Univerzita Palackého v Olomouci Bakalářská práce Olomouc 2012 Monika Gembalová
Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra botaniky Molekulární identifikace a charakterizace kolekce hub z čeledi Morchellaceae a řádu Boletales Bakalářská práce Monika Gembalová Studijní program: Chemie Studijní obor: Chemie pro víceoborové studium Biologie (CH BI) Forma studia: Prezenční Olomouc 2012 Vedoucí práce: doc. RNDr. Vladan Ondřej, Ph.D. 2
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala sama pod vedením doc. RNDr. Vladana Ondřeje, Ph.D. Veškeré literární zdroje a informace, které jsem v práci použila, jsou uvedeny v seznamu použité literatury. V Olomouci dne Podpis... 3
Děkuji panu doc. RNDr. Vladanovi Ondřejovi, Ph.D. za jeho odborné vedení a cenné rady. Dále bych chtěla poděkovat panu Ing. Pavlovi Havránkovi a panu Josefovi Šutarovi za poskytnutí materiálu. Děkuji také své rodině za podporu a zázemí. 4
SOUHRN Čeleď Morchellaceae byla dosud charakterizována převážně na základě morfologických znaků (velikost a tvar plodnic, výtrusy). Některé studie uvádějí, že do této čeledi patří pouze tři až pět druhů, jiní se domnívají, že i 50 a více (Madhavi 2005). Genetickou příbuznost lze určit na základě sekvenčních dat ITS regionů. Z vytvořených fylogramů bylo možné identifikovat fylogenetické vazby u vybraných zástupců čeledi Morchellaceae. Řád Boletales je jednou z hlavních skupin tvořících houby, které jsou zastoupeny ve většině lesních ekosystémů po celém světě. Tato skupina obsahuje asi tisíc popsaných druhů (Binder & Hibbett 2006). Vzhledem k rozdílným ekologickým podmínkám je taxonomická identifikace složitá. Na základě této skutečnosti byly použity genetické metody, aby objasnily příbuznost studovaných vzorků. Výsledky získané ze sekvenčních dat poukazují na vyčlenění rodu Xerocomellus, který obsahuje dvě geneticky rozdílné skupiny. V rámci rodu Xerocomellus se vyčlenil rod Chalciporus. 5
SUMMARY Family Morchellaceae has been characterized mainly on the basis of the morphological features (sporocarp size and form, spores). Some studies state, that this family includes only 3 to 5 species, while others assume even more than 50 (Madhavi 2005). Genetic relatedness can be determined from the sequence data of the ITS regions. The phylogenetic relationships of selected representatives of the family Morchellaceae were identified from the resulting phylograms. Order Boletales is one of the main groups of fungi, which are present in most of the forest ecosystems all over the world. This group consists of about 1000 described species (Binder & Hibbet 2006). Taxonomic identification is difficult because of different ecological circumstances. Based on this fact, genetic methods were used to clarify the relatedness of the studied species. The results obtained from the sequence data indicate the division of the genus Xerocomellus, which contains two genetically different groups. Genus Chalciporus branched off from within the genus Xerocomellus. 6
OBSAH 1 CÍLE PRÁCE 8 2 ÚVOD 9 3 TEORETICKÁ ČÁST 10 3.1. CHARAKTERISTIKA ŘÁDU PEZIZALES 10 3.1.1. Systém a charakteristika čeledi Morchellaceae 11 3.1.2. Charakteristika studovaných rodů 11 3.2. CHARAKTERISTIKA ŘÁDU BOLETALES 14 3.2.1. Hřiby a jejich morfologie 14 3.2.2. Klobouk 15 3.2.3. Hymenofor 16 3.2.4. Výtrusy 17 3.2.5. Třeň 17 3.2.6. Dužina 18 3.2.7. Vnější obal plodnice 18 3.2.8. Charakteristika studovaných rodů 19 3.3. MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÉ METODY 22 4 PRAKTICKÁ ČÁST 24 4.1. MATERIÁL 24 4.1.1. Biologický materiál 24 4.1.2. Chemikálie 29 4.1.3. Vybavení 29 4.2. METODY 29 4.2.1. Izolace DNA 29 4.2.2. PCR (polymerázová řetězová reakce) 30 4.2.3. Elektroforéza 31 4.2.4. Purifikace PCR produktů a sekvenování 31 5 VÝSLEDKY 33 6 DISKUZE 38 7 ZÁVĚR 39 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 40 7
1 CÍLE PRÁCE Vypracování rešerše na téma molekulární identifikace a charakterizace kolekce hub z čeledi Morchellaceae a řádu Boletales Použití molekulárně-biologických metod (izolace DNA, PCR, elektroforéza, sekvenování) ke zjišťování genetické variability Práce se sekvenčními daty a sestavení fylogramů 8
2 ÚVOD Rod Morchella, Verpa a Ptychoverpa patří do třídy Pezizomycetes, řádu Pezizales a čeledi Morchellaceae (Kalina & Váňa 2005). Smrži představují jedny z nejvíce ceněných jedlých hub, ale veškeré informace o toxicitě dosud nebyly jasně definovány. Na základě fylogenetických vztahů by bylo možné např. rozlišit rod Morchella (smrž) a Gyromitra (ucháč), jež patří mezi houby jedovaté (Ondřej et al. 2011). Smrži mají dvě odlišné ekologické strategie. Jsou to saprotrofické houby rostoucí na narušené půdě charakterizované vysokou dostupností živin a nízkým konkurenčním tlakem, anebo mutualistické houby v stabilizovaných ekosystémech s vysokou konkurencí na živiny. Tato ekologická plasticita je velmi neobvyklá (Buscot et al. 1996). Systém založený na morfologických znacích zahrnuje 3-30 druhů rodu Morchella. Tato skutečnost odráží obrovskou variabilitu plodnic způsobenou jejich stanovišti a specifickými abiotickými a biotickými podmínkami. Na základě sekvenčních dat bylo možné oddělit skupinu Adnatae (žlutí smrži) a Distantes (černí smrži). Později bylo potvrzeno, že čeleď Morchellaceae, včetně rodu Morchella je monofyletického původu (Kellner et al. 2005). Smrže je velmi obtížné taxonomicky charakterizovat a některé skupiny dosud nejsou jasně popsány. Díky genetické studii je možné na základě získaných vzorků ověřit taxonomickou identifikaci včetně fylogenetických vztahů a porovnat je s výsledky z celého světa (Ondřej et al. 2011). Řád Boletales patří do podtřídy Agaricomycetidae a zahrnuje čeledi Boletaceae (s hymenoforem v podobě rourek), Gomphidiaceae a Paxillaceae (hymenofor tvořený lupeny). Většina zástupců jsou mykorhizní houby s úzkou vazbou na jeden nebo několik druhů dřevin (Kalina & Váňa 2005), ale mohou být i mykoparazité. Houby uvedeného řádu se vyskytují na většině lesních území na celém světě. Dosud je popsaných asi 1000 druhů. Vzhledem k rozmanitosti plodnice je charakterizace dle morfologie složitá. Řád Boletales tvoří monofyletický taxon (Binder & Hibbett 2006), což je jediná přirozená skupina ve smyslu fylogenetiky (Kalina & Váňa 2005). 9
