůd in vivo U vysokokmenů jabloně byla vyhodnocena jako nejodolnější (rezistentní) odrůda Hvězdnatá reneta. Nejnáchylnější odrůdy byly Chodské, Car Alexandr a Panenské české. U vysokokmenů hrušně byla jako nejodolnější vyhodnocena odrůda Solanka. U kontejnerovaných rostlin jabloně nebyla žádná odrůda vyhodnocena jako velmi rezistentní nebo rezistentní. Jako středně rezistentní (bakteriální léze 13,1 26,0 %) byly vyhodnoceny Čistecké lahůdkové, Melba, Smiřické vzácné a Zvonkové. Jako nejnáchylnější se jevily odrůdy Banánové zimní, Jadernička moravská, Slava Pobediteljam. U odrůd hrušně testovaných v kontejnerech nebyla, stejně jako u jabloně, žádná odrůda vyhodnocena jako velmi rezistentní nebo rezistentní. Jako středně rezistentní (bakteriální léze 13,1 26,0 %) byla hodnocena odrůda Koporečka. Jako velmi náchylné byly u kontejnerovaných rostlin vyhodnoceny odrůdy hrušně Holenická, Libovická máslovka a Říhova bezjaderka. 15

Zařazení genotypů do kategorií podle vypočtené intenzity napadení: 2/ rezistentní: (7,1 13,0 %) Hvězdnatá reneta Vysokokmeny odrůdy jabloně: 5/ náchylné: (60,1 80,0 %) Astrachán červený, Citrónové zimní, Kanadská reneta, Matčino, Míšeňské, Ribstonské, Řehtáč soudkovitý 6/ velmi náchylné: (80,1 100,0 %) Car Alexandr, Chodské, Malinové holovouské, Panenské české, Smiřické vzácné, Šálové červené Kontejnerované odrůdy jabloně: 3/ středně rezistentní: (13,1 26,0 %) Čistecké lahůdkové, Melba, Smiřické vzácné, Zvonkové 5/ středně náchylné: (60,1 80,0 %) Boskoopské, Budakovského 9 6/ velmi náchylné: (80,1 100,0 %) Banánové zimní, Jadernička moravská, Slava Pobediteljam 2/ rezistentní: (7,1 13,0 %) Solanka Vysokokmeny odrůdy hrušně: 6/ velmi náchylné: (80,1 100,0 %) Jakubka česká, Hájenka 3/ středně rezistentní: (13,1 26,0 %) Koporečka 5/ středně náchylné: (60,1 80,0 %) Jakubka česká, Krvavka moravská Kontejnerované odrůdy hrušně: 6/ velmi náchylné: (80,1 100,0 %) Holenická, Libovická máslovka, Říhova bezjaderka 16

Hodnocení hladiny rezistence u lokálních odrůd v explantátových kulturách (in vitro) Hodnocení náchylnosti odrůd bylo provedeno podle indexu napadení. Zařazení jednotlivých odrůd k příslušnému indexu bylo provedeno podle procentického napadení explantátové kultury patogenem. Index náchylnosti odrůd k patogenu 1 0,0 10,0 % 2 10,1 30,0 % 3 30,1 50,0 % 4 50,1 80,0 % 5 80,1 100,0 % Z odrůd hrušně v explantátových kulturách se jeví jako nejcitlivější k bakterii Erwinia amylovora odrůda Merodova a nejodolnější odrůda Solanka. U odrůd jabloně v explantátových kulturách byla jako nejcitlivější vyhodnocena odrůda Smiřické vzácné a jako nejodolnější odrůda Hetlina a Blenheimská reneta. Zařazení genotypů do kategorií podle vypočtené intenzity napadení: 1/ rezistentní: (I = 1,0 1,5) Hetlina, Blenheimská reneta Odrůdy jabloně: 2/ středně náchylné: (I = 1,5 3,5) Car Alexandr, Citrónové zimní, Matčino, Šálové červené 3/ náchylné: (I = 3,5 5,0) Boikovo, Smiřické vzácné 1/ rezistentní: (I = 1,0 1,5) Solanka Odrůdy hrušně: 2/ středně náchylné: (I = 1,5 3,5) Jakubka česká, Hájenka 3/ náchylné: (I = 3,5 5,0) Merodova Závěrem lze konstatovat, že u většiny odrůd bylo dosaženo shody ve výsledcích testování in vitro a in vivo. Potvrdila se tak využitelnost biotechnologických metod testování pro hodnocení odolnosti jednotlivých odrůd jádrovin vůči bakterii Erwinia amylovora. Z hlediska odolnosti jednotlivých odrůd jádrovin vůči bakterii Erwinia amylovora vynikala v našem testování zejména odrůda hrušně Solanka. Tuto odrůdu lze doporučit šlechtitelům pro využití ve šlechtitelských programech zaměřených na získání vyšší odolnosti vůči spále růžovitých a dále pro její chuťově kvalitní plody ji lze doporučit i pro využití ve výsadbách vysokokmenů do volné krajiny. 17

