A. Všeobecné informace Kód žádosti: MZ13-UVN-MinarikovaPetra 1. Veřejná soutěž: NT - Resortní program výzkumu a vývoje MZ III na léta 2010-2015 2. Oborová komise: 10/I - Ostatní lékařské obory I 3. Název projektu: Využití volné nádorové DNA jako nového cíle pro minimálně-invazivní diagnostiku a zpřesnění molekulární klasifikace kolorektálních nádorů. 4. Řešitel (navrhovatel) Tituly: MUDr. Jméno: Petra Příjmení: Mináriková Hodnosti: Ph.D. RČ: 715606/0065 Telefon: +420 973 203 063 E-mail: petra.minarikova@uvn.cz Pracoviště: Interní klinika 1.LF UK a ÚVN Funkce: lékař St. přísl.: CZ 5. Uchazeč / příjemce Název: Ústřední vojenská nemocnice -Vojenská fakultní nemocnice Praha Druh: SPO - Příspěvková organizace IČ: 61383082 Zřizovatel: MO0 - Ministerstvo obrany Ulice: U Vojenské nemocnice 1200 PSČ: 169 02 Město: Praha Stát: CZ Telefon: +420 973 208 169 Fax: +420 973 208 556 E-mail: rudolf.plzak@uvn.cz Číslo účtu: 32123881/0710 Banka: Česká národní banka Ekonom: BC. Jana Soukupová Velikost: Výzkumná org. Číslo IBAN: CZ96 0710 0000 0000 3212 3881 Kód banky SWIFT: CNBACZPP 6. Členové řešitelského týmu Tituly: MUDr. Jméno: Štěpán Příjmení: Suchánek Hodnosti: Ph.D. RČ: 760621/3175 Telefon: 973 203 060 E-mail: stepan.suchanek@uvn.cz Pracoviště: Interní klinika 1.LF UK a ÚVN St. přísl.: CZ 7. Doba řešení projektu Datum zahájení: 01.05.2013 Datum ukončení: 31.12.2015 Roků: 3 8. Cíle a priority projektu Předkládaný projekt naplní většinu cílů programu RPV MZ III, zejména se však jedná o tyto: 1. Podpora molekulárně-biologických přístupů v odpovídajících oblastech zdravotnického výzkumu a vývoje. 2. Zlepšení léčebných výsledků využívajících nejnáročnější moderní postupy. Současně předkládaný projekt naplní následující priority RPV MZ III pro oblast Onkologie: 1. Časná diagnostika (progrese) nádorového onemocnění, umožňující léčebnou intervenci a vyléčení lokálním zákrokem. 2. Kombinace molekulárně-cílené léčby s klasickými léčebnými postupy (chirurgie, chemoterapie). 3. Využití exprese genů a proteinů jako prediktivních a prognostických ukazatelů. 4. Zhodnocení kvality života a ekonomických dopadů po aplikaci operačního terapeutického postupu. Hlavními očekávanými přínosy jsou: Zvýšení procenta časného záchytu progrese nádoru, komplikací nádorového onemocnění i komplikací léčby. Zlepšení výsledků péče o nemocné s nádory, zejména zlepšení srovnatelnosti výsledku se sousedními zeměmi. Hospodárnější využití moderních léků a rozšíření inovativních diagn. a léčebných postupů v rámci akademických pracovišť. 9. Klíčová slova charakterizující projekt (pouze v anglickém jazyce) cfdna; colorectal; cancer; epigenetics; Strana 1 / 17
A. Všeobecné informace Kód žádosti: MZ13-UVN-MinarikovaPetra 10. Anotace vystihující předmět řešení Prospektivní studie, cílená na vývoj a využití metod molekulárního vyšetřování genetických a epigenetických biomarkerů ve volné nádorové DNA (cell-free tumor DNA) za účelem časné diagnostiky a jejich molekulárního profilování pro urychlení predikce terapeutické odpovědi a odhadu prognózy nemocných. 11. Údaje pro CEP Kód důvěrnosti předávaných údajů: S - veřejně přístupné Kategorie výzkumu: NV - aplikovaný výzkum (neprůmyslový) Hlavní obor projektu dle CEP: Vedlejší obor projektu dle CEP: Další obor projektu dle CEP: FE - Ostatní obory vnitřního lékařství FD - Onkologie a hematologie EB - Genetika a molekulární biologie 12. Očekávané výsledky projektu Druh očekávaného výsledku Počet J - článek v odborném periodiku 2 D - článek ve sborníku 1 A - audiovizuální tvorba, elektronické dokumenty 3 13. Seznam příloh Poř. Název souboru Obsah 1 MZ13-UVN-MinarikovaPetra-1.pdf Formulář žádosti spolupříjemce (FNHK) 2 FNHK_prohlaseni_dalsiucastnik.pdf