3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1. Charakteristika řádu Pezizales Řád Pezizales zahrnuje operkulátní diskomycety. Mycelium je podzemní, jednoi vícebuněčné. Někdy se tvoří sklerocia. U většiny druhů je známá pouze teleomorfa, tj. pohlavně se rozmnožující fáze životního cyklu. Pohlavní rozmnožování je různé. Nejčastěji se vyskytuje gametangiogamie, ale může dojít i k spermatizaci, somatogamii a autogamii, která je typická pro rod Morchella (Kalina & Váňa 2005). Vývoj plodnice je askohymeniální. Základ této plodnice je na místě, kde došlo k pohlavnímu procesu. Její vývoj probíhá s vývojem askogenních hyf. Plodnice jsou typu apothecia. Mají miskovitý, poduškovitý, kalichovitý a různě zprohýbaný tvar. U některých zástupců mohou být stopkatá. Dosahují různé délky od 10 do 25 cm výšky. Z ontogenetického hlediska se jedná o plodnice gymnokarpní (otevřená plodnice s nezakrytým hymeniem), hemiangiokarpní (hymenium je nejprve uzavřené a teprve během vývoje plodnice se obnažuje) nebo angiokarpní (uzavřená plodnice, která se otevírá až v době zralosti spor). Povrch plodnice kryje jedno- až vícevrstevná peridie. Výtrusorodá část, gleba, vzniká zprohýbáním apothecia na lišty (Kalina & Váňa 2005). Vřecka jsou unitunikátní zpravidla elipsoidního až válcovitého tvaru. Mohou být ale i kapkovitá až kulovitá. U většiny zástupců jsou operkulátního typu (otevírají se víčkem). Tvar, velikost, struktura stěn i barva spor jsou v rámci řádu velmi variabilní (Kalina & Váňa 2005). Vrchol vřecek se zbarvuje při zkoušce s jodem modře (Antonín 2006). Většina druhů tohoto rozsáhlého řádu jsou půdní saprofytové s nápadně zbarvenými plodnicemi (žlutě, oranžově, purpurově, fialově). Rostou na holé půdě, mrtvém dřevě, rostlinných zbytcích, ale i na spáleništích či exkrementech (Kalina & Váňa 2005). 3.1.1. Systém a charakteristika čeledi Morchellaceae Oddělení: Vřeckovýtrusné houby, vřeckaté houby, askomycety Ascomycota Pododdělení: Pezizomycotina (syn. Ascomycotina) Třída: Pezizomycetes Řád: Pezizales Čeleď: Morchellaceae (Kalina & Váňa 2005) 10
Čeleď Morchellaceae Tato skupina je dosti nejednoznačná. Mezi charakteristické znaky používané v klasifikaci patří např. zvrstvení stěny, popř. uspořádání hyf v apotheciu (Hansen & Pfister 2006). K záměnám může dojít u dvou podobných rodů. Jedná se o kačenku (Verpa) a ucháče (Gyromitra). Ptychoverpa bohemica je běžně lidmi konzumována a prodávána také komerčně. Některé druhy těchto rodů mohou být potenciálně toxické, zejména jsou-li nedostatečné tepelně upravené. Z těchto důvodů je lépe se jim vyhnout. Rozdíly mezi chřapáčem (Helvella) a terčovnicí (Disciotis) se neuvádějí, neboť je lze snadno rozpoznat dle vzhledu apothecia (Pilz et al. 2007). Plodnice jsou rozděleny na klobouk a třeň. Plodná kloboukatá část je kuželovitá až téměř kulovitá, často nepravidelná, jamkatá, na bělavém válcovitém třeni. Vnitřní část klobouku je zcela nebo alespoň do poloviny přirostlá ke třeni. Rostou saprotrofně na zemi v listnatých lesích a hájích (Antonín 2006). Čeleď Morchellaceae zůstává nejednoznačná, a to i přesto, že již bylo několik studií zveřejněno. Znalosti týkající se ekologie, biologie a rozmanitosti druhů zůstávají omezené, kvůli jejich vysoké variabilitě. Liší se barvou, která se pohybuje od černé až po nažloutlou, tvarem i velikostí žeber. Všechny tyto skutečnosti velmi komplikují systematizaci dle morfologických znaků. Vyskytují se po celém světě na celé řadě různých stanovišť. V Izraeli byla zkoumána unikátně dlouhá doba vývoje plodnic. Byl objeven druh, který produkuje askokarpy po delší dobu. Pomocí molekulárních metod bylo možné popsat výskyt jednotlivých druhů v letech 2001 až 2007 (Masaphy et al. 2009). Právě z důvodu nejednoznačnosti systému proběhla genetická studie s cílem ověřit taxonomickou identifikaci včetně fylogenetických vztahů v porovnání se záznamy z celého světa (Ondřej et al. 2011). 3.1.2. Charakteristika studovaných rodů Morchella esculenta (smrž obecný) Jeden z nejhojnějších zástupců čeledi Morchellacea má klobouk vysoký 4 8 cm a široký 3 6 cm. Tvar je zpravidla vejčitý, kulovitý nebo tupě kuželovitý. Spodním okrajem přirůstá ke třeni. Povrch kryjí nepravidelně uspořádané hluboké jamky různých tvarů ohraničené téměř kolmými přepážkami. Zbarvení se v průběhu růstu mění od šedé až šedookrové po žlutookrovou až hnědou, na ostří přehrádek je až načervenalá (Hagara 1993). 11