Obr. 2. Plody odrůdy hrušně Solanka. Foto: F. Paprštein 11/ Popis vybraných spále odolnějších odrůd jádrovin Solanka Stará lokální odrůda hrušně pocházející pravděpodobně z okolí obce Solan u Třebenic na Libochovicku v severních Čechách. Tvoří mohutné, vysoce rozložité koruny. Díky bujnému zdravému růstu ji lze pěstovat i v horších půdních podmínkách. Plod je středně velký (120 150 g), protáhle kuželovitý. Ve sklizňové zralosti je základní barva slupky zelená, v konzumní zralosti nažloutlá, matná. Na osluněné straně se vyskytuje méně výrazné červené líčko. Plody vynikají velmi dobrou, odrůdově typickou sladce kořenitou chutí. Sklízí se v polovině srpna, jeden až dva týdny před konzumní zralostí. Uchovatelnost je dobrá, při chladírenském skladování při teplotě 0 C až 3 měsíce. Plody snáší velmi dobře i přepravu na větší vzdálenosti. V minulosti se vyvážela lodní dopravou po Labi až do Německa a dále do severských zemí a do Velké Británie. Strupovitostí plodů trpí jen výjimečně a je dosti odolná i vůči monilióze. Celkově se jedná o nenáročnou, chorobám a mrazu poměrně odolnou odrůdu s velmi jakostními stolními plody. Vzhledem ke svému silnému růstu a později rozložitému tvaru koruny se však nehodí pro pěstování v nižších moderních intenzívních pěstitelských tvarech. Hetlina Stará krajová odrůda jabloně, která vznikla v Chodově na Domažlicku asi v 18. století. Stromy této odrůdy lze nalézt již jen ojediněle ve starších sadech zejména v jižních a západních Čechách. Růst je středně bujný, tvar korun jehlancovitý. Plody jsou středně velké až větší, zploštěle žebernaté. Slupka je hladká, mastnější. Základní žlutá barva je překrytá z větší části karmínovou červení. Dužnina je tužší, šťavnatá s podprůměrnou chutí. Sklizňová zralost nastává v první polovině října, plody lze skladovat do dubna i déle. Plodnost je střední a pravidelná. Odrůda je nenáročná na stanoviště a relativně odolná vůči padlí. Daří se jí i ve vyšších polohách. Hlavním nedostatkem je podřadnější chuť plodů. Hvězdnatá reneta (Rote Sternrette) Jedná se o starou odrůdu jabloně (poprvé popsána v r. 1830) s neznámým původem. Pravděpodobně však pochází ze Střední nebo Západní Evropy z Německa nebo z Belgie. U nás se nachází jednotlivě ve starých sadech. Odrůda vytváří zdravé, středně rostoucí, vysoce kuželovité koruny. 18