Prohlášení dalšího účastníka (FNHK) 3 MZ13-UVN-MinarikovaPetra-2.pdf Formulář žádosti spolupříjemce (Genomac) 4 Genomac_prohlaseni_dalsiucastnik.pdf Prohlášení dalšího účastníka (Genomac) 5 Genomac_vypis_OR.pdf Výpis z obchodního rejstříku (Genomac) 6 Genomac_prohlaseni_malypodnik_ucastnik.pdf Prohlášení malých, středních a velkých podniků (Genomac) 7 FNHK_stanovisko eticke komise.pdf Stanovisko etické komise (FNHK) 8 Vypis_RS Výpis z rejstříku trestů hlavního spoluřešitele 2 9 Genomac_vypis_OR_1 Výpis z obchodního rejstříku v barvě část 1 (Genomac) 10 Genomac_vypis_OR_3 Výpis z obchodního rejstříku v barvě část 2 (Genomac) Uveďte seznam všech souborů přiložených k této žádosti (formuláře spoluuchazečů a další požadované přílohy). Strana 2 / 17
B.1 Popis projektu Kód žádosti: MZ13-UVN-MinarikovaPetra Úvod Nemocní s pokročilými stádii zhoubných novotvarů mívají často zvýšené hladiny cirkulující volné DNA (cellfree DNA, cfdna) v periferní krvi [1]. K uvolňování cfdna dochází v důsledku aktivace procesů buněčné apoptózy a nekrózy a to jak přímo z masy tumoru, tak i z okolní nenádorové tkáně. Z hlediska diagnostickoterapeutického postupu je z celkové cfdna významná především složka nádorová, tzv. tumorová cfdna. Její přítomnost může usnadnit získání DNA materiálu pro molekulární profilaci tumoru za účelem diagnostiky a predikce léčebné odpovědi biologické cílené léčby. To vše bez nutnosti provádění častých invazivních a finančně nákladných vyšetření [2]. V našem předešlém projektu jsme se zabývali vývojem metodiky odběru, zpracování a laboratorních postupů pro vyšetření cfdna na bázi vyšetřování somatických genových mutací. Jedním z výsledků bylo vyvinutí mutačního panelu umožňujícího detekci tumorové cfdna v různých stádiích onemocnění [3]. V předkládaném projektu se budeme zabývat vyšetřováním nové skupiny epigenetických markerů. Jedná se především o určení tzv. fenotypu nádoru se základním dělením na mutátorový fenotyp (chromosomal instability, CIN) nebo metylátorový fenotyp (CpG island methylator phenotype, CIMP). Uvedené fenotypy indikují významně odlišné vývojové dráhy a s tím související determinanty biologického chování nádoru, odpověď na protinádorovou léčbu i celkovou prognózu nemocných [4]. Cíl projektu: Hlavním cílem projektu je zvýšení citlivosti záchytu cfdna pro časnější stádia onemocnění s využitím nově vyvinuté metodiky vyšetřování epigenetických markerů. Dalším cílem je provádění rozšířeného spektra vyšetření na cfdna vedoucí k přesnější molekulární klasifikaci s významem pro volbu následného terapeutického postupu. Pracovní hypotézy 1. Rozšíření panelu mutačních markerů o vybrané epigenetické markery zvýší procentuální záchyt cfdna u pacientů s kolorektálními nádory. 2. cfdna lze využít pro určení mutátorového nebo metylátorového fenotypu nádoru 3. Hodnoty metylace cfdna u nemocných s kolorektálním karcinomem koreluje s hodnotami metylace v primárním nádoru, popřípadě v sekundárním nádoru (metastatická tkáň). Metodika Do studie bude prospektivně v průběhu řešení nabráno celkem 250 osob podstupujících kolonoskopické vyšetření. Z toho bude 150 pacientů s klinicky potvrzenou diagnózou kolorektálního karcinomu a 100 pacientů s nálezem pokročilého adenomu. Všichni účastníci podepíší informovaný souhlas (viz dále) a bude jim proveden odběr nesrážlivé krve s okamžitým zpracováním a izolací krevní plazmy. U pacientů s nálezem karcinomu bude odebrán i vzorek tumorózní tkáně (biopsie), u pacientů s nálezem pokročilého adenomu, bude zajištěn histologický preparát tkáně tohoto adenomu. Vzorky budou zaslány do genetické laboratoře, kde bude provedena extrakce DNA (volné DNA v případě vzorků plazmy) a následně budou provedena