Třeň se v dolní části rozšiřuje (Hagara 1993), tudíž nabývá tvaru kyjovitého (Antonín 2006), výjimečně je tvaru válcovitého. Povrch kryjí jemná zrníčka, popř. je vrásčitý nebo nízce jamkatý. Zbarvení bývá zprvu bílé, později u báze načervenalé (Hagara 1993). Dužina je vodnatě voskovitá, křehká, v jamkaté části klobouku žlutookrová až hnědavě okrová, v dutině třeně i klobouku bělavá, s nevýraznou vůní a chutí (Hagara 1993). Roste brzy na jaře (Váňa 1996) ve světlých hájích, křovinách, parcích a zahradách (Antonín 2006), především na hlinitopísčitých půdách (Hagara & Váňa 2005). Místy je hojný, jinde může chybět (Hagara 1993). Jedlá a velmi chutná houba vhodná k jakékoli úpravě i na sušení. Staré plodnice mohou obsahovat jedovaté látky uvolňované při rozkladu dužiny (Hagara 1993). Smrže obecného lze zaměnit s jinými druhy smržů, ale i s kačenkou českou (Ptychoverpa bohemica), která má podstatně menší a pouze na vrcholu třeně přirostlý klobouk. Nebezpečí hrozí pouze u záměny s ucháčem obecným (Gyromitra esculenta), který má charakteristicky mozkovitě zprohýbaný klobouk (Hagara 1993). Morchella elata (smrž vysoký) Má poněkud tmavší, hnědě, olivově hnědě až černě zbarvený klobouk s výrazným ostrým žebrováním (Antonín 2006), tvaru kuželovitého, válcovitě kuželovitého nebo štíhlého. Vrchol klobouku je většinou ostrý, vzácně tupý. Spodní okraj mírně přesahuje třeň a odsedle k němu přirůstá (Hagara 1993). Žebra jsou přehrádkovaná na čtyři až vícehranné jamky, uspořádané víceméně v pravidelných svislých řadách (Antonín & Hagara 2005). Zbarvení se pohybuje v různých odstínech hnědé s šedým, černavým, purpurovým nebo olivovým nádechem (Hagara 1993). Třeň je tvaru válcovitého, často s rozšířenou horní nebo spodní částí, většinou ploše brázditý, dutý, hustě vločkatý, v mládí bělavý, později zlatavý, okrový až žlutohnědý (Hagara 1993). Tenká křehká dužina je ve třeni tuhá, za syrova bez výrazné vůně a chuti. Po usušení aromatická (Hagara 1993). Roste ve stinných hájích, na rumištích nebo podél cest (Antonín 2006). Hojnější je pouze v podhorských oblastech (Hagara 1993). Vyskytuje se od nížin po horský stupeň na vápenatých, hlinitých i písčitých půdách (Hagara 1993). Bývá častým průvodcem porostů devětsilu podél cest (Antonín & Hagara 2005). Morfologicky je podobný jiným smržovitým houbám charakterizovanými ostrým vrcholem klobouku, např.: smržem kuželovitým (Morchella conica) (Hagara 1993). 12
Mitrophora semilibera (smrž polovolný) Klobouk je tvaru kuželovitého až zvoncovitého, který je hnědě až olivově hnědě zbarvený (Antonín 2006). Na povrchu má ostrá žebra rozdělená v protáhlé jamky. Klobouk je asi do poloviny vnitřní plochy připojený k bělavému, jemně zrnitému třeni (Antonín & Hagara 2005). Roste ojediněle ve světlých hájích, zahradách a sadech (Antonín 2006). Je chutný. Jako jediný náš druh smržů nemá klobouk přirostlý celou vnitřní plochou k třeni. Záměna je možná jen za kačenku českou, která má však klobouk připojený k třeni pouze na jeho vrcholu. Je rovněž jedlá (Antonín & Hagara 2005). Morchella crassipes (smrž tlustonohý) Vytváří velké, až 300 mm vysoké plodnice. Klobouk je kulovitý až tupě kuželovitý, na temeni tupý nebo zašpičatělý, se zvlněnými žebry s nepravidelnými okrouhlými nebo vícehrannými jamkami, okrový, šedohnědý až hnědý (Antonín & Hagara 2005). Třeň bývá zpravidla kyjovitý, na bázi výrazně zduřelý (Antonín 2006). Roste vzácně v zastíněných místech v lesích a hájích (Antonín 2006). Vzhledem k mohutnosti a velikosti plodnic a tvaru třeně je poměrně snadno určitelný. Lze ho zaměnit pouze se smržem obecným, který má však vždy víceméně okrouhlý klobouk, nikoli tupě kuželovitý. Další odlišností je i třeň, který nebývá výrazně žebernatý. Někteří autoři pokládají smrže tlustonohého jen za variantu smrže obecného (Antonín & Hagara 2005). Ptychoverpa bohemica (kačenka česká) Patří mezi nejoblíbenější jarní houby. Má vysoký zvoncovitý žlutohnědý až hnědý klobouk, výrazně podélně žebernatý. Připojuje se pouze nahoře k víceméně válcovitému, v mládí jemně vločkatému bělavému třeni (Antonín & Hagara 2005). Dužina je tenká, voskovitá, křehká, s nevýraznou vůní a příjemnou chutí (Hagara 1993). Roste místy hojně, většinou v listnatých hájích, zejména pod osikami, ale také pod jeřáby, olšemi, trnkami aj. dřevinami. Na některých nalezištích se vyskytuje masově (Antonín & Hagara 2005). Dává přednost zásaditým půdám s dostatkem živin. Za příznivého počasí je možné ji na stejných místech sbírat každé jaro. Jedná se o velmi chutnou houbu s podobným využitím jako smrž obecný. Konzumují se pouze mladé plodnice, dospělé plodnice jsou ke konzumaci nevhodné (Hagara 1993). 13
Zaměnit se dá s kačenkou náprstkovitou, jež má hladký nebo pouze jemně zbrázděný klobouk, a s některými druhy smržů, ale ty mají vnitřní stranu klobouku přirostlou k třeni celou plochou nebo alespoň do její poloviny (Antonín & Hagara 2005). Verpa conica (kačenka náprstkovitá) Podobná kačence české, ale o něco menší. Klobouk je olivově hnědý až hnědý, téměř hladký nebo jemně vrásčitý. Nikdy nejsou patrná výrazná žebra. Od kačenky české se liší i mikroskopicky. Výtrusy má daleko menší, v každém vřecku po osmi (Antonín & Hagara 2005). Roste většinou v listnatých hájích hlavně pod osikami, ale i jinými dřevinami (Hagara 1993). Vyskytuje se ojediněle, na rozdíl od kačenky české. Je rovněž velice chutná (Antonín & Hagara 2005). Verpa conica var. cerebriformis (kačenka náprstkovitá mozkovitá) Od typické formy kačenky náprstkovité se liší hluboce žilnatým, mozkovitě utvářeným kloboukem. Podobá se kačence české, která však nemá mozkovitě zprohýbaná klobouk a má pouze dva až čtyři výtrusy v každém vřecku. Obě formy mají ve vřeckách po osmi výtrusech (Antonín & Hagara 2005). V České republice je velice vzácná (Antonín & Hagara 2005). 3.2. Charakteristika řádu Boletales Základ řádu tvoří druhy s rouškatými plodnicemi nebo plodnicemi přechodnými k břichatkovitým houbám. Klasickými čeleděmi jsou potom Boletaceae, Gomphidiaceae a Paxillaceae. Plodnice je hemiangiokarpní nebo gymnokarpní pilothecium. Velum partiale je přítomno u řady druhů. Hymenofor je lehce od klobouku oddělitelný (Kalina & Váňa 2005). 3.2.1. Hřiby a jejich morfologie Tělo hub je tvořeno myceliem (podhoubím), což je vegetativní část houby v podobě vláken nebo povlaků, umístěná v substrátu. U většiny hub se nachází pod zemí, kde roste v soužití s některými cévnatými rostlinami. Zpravidla to bývají dřeviny. Pro hřibovité houby je charakteristická ektomykorhiza. Při ektomykorhize mycelium 14