Plody jsou středně velké (120 140 g), ploše kulovité, pravidelné. Základní barva je zelenavě žlutá, překrytá sytě karmínovou červení. Na povrchu plodu se vyskytují výrazné lenticely hvězdičkovitého tvaru. Dužnina je jemná, žlutobílá s narůžovělými žilkami. Chuť je sladce navinulá, dobrá. Sklízí se od poloviny září a vydrží až do března. Plody vyžadují při skladování vysokou vzdušnou vlhkost, jinak má sklon k vadnutí. Plodnost je pouze střední, má sklon k alternaci. Odrůda vyniká zdravým růstem, atraktivním vzhledem a odolností vůči padlí a strupovitosti. Nedostatkem je pouze průměrná chuť plodů, sklon k vadnutí a celkově podprůměrná plodnost. Blenheimská reneta (Blenheim Orange) Vznikla v Anglii jako nahodilý semenáč ve Woodstocku u Blenheimu kolem roku 1800. Díky chuťové kvalitě a velikosti plodů se do konce 19. století rozšířila i v celé kontinentální Evropě. U nás se nachází ve starších extenzívních selských sadech. Stromy této odrůdy rostou velmi bujně. Tvoří široce rozložité až deštníkovité koruny. Větve jsou nasazeny v téměř pravém úhlu. Plody jsou ploše kulovité, velké až velmi velké (přes 200 g), tvarově velmi vyrovnané. Slupka je drsnější, suchá, matná a pevná. Základní barva je zelenavě žlutá, později zlatožlutá, na sluneční straně překrytá přibližně z jedné třetiny oranžově červenou barvou ve formě mramorování nebo pruhování. Plody vynikají křehkou a šťavnatou dužninou a velmi dobrou, sladce navinulou typicky renetovitou chutí. Sklízí se od počátku října, při dobrém uskladnění vydrží až do března. V horších skladovacích podmínkách má sklon k vadnutí. Plodnost je střední, méně pravidelná. Odrůda je odolná vůči padlí. Strupovitostí trpí středně. Nejlepšími vlastnostmi jsou velikost a nadprůměrná chuť plodů. Mezi nedostatky patří střídavá plodnost, menší mrazuodolnost a sklon k vadnutí plodů při skladování. III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ Komplexně zpracovaná metodika testování odolnosti lokálních odrůd jádrovin k patogenu bakteriální spály růžovitých v in vivo a in vitro systémech nebyla v České republice doposud publikována. V in vitro podmínkách je celoročně možné otestovat větší počet jedinců dané odrůdy a širší sortiment odrůd na menší ploše několika metrů čtverečních v kontrolovaných laboratorních podmínkách, čímž se podstatně sníží celková náročnost testování. Testování na in vitro kulturách lze provádět celoročně bez ohledu na venkovní klimatické podmínky. Dále je zde na minimum sníženo riziko přenosu nebo šíření bakterie Erwinia amylovora, neboť se celý cyklus testování odehrává v uzavřeném prostředí laboratoře a in vitro kultury jsou infikovány v laminárním boxu s uzavřenou cirkulací vzduchu. Výhodou oproti klasickým postupům testování v podmínkách blížících se přírodním je snížení faktorů ovlivňujících hladinu rezistence k patogenu, jako je odstranění vlivu podnože na odrůdu. Z výše uvedených důvodů má proto tato metoda velký potenciál pro využití i na dalších pracovištích při práci s karanténními organismy. 19