vyšetření genetických a epigenetických markerů a mutátorová/metylátorová (CIN/CIMP) fenotypizace. Časový harmonogram I. rok (5/2013-12/2013): ÚVN a FNHK: registrace prospektivních pacientů, odběry krev+tkáň karcinomů během kolonoskopického vyšetření, izolace plazmy, zajištění histologických vzorků adenomů, sběr klinických údajů. Genomac: příprava postupů pro metylační analýzu cfdna, izolacedna ze tkání a cfdna z plazmy, mutační analýzy a průkaz cfdna v plazmě s nalezenou mutací, metylační analýzy cfdna. II. rok (1/2014-12/2014): ÚVN a FNHK: pokračování náboru pacientů, provádění endoskopií, náběry vzorků, klinické údaje. Genomac: Pokračování izolací a vyšetřování DNA a cfdna, mutační analýzy, metylační analýzy. Všichni: První hodnocení metodiky a průběžných výsledků + prezentace pilotních dat (domácí časopis, konference, atd.) III. rok (1/2015-12/2015): ÚVN a FNHK: dokončení náboru, vyšetřování a vzorkování pacientů, dohledání a Strana 3 / 17
B.1 Popis projektu Kód žádosti: MZ13-UVN-MinarikovaPetra kompletace klinických dat pacientů. Genomac: Dokončení vyšetřování vzorků, individuální vyžádání a vyšetření opakovaných náběrů a vzorků, kompletace laboratorních dat. Všichni: Vyhodnocení výsledků, sepsání a podání impakt. publikace, prezentace finálních dat, zakončení projektu, diskuse a příprava tématických doporučení pro klinickou praxi. Způsob získávání dat, jejich analýzy a návrh statistického zpracování Jedná se o prospektivní studii, kde budou výsledky molekulárně-genetických analýz (mutační a metylační profily) korelovány s klinickými daty nemocných, jako např. stádium a lokalizace onemocnění, u adenomů velikost a stupeň dysplázie. Vyšetřovaná sada mutačních markerů vychází z mutátorového modelu (CIN) a vyšetření vyvinuté účastníky projektu v předcházející studii. Metylační analýzy budou zaměřeny na sadu genů definujících metylátorový fenotyp (CIMP) [4]. Sensitivita případně nově nalezených kandidátních markerů bude otestována s využitím skupiny pokročilých adenomů. Ve výsledném statistickém zpracování bude hodnocena celková úspěšnost (záchyt) volné DNA, stupeň konkordance výsledku získaného z primární tumorózní tkáně a z volné DNA a budou zjištěny hodnoty citlivosti a specificity vzhledem ke klinickým parametrům jako je klinické stádium (TNM klasifikace), či lokalizace nádoru (proximální vs. distální tračník). Výsledky budou porovnávány mezi jednotlivými skupinami (nádory, adenomy, negativní) pomocí nepárových chi-kvadrátových testů. Za významný výsledek bude standardně považováno dosažení min. 5% hladiny statistické významnosti Spolupráce Projekt je založen na mezioborové spolupráci dvou klinických pracovišť v oboru gastroenterologie zajišťujících nábor pacientů do studie a získávání klinických dat a vzorků (ÚVN a FNKV) a laboratorního pracoviště specializujícího se na molekulární profilování nádorů a detekci volné DNA (Genomac). Spolupráce je postavena na zkušenostech a metodice z předchozí spolupráce v oblasti genomického výzkumu, například logistika odběru a distribuce vzorků mezi klinickými a laboratorními pracovišti. Předchozí společný projekt prováděný na pracovištích příjemce a spolupříjemce 2 zaměřený na vyšetřování cfdna v pooperačním sledování pacientů s kolorektálními nádory [3] byl navržen na cenu Ministra Zdravotnictví. Předkládaný projekt je tak v logické návaznosti na tento úspěšný projekt. Diskuse Kolorektální karcinom patří mezi nejčastější příčiny úmrtí na maligní onemocnění ve vyspělých zemích. Metastázy, detekované v době diagnózy či při rekurenci nebo progresi již známého tumoru, zapříčiní až 90 % těchto úmrtí. U nemocných s kolorektálním karcinomem byla přítomnost CTC v periferní krvi opakovaně potvrzena