obaluje kořínky symbiotické rostliny, ale neproniká dovnitř buněk hostitele. Z podhoubí vyrůstají plodnice, na kterých vznikají rozmnožovací tělíska. Období vývoje plodnic se nazývá období fruktifikace (Šutara et al. 2009). Symbiotické vztahy mezi houbami a cévnatými rostlinami bývají dlouhodobé. Pro některé hřiby je charakteristický pouze jeden druh nebo rod stromu, zatímco jiné mohou tvořit mykorhizu jak s listnáči, tak s jehličnany. Úzká vazba je například u klouzků (rod Suillus), kde jedna skupina tvoří mykorhizu výhradně s modříny a druhá s borovicemi (Šutara et al. 2009). Klouzky charakterizuje slizká pokožka klobouku a často i přítomný prsten (Kalina & Váňa 2005). Rovněž křemenáče a kozáky jsou vázány na určité stromy. Křemenáč osikový (Leccinum rufum) je vázán pouze na osiku (Populus tremula) (Šutara et al. 2009). Kozáky a křemenáče mají v dospělosti poměrně tenký, šupinatý třeň (Kalina & Váňa 2005). Zvláštní způsob obživy má hřib příživný (Pseudoboletus parasticus), který je sice schopný tvořit ektomykorhizu, ale v určitém období, tj. v době kdy vytváří plodnice, přechází na parazitický způsob života a roste jako mykoparazit na plodnicích pestřece obecného (Scleroderma citrinum) (Šutara et al. 2009). U hřibu dřevožijného (Buchwaldoboletus lignicola) a hřibu sírového (Buchwaldoboletus sphaerocephalus) se vyskytuje saprotrofismus. Tyto houby se živí rozkladem dřeva jehličnanů (Šutara et al. 2009). 3.2.2. Klobouk Klobouk téměř všech hřibů je v raném stadiu polokulovitý, později klenutý až ploše rozprostřený. U starých plodnic se mohou okraje klobouku ohýbat nahoru. Průběh růstu u většiny hřibů je podobný. Někdy může být tvar klobouku charakteristickým znakem určitého druhu (Šutara et al. 2009). Zbarvení klobouku bývá dosti proměnlivé působením vnějších vlivů a některých ekologických činitelů. Mění se také v závislosti na stáří plodnic. U některých druhů je klobouk v raném mládí zbarvený tmavěji než dospělá plodnice, u jiných druhů tomu je naopak. Dochází k postupnému vytváření pigmentu v pokožkových hyfách na klobouku v průběhu růstu plodnic. Na tvorbu pigmentu má vliv hlavně světlo. Mladé plodnice hřibu smrkového (Boletus edulis), které jsou ukryté pod jehličím nebo listím, mají klobouk bílý. Jakmile vyrostou a začne na ně dopadat světlo, získávají typicky hnědou barvu (Šutara et al. 2009). Pokožka klobouku se jeví jako holá. Ve skutečnosti je však sametová nebo plstnatá. Mikroskopická stavba pokožky bývá tvořena trichodermem. Trichoderm je typ pokožky tvořený částečně propletenými hyfami, které nejsou stejně dlouhé. Lze ho 15
najít u druhů rodů Boletus, Gyroporus, Buchwaldoboletus, Xerocomus, Phylloporus, Tylopilus, Pseudoboletus, Porphyrellus, Leccinum aj. U mladých plodnic jsou hyfy vzpřímené, u starších trichodermové hyfy zkolabují a jeví se jako lysý. Hyfy se mohou také shlukovat do skupinek a tvořit povrch šupinkatý (Šutara et al. 2009). Palisádodermem je tvořena např. pokožka hřibu žlutomasého (Xerocomellus chrysenteron). Jedná se o kompaktní vrstvu víceméně rovnoběžných hyf, uspořádané v antiklinálním směru. V pozdějších stádiích se kompaktní vrstva rozpadá a postupně se roztrhává na fragmenty. Makroskopicky se pak pokožka jeví jako políčkovitě rozpraskaná (Šutara et al. 2009). Povrch klobouků některých hub může být i slizký (Suillus) nebo lepkavý (u většiny druhů rodu Boletus). Ixotrichodermem je tvořena pokožka hub s nejvíce slizkým kloboukem. V ixotrichodermu jsou vláknité hyfy pokožky uzavřené v gelatinózní hmotě. Vyskytuje se například u hřibu pružného (Aureoboletus gentilis) a u většiny klouzků (Šutara et al. 2009). Pro křemenáče (Leccinum) je charakteristická nepravidelně přívěsková blanka přesahující cca 2-4(-6) mm přes okraj klobouku. Tento znak lze sledovat jen u mladších plodnic. U starších plodnic postupně mizí (Šutara et al. 2009). 3.2.3. Hymenofor Hymenofor je část plodnice nesoucí výtrusorodou vrstvu - hymenium (rouško). Hymenium je vrstva buněk bazidií, bazidiol a cystid, které jsou palisádovitě uspořádané. Bazidie mají důležitou funkci z hlediska reprodukce. Dochází u nich k redukčnímu dělení po karyogamii a k tvorbě výtrusů, kterými se rozmnožují. Cystidy jsou zvláštní buňky důležité zejména k určování některých skupin hub. Podle umístění na hymenoforu se dělí na pleurocystidy (cystidy na stěnách rourek), cheilocystidy (cystidy na ústí rourek), a na kaulocystidy (cystidy na povrchu třeně) (Šutara et al. 2009). Hymenofor většiny našich hub je tvořen rourkami. Důležitým znakem je připojení rourek na třeň. Toto připojení se postupně vyvíjí, proto je nutné ho posuzovat až na dospělých plodnicích. Připojení rourek může být sbíhavé, připojené, mírně stlačené, mírně stlačené a malým zoubkem sbíhající a silně stlačené až téměř volné. Hřib dřevožijný (Buchwaldoboletus lignicola) a hřib peprný (Chalciporus piperatus) mají sbíhavé rourky. Rourky mírně stlačené a malým zoubkem sbíhající jsou charakteristické pro hřib plstnatý (Xerocomus subtomentosus) a hřib žlutomasý (Xerocomellus chrysenteron). Rod Boletus má rourky stlačené (Šutara et al. 2009). Mezi další důležité určovací znaky patří velikost pórů. V mládí jsou póry skoro 16