IV. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY Při použití umělé infekce in vitro kultur lze proces testování rezistence jádrovin zjednodušit, urychlit a zlevnit. Lokální a starší odrůdy s ověřenou relativní rezistencí k bakterii Erwinia amylovora bude možné využít jako zdrojový genetický materiál pro šlechtitelské programy. Vyšlechtění a pěstování odrůd s ověřenou rezistencí zmírní ztráty na produkci ovoce a sníží spotřebu prostředků na ochranu rostlin. Při propuknutí epidemie bakteriální spály, ke které dochází v Evropě každých 5 až 7 let, je možné omezit odumírání celých stromů během jedné vegetace a zamezit šíření inokula patogena větrem, deštěm i hmyzími vektory. Výsadba lokálních odrůd ve volné krajině je součástí kulturního dědictví České republiky a posiluje biodiverzity ovocných druhů v regionech. Zdravý výchozí materiál bude poskytován na komerčním základě školkařským podnikům a pěstitelům ovoce. V. EKONOMICKÉ ASPEKTY Přínosy u tvůrců výsledků Ekonomické přínosy: U tvůrců nejsou ekonomické přínosy vyčísleny. Výsledky budou předány uživatelům zdarma. Další přínosy: 1/ zvýšení znalostí a dovedností, které využijí řešitelé v další výzkumné činnosti, 2/ propagace relativně rezistentních lokálních odrůd mezi šlechtitele a školkaře. Přínosy u uživatelů Ekonomické přínosy: Prodej lokálních odrůd jádrovin školkařských podniků je ročně cca 10 tis. stromů. Při ceně 160,- Kč pěstitelského tvaru čtvrtkmen je roční produkce ve výši 1 600 tis. Kč. Při možné epidemii bakteriální spály růžovitých je možná ztráta kolem 50 % stromů v jedné vegetaci. Výpočtem hodnoty 5 až 7 letých stromů, kdy průměrná cena taxonu Malus silvestris ve volné krajině je 920,- Kč a Pyrus communis je 3480,- Kč jsou ztráty jen na roční výsadbě 7 032 tis. Kč (při podílu 19 % lokálních odrůd) ročně. Nejsou zde zahrnuty ztráty na produkci ovoce, ke kterým může dojít rozšířením patogena do produkčních sadů. V roce 2010 byly průměrné tržby produkčních sadů jabloně 861,3 mil. Kč a hrušně 50,4 mil. Kč. Vypočtené ztráty v kalamitním roce při propadu produkce jen o 10 % jsou 91,17 mil. Kč. Další přínosy: 1/ znalost relativně rezistentních lokálních odrůd jádrovin pro šlechtitele a pěstitele, 2/ snížení zátěže životního prostředí snížením prostředků na ochranu rostlin (měďnaté přípravky), 3/ snížení rizikovosti podnikání ve venkovském prostoru, 4/ omezení šíření virulentního inokula bakteriální spály v místech výsadby odolných odrůd. 20