a její záchyt se pohyboval mezi 20 % u lokalizovaného onemocnění a 60% u pokročilého CRC. Doložen byl i klinický význam CTC jako nezávislého prognostického faktoru, kdy pacienti s pozitivní detekcí CTC v době diagnózy měli horší prognózu než pacienti s negativním nálezem. V našem předešlém projektu jsme vyvinuli mutační panel umožňující detekci tumorové cfdna v různých stádiích onemocnění. V předkládaném projektu se proto budeme zabývat vyšetřováním nové skupiny epigenetických markerů s cílem odhalit signifikantní markery mající vliv na chování nádoru, odpověď na protinádorovou léčbu i celkovou prognózu nemocných a rozšířit tak možnosti minimálně invazivní diagnostiky kolorektálních nádorů a zpřesnit jejich molekulární klasifikaci. Informace o připravenosti podílejících se pracovišť Příjemce: Oddělení gastroenterologie, hepatologie a metabolismu, Interní klinika 1.LF UK a ÚVN Praha je předním centrem komplexní léčebně preventivní péče v gastroenterologii, hepatologii, diabetologii a metabolismu. Na endoskopické jednotce je ročně prováděno přes 2000 kolonoskopických vyšetření zaměřených především na diagnostiku karcinomu tlustého střeva a konečníku. Provádí se zde jak screeningová kolonoskopie (po pozitivním testu na okultní krvácení), tak i primární screeningová kolonoskopie (u osob starších 55 let). Pracoviště má silné výzkumné zázemí s historií řešení klinických studií i Strana 4 / 17
B.1 Popis projektu Kód žádosti: MZ13-UVN-MinarikovaPetra grantových projektů. Spolupříjemce 1: II. interní gastroenterologická klinika LFUK a FN Hradec Králové poskytuje komplexní diagnostickou a léčebnou péči pro gastroenterologické a hepatologické pacienty. Má lůžkové oddělení, ambulanci a specializované gastroenterologické a hepatologické poradny, funkční laboratoř a rozsáhlé pracoviště zajišťující všechny základní metody digestivní endoskopie (gastroskopie, kolonoskopie, ERCP) a všechny metody terapeutické (endoskopická léčba krvácení, polypektomie, endoskopické slizniční resekce, drenážní výkony, zavádění stentů). Pracoviště má silnou publikační historii s každoročně publikovanými pracemi v časopisech s impakt faktorem. Spolupříjemce 2: Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES) společnosti Genomac disponuje kompletním přístrojovým i personálním vybavením v oblasti moderního vyšetřování genetických i epigenetických molekulárních markerů. Specializované vybavení čítá 6 vysokokapacitních DNA sekvenátorů, čipový bioanalyzátor, 8 PCR cyklérů, real-time PCR cyklér, pipetovací robotická stanice a přístroj pro laserovou mikrodisekci. Výzkumný tým má silnou historii v oblasti aplikovaného výzkumu na bázi interních projektů i projektů s veřejnou podporou včetně publikační aktivity v řádu 3-4 impaktovaných publikací za rok. Projekty IGA MZ byly v minulosti vždy hodnoceny známkou A - vynikající řešení. Očekávané výsledky a význam projektu Očekávaným praktickým výstupem projektu je zvýšení záchytu cfdna a tím i rozšíření využití tohoto významného nástroje v diagnostice, sledování průběhu a predikci tohoto onemocnění. Dalším očekávaným výsledkem je prokázání možnosti vyšetřování cfdna jako representativního zdroje pro molekulární profilování (klasifikaci) nádorů. Očekáváme publikace v impaktovaných časopisech, prezentace výsledků na tuzemských nebo zahraničních konferencích. Přínos projektu Hlavním přínos projektu je medicínský pro pacienty, kterým bude možno provádět komplexní molekulární vyšetření, na základě kterého lze sledovat dynamiku onemocnění, provádět racionální volbu terapie, monitoring a včasný záchyt relapsu. Narozdíl od klasických biopsií budou tato vyšetření charakterizována minimální invazivitou. To vše přispěje k prodloužení