všech hub malé, ale u některých mohou zůstat drobné i v dospělosti. U některých skupin se postupně zvětšují. Pro rod Boletus jsou charakteristické drobné plodnice, které nejsou větší než 1mm. Středně velké póry (1-3mm) můžeme nalézt u rodů Xerocomus a Xerocomellu (Šutara et al. 2009). 3.2.4. Výtrusy Výtrusy boletoidního tvaru, tj. elipsovitě vřetenovité, protáhlé až válcovitě vřetenovité s mělkou prohlubní nad apikulem, mají například druhy Chalciporus, Aureoboletus, Buchwaldoboletus, Boletus, Xerocomus, Xerocomellus, Tylopilus, Porphyrellus, Pseudoboletus a Leccinum. Povrch výtrusů u těchto rodů je většinou hladký. Pouze hřib sametový (Xerocomellus pruinatus) má výtrusy jemně podélně žíhané a hřib plstnatý (Xerocomus subtomentosus), pro který je charakteristický povrch plodnic ozdobený jemnou ornamentikou nazývanou baciloidní (Šutara et al. 2009). Barva výtrusného prachu patří mezi další určovací znaky. Olivový nebo hnědoolivový prach mají rody Aureoboletus, Buchwaldoboletus, Boletus, Xerocomus, Xerocomellus aj. Výtrusný prach bez olivového odstínu (například hnědorůžový, světle hnědý, hnědočervený apod.) najdeme u rodů Tylopilus a Chalciporus. Můžeme tedy odlišit rody s olivovým výtrusným prachem od rodů, které olivový odstín nemají (Šutara et al. 2009). 3.2.5. Třeň Mezi makroskopické znaky třeně patří zejména tvar, velikost, zbarvení a povrchová ornamentika (Šutara et al. 2009). Na povrchu se na třeni vyskytuje síťka, plstnaté šupinky či drobné zrníčka. Síťka pokrývá celý třeň, ale může být i redukovaná, či ve vzácných případech zcela chybět i u druhů, u nichž je jinak běžně vyvinuta (Šutara et al. 2009). Typická ornamentika je charakteristická pro rod Leccinum (kozáky a křemenáče). Povrch třeně je roztrhaný na šupinky. Tyto šupinku jsou buď už od mládí tmavé, nebo tmavnou až v průběhu dalšího vývoje (pouze u několika málo výjimek). Podobnou ornamentiku lze najít u hřibu plavého (Hemileccinum impolitum) a hřibu skvrnitého (Hemileccinum depilatum). Rozdíl je pouze v tom, že šupinky jsou zbarveny světle a během růstu netmavnou nebo tmavnou pouze nepatrně (Šutara et al. 2009). Výtrusy se mohou vytvářet nejen v hymenoforu, ale i na povrchu třeně. Třeň je tedy plodná a pokrytá kaulohymeniem. Což je v mládí souvislá vrstva palisádovitě uspořádaných buněk (kaulobazidie, kaulocystidy, kaulobazidioly), která se později trhá 17
na malé fragmenty ostrůvky kaulohymeniálních buněk. Fragmenty se makroskopicky jeví jako drobná zrníčka. Mezi tramou třeně a kaulohymeniem je vyvinuta laterální stratum třeně. Od tramy, která je tvořena hustě uspořádanými hyfami s podélnou osou třeně, se liší divergentním a volnějším uspořádáním hyf. Laterální stratum třeně je charakteristické např. pro rody Buchwaldoboletus, Boletus, Xerocomus, Leccinum a další. Neplodný povrch třeně má jen velmi málo hřibů (např. Gyrodon lividus) (Šutara et al. 2009). 3.2.6. Dužina Dužina hřibů je v mládí tuhá a kompaktní. Postupem času měkne a roztéká se na kašovitou hmotu. Tato změna je typická pro většinu hřibů. Charakterizovat ji budeme pouze u druhů, které ji mají nějakým způsobem význačnou, jak tomu je např. u šiškovce černého (Strobilomyces strobilaceus), který má dužinu mimořádně suchou (Šutara et al. 2009). Dužina ve třeni bývá zpravidla tužší než v klobouku. Liší se mikroskopickou stavbou. Zatímco trama dužiny klobouku je tvořena hyfami, které jsou volně uspořádané a vzájemně nepravidelně propletené všemi směry, trama dužiny třeně je tvořena hustě namačkanými a pravidelně uspořádanými více méně rovnoběžném s podélnou osou třeně (Šutara et al. 2009). Dalším charakteristickým znakem je barva dužiny. Díky ní lze některé druhy spolehlivě určit. Hřib Engelův (Xerocomellus Engelii) má červenooranžovou až mrkvově červenou dužinu v bázi třeně. Mezi další hřiby, které lze určit dle dužiny patří hřib koloděj (Boletus luridus) nebo hřib kovář (Boletus luridiformis). Dužina se u některých skupin může po poranění zbarvovat, ale u některých je neměnná. Tento proces zbarvování se někdy nazývá oxidace. Intenzivní modré zbarvení je u druhů Luridi rodu Boletus. U některých druhů rodu Leccinum je dužina nejprve špinavě růžová a postupně se zbarvuje do šeda, šedočerna až černa. U šiškovce černého (Strobilomyces strobilaceus) probíhá postupný proces černání (Šutara et al. 2009). 3.2.7. Vnější obal plodnice Vnější obal plodnice se nazývá velum. Většina našich hub však velum ani prsten nemá. Některé houby jsou ale v mládí obaleny zvláštní vrstvou pletiva. Jedná se o plachetku neboli univerzální velum. Toto velum je vyvinuto pouze u šiškovce černého (Strobilomyces strobilaceus). Postupně se roztrhává a na klobouku zůstává v podobě vlnatých šupin (Šutara et al. 2009). 18
U některých klouzků (Suillus) je vyvinuto blanité velum nazývané závoj neboli velum partiale. Nachází se mezi okrajem klobouku a třeněm. V mládí zakrývá rourky. Během dalšího vývoje se postupně roztrhává a jeho zbytky zůstávají na okraji klobouku, až na konec zcela zmizí. Na povrchu třeně zbytky velum partiale zůstávají a vytváří prsten (Šutara et al. 2009). 3.2.8. Charakteristika studovaných rodů Morfologická evoluce a ekologie řádu Boletales zůstává dosud do značné míry neobjasněna. Během vývoje pravděpodobně docházelo k rozsáhlým konvergencím. Na základě analýz bylo potvrzeno, že řád Boletales vytváří monofyletický taxon. V současné době zahrnuje šest skupin: Boletineae, Paxillineae, Sclerodermatineae, Suillineae, Tapinellineae a Coniophorineae. Výsledky získané na základě sekvenčních dat potvrdily skutečnost, že Boletales, Agaricales a Atheliales jsou geneticky příbuzné. Zástupci čeledi Boletales dosáhli pozoruhodné odlišnosti, neboť se vyskytují na různých ekosystémech po celém světě (Binder & Hibbett 2006). 19