Podklady pro výpočet KOLAŘÍK, J. Oceňování dřevin rostoucích mimo les. Praha: Agentura ochrany přírody a krajiny ČR, 2009. 90 s. BUCHTOVÁ, I. Situační a výhledová zpráva ovoce. Praha: Ministerstvo zemědělství, 2011. 84 s. VI. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY BLAŽEK, J. Hodnocení citlivosti odrůd a genotypů hrušní po přirozené infekci spálou růžovitých (Erwinia amylovora). Vědecké práce ovocnářské. 1999, sv. 16, s. 91 101. BUCHTOVÁ, I. Situační a výhledová zpráva ovoce. Praha: Ministerstvo zemědělství, 2011. 84 s. HANKE, V., GEIDER, K. A. New Approach to Evaluate Fire Blight Resistance In Vitro. Acta Horticulturae. 2002, no. 590, p. 397 399. HEVESI, M., JAMBOR-BENCZUR, E., PAPP, J., DOBRANSZKY, J., MAGYAR- TABORI, K., BUBAN, T. Application of in vitro methods in fire blight resistance programs. Beiträge zur Züchtungsforschung. 2002, vol. 8, no. 3, p. 29 30. KLEMENT, L., RUDOLPH, K., SANDS, D. S. Methods in Phytobacteriology. Budapest: Akadémiai Kaidó, 1990. 568 p. KOLAŘÍK, J. Oceňování dřevin rostoucích mimo les. Praha: Agentura ochrany přírody a krajiny ČR, 2009. 90 s. KORBA, J., ŠILLEROVÁ, J. Bakteriální spála růžovitých rostlin. Zahradnictví. 2010, roč. 9, č. 6, s. 11 13. KŮDELA, V. Erwinia amylovora, původce spály růžovitých rostlin v Československu. Ochrana rostlin. 1988, roč. 24, č. 3, s. 173 182. KŮDELA, V., NOVACKY, A., FUCIKOVSKY L. Rostlinolékařská bakteriologie. Praha: Academia, 2002. 348 s. MURASHIGE, T., SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962, vol. 15, no. 3, p. 473 497. PINET-LEBLAY, C., BRISSET, M. N., CHEVREAU, E., PAULIN, J. P. In vitro screening for resistance to fire blight using a pathogenicity mutant of Erwinia amylovora. Acta Horticulturae. 1996, no. 411, p. 415 416. SEDLAK, J., PAPRSTEIN, F. In vitro proliferation of newly bred Czech pear cultivars. Acta Horticulturae. 2009, no. 839, p. 87 92. ZWET, van der T., BEER, S. V. Fire Blight Its Nature, Prevention, and Control: A Practical Guide to Integrated Disease Management. U.S. Department of Agriculture. Agriculture Information Bulletin. 1995, no. 631, 83 p. VII. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE KORBA, J., ŠILLEROVÁ, J., PAPRŠTEIN, F., SEDLÁK, J. Lokální odrůdy hrušní a jejich hladina náchylnosti k bakteriální spále růžovitých rostlin. Zahradnictví. 2011, roč. 10, č. 2, s. 12 14. ISSN 1213-7596. 21

KORBA, J., ŠILLEROVÁ, J., PAPRŠTEIN, F., SEDLÁK J. Výběr virulentních bakteriálních kmenů Erwinia amylovora pro testování umělé infekce spály na jádrovinách. Vědecké práce ovocnářské. 2011, sv. 22, s. 135 142. ISSN 0231-6900. KORBA, J., ŠILLEROVÁ, J., PAPRŠTEIN, F., SEDLÁK J. Ochranná opatření proti bakteriální spále růžovitých. In: Divišová, E. (ed). Směrnice Ministerstva zemědělství pro integrované systémy pěstování ovoce, Věstník MZe ČR 1/2011. Praha: Ministerstvo zemědělství, 2011, s. 33 35. KORBA, J., ŠILLEROVÁ, J., PAPRŠTEIN, F., SEDLÁK, J., PROKINOVÁ, E., HOŠKOVÁ, P. Evaluation of susceptibility level of pear cultivars to fire blight (Erwinia amylovora) in the Czech Republic. Horticultural Science. 2013, vol. 40, no. 2, p. 58 64. ISSN 0862-867X. PAPRŠTEIN, F., SEDLÁK, J., KORBA, J., ŠILLEROVÁ, J. Testing of resistance to Erwinia amylovora in an in vitro culture assay. Acta Horticulturae. 2011, no. 896, p. 381 384. ISSN 0567-7572. SEDLÁK, J., PAPRŠTEIN, F. Micropropagation of old pear cultivars. Acta Horticulturae. 2012, no. 961, p. 473 477. ISSN 0567-7572. SEDLÁK, J., PAPRŠTEIN, F., KORBA, J., ŠILLEROVÁ, J. Development of in vitro system for testing of pome fruit resistance to fire blight. Acta Horticulturae. 2011, no. 896, p. 375 379. ISSN 0567-7572. ŠILLEROVÁ, J., KORBA, J., PAPRŠTEIN, F., SEDLÁK, J. Testing of resistance of pear cultivars after artificial inoculation with Erwinia amylovora in field conditions. Acta Horticulturae. 2011, no. 896, p. 353 355. ISSN 0567-7572. 22

23

Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o., 2014 ISBN: 978-80-87030-29-5 (VŠÚO Holovousy s.r.o.) ISBN: 978-80-7427-156-4 (VÚRV, v.v.i., Praha)