délky a kvality života nemocných. Přínosem projektu je i zapojení mladých výzkumníků a žen (2/3 v základním řešitelském týmu) do projektu. Literatura [1] Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Circulating nucleic acids as a potential source for cancer biomarkers. Curr.Mol.Med., 2010, 10, 142-165. [2] Benesova L., ; Belsanova B., Minarikova P., Veprekova G., Suchanek S., Levy M., Lipska L., Visokai V., Zavoral M., Minarik M. Mutation-based detection and monitoring of cell-free tumor DNA in peripheral blood of cancer patients. Anal. Biochem, 2012, (submitted) [3] Levy M, Benesova L, Lipska L, Belsanova B, Minarikova P, Veprekova G, Zavoral M, Minarik M. Utility of Cellfree Tumour DNA for Post-surgical Follow-up of Colorectal Cancer Patients. Anticancer Res. 2012 May;32 (5):1621-6. [4] Worthley D.L., Leggett B.A. Colorectal Cancer: Molecular Features and Clinical Opportunities Clin Biochem Rev. 2010 May; 31(2): 31-38. Strana 5 / 17
B.2 Informovaný souhlas pacienta Kód žádosti: MZ13-UVN-MinarikovaPetra Příloha: Informovaný souhlas s odběrem vzorků a jejich molekulárně genetickým vyšetřením pro účely výzkumu minimálně-invazivní diagnostiky a zpřesnění molekulární klasifikace kolorektálního karcinomu. Na základě Zákona č. 101/2000 Sb. (o ochraně osobních údajů), Zákona č. 20/1966 Sb. (o péči o zdraví lidu) a pozdějších předpisů Správce osobních údajů:! IČO: " # " # V souladu se zákonem č. 101/2000 Sb. o ochraně osobních údajů (dále jen Zákon) uděluje subjekt správci oprávnění shromažďovat, zpracovávat, uchovávat a užívat jeho citlivé osobní údaje. Těmito citlivými údaji jsou genetické údaje získané ze vzorků DNA poskytnutého subjektem. Účelem zpracování je klinický výzkumný projekt v rámci grantu IGA MZ. Poskytnuté údaje mohou být zpřístupněny pouze orgánům oprávněným dle Zákona. Subjekt (pacient zařazený do studie) uděluje souhlas se zpracováním dobrovolně a na dobu do písemného odvolání. Pacient je oprávněn dle 12 Zákona vyžádat si od správce informace, jaké osobní údaje o něm správce zpracovává. Poskytnutí osobních údajů je dobrovolné a subjekt je oprávněn je kdykoliv odvolat. V takovém případě provede Správce likvidaci těchto osobních údajů. Jméno a příjmení pacienta: (r.č.): ouhlasím, aby mi byly provedeny odběry biologických vzorků (tkáně, krev) na molekulárně-genetická vyšetření pro účely výzkumu molekulárních markerů nádoru tlustého střeva a konečníku. Byl(a) jsem ujištěn(a), že odběry nepředstavují zvýšení rizika komplikací. Přečetl(a) jsem si informace pro pacienty, které jsou přílohou tohoto souhlasu. Měl(a) jsem dostatek času hovořit o této problematice s níže podepsaným lékařem a potvrzuji tímto, že má účast na výzkumných projektech, ve kterých budou analyzovány moje vzorky DNA, je dobrovolná. Byl(a) jsem ujištěn(a), že informace o mé osobě v záznamech vedených pro účely výzkumu budou ochráněny ve smyslu Zákona. Má identita tak nebude nikdy zveřejněn Byl(a) jsem ujištěn(a), že informace o mé osobě budou v záznamech vedených pro účely výzkumu ochráněny proti zneužití. Souhlasím také s tím, že výsledky mých testů mohou být v rámci výzkumu podstoupeny i světovým konsorciím pro výzkum této choroby. $ m srozuměn(a) s tím, že nemocní zařazení do studie nemají nárok na žádnou odměnu za účast v ní a nebudou jim uhrazeny žádné výdaje. Jsem si vědom(a), že od studie mohu kdykoliv bez udání důvodu odstoupit, a toto mé rozhodnutí nebude mít vliv na mou další léčbu. % & & & & & & & & & & & & & & & & & & & % ' ( & & & & & & LÉKAŘ Potvrzuji, že jsem výše podepsanou osobu informoval o cílech i podmínkách vyšetření. * +, -. *, / JMÉNO LÉKAŘE ) % & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & % ' ( & & & & & & Strana 6 / 17