Tab. 1: Morfologické znaky řádu Boletales (a) Klobouk [mm] Tvar Barva Rourky Xerocomellus chrysenteron 30 80 klenutý šedohnědá připojené Xerocomellus porosporus 30-65 klenutý šedohnědá připojené Xerocomellus marekii 25-65 klenutý červená stlačené Xerocomellus engelii 30-70 klenutý hnědooranžová připojené Xerocomellus ripariellus 30-65 klenutý krvavě červený připojené Xerocomellus pruinatus 30-90 klenutý načervenale hnědý připojené Xerocomellus rubellus 35-65 klenutý karmínově až tmavě červená připojené Boletus edulis 60-200 klenutý sytě hnědá stlačené Buchwaldoboletus lignicola 30-90 klenutý hnědooranžová sbíhavé Aureoboletus gentilis 20-50 rozložený okrově načervenalá krátce sbíhavé Tylopilus felleus 40-130 klenutý světle hnědá stlačené Xerocomus subtomentosus 40-80 klenutý hnědý až žlutý připojené Xerocomus ferrugineus 40-90 klenutý hnědoolivová stlačené Porphyrellus porphyrosporus 45-100 klenutý šedohnědá připojené Strobilomyces strobilaceus 50-120 klenutý s šupinami šedá, na vrcholcích načernalá připojené Leccinum aurantiacum 50-90 klenutý oranžově červená stlačené Chalciporus piperatus 20-40 klenutý hnědorezavá, měděná připojené Boletus moravicus 30-90 klenutý okrová, naoranžovělá stlačené Boletus badius 30-150 rozložený kaštanově hnědá stlačené 20
Tab. 2: Morfologické znaky řádu Boletales (b) Póry Výtrusný prach Třeň Dužina Xerocomellus chrysenteron hranaté olivově hnědý válcovitý žlutá Xerocomellus porosporus hranaté olivově hnědý válcovitý bělavě nažloutlá Xerocomellus marekii hranaté olivově hnědý zahnutý bledě žlutá Xerocomellus engelii hranaté olivově hnědý válcovitý žlutá Xerocomellus ripariellus hranaté olivově hnědý válcovitý žlutá Xerocomellus pruinatus hranaté olivově hnědý u báze rozšířený žlutá Xerocomellus rubellus hranaté olivově hnědý u báze rozšířený žlutá, na řezu modrá Boletus edulis drobné hnědoolivový soudkově nebo vejčitě břichatý bílá Buchwaldoboletus lignicola mírně protáhlé hnědě olivový až olivový u báze zahnutý bledě krémová Aureoboletus gentilis drobné hnědě olivový na bázi ztenčený bílá Tylopilus felleus drobné světle hnědý kyjovitý bílá Xerocomus subtomentosus hranaté hnědě olivový válcovitý nažloutlá Xerocomus ferrugineus hranaté hnědě olivový válcovitý světle krémová Porphyrellus porphyrosporus drobné hnědý válcovitý bílá Strobilomyces strobilaceus drobné téměř černý kyjovitý bělavá až našedlá Leccinum aurantiacum okrouhlé hnědý v horní části zúžený bílá, na řezu růžová Chalciporus piperatus středně velké světle až středně hnědý štíhlý rezavě krémová Boletus moravicus protáhle hranaté světle hnědý vřetenovitý bledě krémová Boletus badius středně velké olivový soudkovitý bělavá až našedlá 21
Řád Boletales zahrnuje převážně mykorhizní houby, které tvoří ektomykorhizu nebo endomykorhizu, často s velmi úzkou vazbou na jeden nebo několik druhů dřevin. Vyskytuje se zde ale i parazitismu na plodnicích čeledi Sclerodermataceae, popř. dřevní saprotrofismus. Řada patří k výtečným jedlým houbám, některé druhy jsou jedovaté. Celkově se zde řadí 90 rodů a přes 1000 druhů (Kalina & Váňa 2005). 3.3. Molekulárně-biologické metody Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce probíhá v podmínkách in vitro, tedy bez použití buněk. Pomocí této techniky může být rychle a selektivně namnožena konkrétní nukleotidová sekvence obsažená v jakékoli DNA (Alberts et al. 1998). Metodu PCR vyvinul Kary Mullis, který za tuto práci obdržel v roce 1993 Nobelovu cenu za chemii (Snustad & Simons 2009). PCR je založena na využití DNA-polymerázy pro opakované kopírování templátové molekuly DNA. Syntéza DNA je řízena krátkými oligonukleotidy (primery), které se párují s templátovou DNA na počátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové molekuly DNA. Pomocí těchto primerů nasyntetizuje DNA-polymeráza několik miliard kopií požadované sekvence (Alberts et al. 1998). Metoda PCR zahrnuje tři kroky, které se mnohokrát opakují (Snustad & Simons 2009). 1. Oddělení obou řetězců krátkým zvýšením teploty denaturace DNA 2. Ochlazení roztoku v přítomnosti velkého nadbytku obou primerů, které nasedají na obě komplementární sekvence DNA 3. Z obou primerů jsou syntetizovány nové řetězce DNA v přítomnosti DNA-polymerázy (Alberts et al. 1998) Proces se mnohokrát opakuje, dokud není dosaženo požadovaného stupně amplifikace (Snustad & Simons 2009). Ve většině případů se provádí 20 až 30 cyklů. Jako výchozí materiál pro PCR stačí i jediná molekula DNA, nebo jedna molekula mezi miliony jiných. Výběr molekuly k replikaci zajišťuje specifický primer (Nečas et al. 2000). 22
Elektroforéza Elektroforéza je metoda umožňující separaci jednotlivých fragmentů DNA dle velikosti (Alberts et al. 1998). DNA je rozpuštěna v nanášecím pufru o hustotě vyšší než má elektroforetický pufr, takže vzorky DNA klesají na dno, aniž by se v elektroforetickém pufru rozptýlily. Nanášecí pufr obsahuje barvivo pro sledování rychlosti migrace molekul gelem. Ethidium bromid se váže na DNA a fluoreskuje, když je osvícen ultrafialovým světlem (Snustad & Simons 2009). Sekvenování Restrikční fragmenty genové DNA obsahující části genů nebo geny celé mohou být namnoženy v měřitelné množství, např. jejich klonováním nebo polymerázovou řetězovou reakcí. Tím se získá homogenní vzorek DNA, který se dá použít ke zjištění přesného pořadí nukleotidů (Nečas et al. 2000). Pro určení přesné sekvence nukleotidů v úseku DNA byly vynalezeny dvě metody. Metoda Maxamova-Gilbertova využívá různých chemických reakcí ke štěpení řetězců DNA specificky v místě A, G, C nebo C + T (Snustad & Simons 2009). Metoda Sangerova (enzymatická, dideoxy) je založena na syntéze fragmentů DNA, komplementárních k sekvenované DNA. Enzymatická metoda využívá enzym DNA-polymerázu z E. coli k vytvoření kopií sekvenované jednovláknové DNA. Do reakční směsi, která obsahuje jednovláknovou DNA, byla přidána směs všech čtyř deoxyribonukleotidů, DNA-polymeráza, primer a malé množství dideoxyribonukleotidů. Syntéza komplementárního řetězce DNA je ukončena zabudováním dideoxyribonukleotidu. Nový nukleotid už dále nemůže být přidán (Nečas et al. 2000). V současné době jsou všechny větší sekvenace DNA prováděny na automatických sekvenačních přístrojích (sekvenátorech), které používají modifikovanou dideoxy-terminátorovou metodu (Snustad & Simons 2009). 23
4 Praktická část 4.1. Materiál 4.1.1. Biologický materiál Vzorky hub čeledi Morchellaceae pocházely ze sbírky Ing. P. Havránka a doc. V. Ondřeje, vzorky řádu Boletales ze sbírky J. Šutary. Pro srovnání byly použity sekvence z genové banky. 24
Tab. 3: Zástupci čeledi Morchellaceae české a slovenské vzorky Vzorky číslo položky lokalita Ptychoverpa bohemica PIS00000 ČR/Český ráj Ptychoverpa bohemica PTB00000 ČR/Olomouc Ptychoverpa bohemica PB000001 ČR/Praha Ptychoverpa bohemica PB000002 ČR/Olomouc Verpa conica PTU00000 ČR/U Strejčkova lomu Verpa conica PHA00000 SK/NP Šur Morchella esculenta ME000001 ČR/Přerov Morchella semilibera MS000001 ČR/Hradec Králové Morchella semilibera MS000002 ČR/Most Morchella semilibera MS000003 ČR/Dymokury Morchella sp. ME000002 SK/Bratislava Morchella sp. ME000003 ČR/Olomouc Morchella sp. MC000001 ČR/Hostýnské vrchy Morchella sp. MM000001 ČR/Olomouc Morchella sp. MM000002 ČR/Hradec Králové Morchella sp. MM000003 ČR/Olomouc Morchella sp. MM000004 ČR/Sovka Morchella sp. MM000005 ČR/Protivanov Morchella sp. MM000006 ČR/Olomouc Morchella sp. MM000007 ČR/Karlov Morchella sp. MM000008 ČR/Olomouc Morchella sp. MM000009 ČR/Olomouc Morchella sp. MM000010 ČR/Praha Morchella sp. MM000011 ČR/Hradec Králové 25
Tab. 4: Zástupci čeledi Morchellaceae vzorky z genové banky Vzorky číslo položky lokalita Ptychoverpa bohemica AM269502 Německo Ptychoverpa bohemica AJ698479 Německo Ptychoverpa bohemica AJ698479 Německo Verpa conica AJ544205 Německo Verpa conica AJ544204 Německo Morchella crassipes AJ539482 Německo Morchella crassipes AJ539481 Německo Morchella crassipes EF081001 Čína Morchella crassipes FJ860052 Čína Morchella esculenta U0051851 Německo Morchella esculenta DQ257342 Čína Morchella esculenta EU086776 Čína Morchella esculenta AJ543737 Německo Morchella vulgaris AF000971 Francie Morchella spongiola AJ539478 Německo Morchella spongiola AJ539474 Německo Morchella angusticeps AF000970 Francie Morchella angusticeps AJ698476 Německo Morchella angusticeps DQ257335 Čína Morchella conica DQ257343 Čína Morchella conica EF080999 Čína Morchella conica AJ544195 Německo Morchella costata AJ698478 Mexiko Morchella costata EF080998 Čína Morchella elata AJ698477 Německo Morchella elata EF017946 Čína Morchella gigas AJ543742 Německo 26
Tab. 5: Zástupci řádu Boletales Vzorky číslo položky lokalita Xerocomellus chrysenteron 5407 ČR/Jesenická pahorkatina Xerocomellus porosporus 4131 ČR/České Středohoří Xerocomellus marekii 5209 ČR/Severozápadní Čechy Xerocomellus marekii 5329 ČR/Severozápadní Čechy Xerocomellus marekii 5446 ČR/Posázaví Xerocomellu ripariellus 5305 ČR/Lesní brána Xerocomellus pruinatus 4438 ČR/Krušné hory Xerocomellus egelii 5231 ČR/Severozápadní Čechy Xerocomellus egelii 5445 ČR/Severozápadní Čechy Xerocomellus armeniacus 4285 Bulharsko/oblast Černého moře Xerocomellus armeniacus var. luteolus 5223 ČR/Jižní Morava Xerocomellus armeniacus var. luteolus 5285 ČR/Hodonínsko Xerocomellus rubellus 4467 ČR/Východní Čechy Xerocomellus rubellus 4468 ČR/Kněževes "Xerocomellus roztrhankyanus" 5216 ČR/Jižní Morava Xerocomellus roztrhankyanus" 5266 ČR/Hodonínsko Boletus edulis 5451 ČR/Jižní Čechy Buchwaldoboletus lignicola 5447 ČR/Severní Čechy Aureoboletus gentilis 5426 ČR/Polabí Tylopilus felleus 5449 ČR/Jesenická pahorkatina Porphyrellus porphyrosporus 4028 ČR/Západní Čechy Xerocomus subtomentosus 5452 ČR/Severozápadní Čechy Xerocomus ferrugineus 5450 ČR/Jižní Čechy Strobilomyces strobilaceus 5448 ČR/Jesenická pahorkatina Leccinum aurantiacum 4371 ČR/úpatí Krušných hor Chalciporus piperatus 5345 ČR/Krušné hory Boletus moravicus 5260 ČR/Táborsko Boletus badius 5389 ČR/Jesenická pahorkatina 27
Obr. 1: Ověření amplifikace PCR produktů čeledi Morchellaceae Obr. 2: Ověření amplifikace PCR produktů řádu Boletales 28
4.1.2. Chemikálie CTAB: 2 g cetyltrimethylamonium bromidu (CTAB); 1,21 g Tris-base; 0,74 g Na 2 -EDTA; 8,18 g NaCl; 80 ml destilované vody. 5x TBE pufr: 54 g Tris-HCl; 27,5 g kyseliny borité; 20 ml 0,5M disodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA); 1 litr destilované vody; ph 8; na agarózovou elektroforézu ředěno destilovanou vodou na výslednou koncentraci 0,5x. Ostatní chemikálie: chloroform, octan sodný, izopropanol, ethanol, 2-merkaptoethanol, izoamylalkohol, agaróza, ethidium bromide (Serva, Německo), tekutý dusík, destilovaná voda. Komerční kity: FastStart PCR Master (Roche, Německo). 4.1.3. Vybavení Chlazená centrifuga 5804 R (Eppendorf), centrifuga 5415 D (Eppendorf), XP cycler (Bioer), počítač s fotoaparátem (Codak 290), digestoř, elektroforetická aparatura, mikrovlnná trouba, třepačka, mraznička, lednička, nanodrop, váhy, magnetické míchadlo, ph metr, odměrný válec, termoblok, třecí miska, parafilm, centrifugační zkumavky, mikrozkumavky, PCR mikrozkumavky, dávkovací mikropipety, sterilní špičky, ochranné rukavice, skalpel, pinzeta. 4.2. Metody 4.2.1. Izolace DNA Do třecí misky byl vložen vzorek o hmotnosti 200 mg a rozetřen pomocí tloučku v tekutém dusíku. Třecí miska byla vypláchnuta 1 ml CTAB a 2 µm 2-metkaptoethanolu, který byl zahřátý na 65 C. Roztok z třecí misky byl napipetován do 2 ml mikrozkumavky. Inkubace probíhala 1,5 h při 65 C na termobloku. Po inkubaci bylo k roztoku přidáno 600 µl směsi chloroformu a izoamylalkoholu (poměr 24:1). Po promíchání byl roztok centrifugován 15 min v chlazené centrifuze při 4 C a 11 000 otáčkách/min. Horní vrstva byla odebrána a k ní bylo znovu přidáno stejné množství chloroformu a izoamylalkoholu. Tento proces se zopakoval s 60 µl 3 M octanu sodného a 500 µl izopropanolu. Roztok byl pomalým přeléváním promícháván a poté inkubován 29
minimálně 30 min, popř. přes noc v mrazničce při -20 C. Roztok byl centrifugován v chlazené centrifuze při teplotě 4 C a 11 000 otáčkách/min po dobu 30 min. Po centrifugaci se slil supernatant a ke sraženině DNA se přidalo 200 µl 70% etanolu. Opět byla provedena centrifugace při 4 C a 11 000 otáčkách/min. Po centrifugaci se etanol slil a DNA byla rozpuštěna v 200 µl sterilní vody. Vzorky byly zamraženy při -80 C. Koncentrace DNA byla stanovena na přístroji nanodrop. 4.2.2. PCR (polymerázová řetězová reakce) K PCR reakci byly použity primery ITS1 5 - TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 a ITS4 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 (White et al. 1990). Tab. 3: Složení PCR mixu Reakční složky Objemy [µl] FastStart PCR Master mix 10 primer ITS1 o koncentraci 0,16 µm 0,25 primer ITS4 o koncentraci 0,16 µm 0,25 destilovaná sterilní voda 9 DNA o koncentraci 100 ng/µl 0,5 celkový reakční objem 20 Tab. 4: Teplotní profil PCR reakce 1 cyklus počáteční denaturace 95 C 35 cyklů denaturace 95 C hybridizace primerů 55 C prodlužování primerů 72 C 1 cyklus konečné prodloužení primerů 72 C 30
4.2.3. Elektroforéza Na váhách byl navážen 1 g agarózy a pomocí odměrného válce odměřeno 45 ml destilované vody a 5 ml TBE pufru, čímž vznikl 2% roztok. Tato směs se zahřívala v mikrovlnné troubě, dokud nevznikl homogenní roztok. Vzniklý roztok se nechal několik minut odstát, aby došlo k mírnému ochlazení. Poté byly přidány 2 µl ethidium bromidu. Po zamíchání se roztok nalil do předem připravené elektroforetické aparatury a nechal se asi 20 min ztuhnout. Po vložení ztuhlého gelu do TBE pufru byly postupně naneseny vzorky po 2 µl spolu s barvivem. Elektroforéza běžela po dobu 30 min pod napětím 100 V. Po vyjmutí z elektroforetické vany se gel se vzorky vyfotografoval pod UV světlem. 4.2.4. Purifikace PCR produktů a sekvence K rychlému čištění PCR amplifikačních produktů byl použit GenElute PCR Clean-Up Kit (Sigma, USA). Purifikace je dosažena v několika krocích. DNA se váže na křemičité membráně na kolonce. 1. Do předem připravené kolonky se napipetovalo 0,5 ml přípravného roztoku (Column Preparation Solution). Odstředění probíhalo při 12 000 otáčkách po dobu 30 sekund až 1 minuty. Po centrifugaci byl eluát odstraněn. Přípravný roztok maximalizuje navázání DNA na membránu, což zaručuje větší konzistenci výnosu. 2. Do kolonky se přidalo 5 dílů roztoku pro navázání DNA (Binding Solution) a 1 díl PCR reakční směsi. Napipetovalo se 500 µl Binging roztoku a 100 µl PCR reakční směsi. Centrifugace probíhala při 12 000 otáčkách po dobu 1 minuty. Eluát byl odstraněn, ale zkumavky zůstaly zachovány. 3. Do kolonek se naneslo 0,5 ml promývacího roztoku (Wash Solution). Odstředění probíhalo při maximální rychlosti 1 minutu. Po odstranění eluátu zůstávají zkumavky opět zachovány. 4. Dále probíhala centrifugace 2 minuty bez jakéhokoli roztoku, aby došlo k odstranění přebytečného etanolu. Všechen zbývající eluát včetně zkumavek mohl být odstraněn. 5. Kolonky se přenesly do nových 2 ml zkumavek. Aplikovalo se 50 µl elučního roztoku (Elution Solution) přibližně do centra kolonek. 31
6. V konečné fázi probíhala centrifugace maximální rychlostí 1 minutu. Eluát obsahující PCR produkty byl připraven k použití, popř. ke skladování při -20 C. 7. Koncentrace byla změřena v nanodropu. Sekvenování bylo provedeno na Ústavu experimentální botaniky (ÚEB) AV ČR v Olomouci. 32
5 VÝSLEDKY K analýze bylo poskytnuto 32 vzorků hub. Srovnání a výsledky byly doplněny informacemi z genové banky. Po provedení PCR metody byla změřena koncentrace jednotlivých vzorků a provedena gelová elektroforéza. Výsledky sekvenace získané na Ústavu experimentální botaniky (ÚEB) AV ČR v Olomouci byly dále zpracovávány pomocí Bayesianské metody MCMC (Markov Chain Monte Carlo). K tomuto účelu byl použit software Beast 1.4.8. Tato metoda v současné době zaznamenává zvýšení popularity ve vědách jako prostředek pravděpodobnostního závěru (Qian et al. 2003), díky němuž bylo možné sestavit dále uvedené fylogramy. 33
Obr. 3: Fylogram zástupců čeledi Morchellaceae (a) Z obr. 3 je patrné rozdělení vzorků na žluté smrže (Adnatae) a černé smrže (Distantes). Mezi zástupce černých smržů patří Morchella conica, Morchella angusticeps a Morchella elata. Morchella angusticeps je na rozdíl od Morchella conica velmi variabilní. Výsledky ukazují na skutečnost, že černí smrži vytváří dvě geneticky 34
rozdílné skupiny, i přesto, že jejich geografické rozdíly nejsou příliš významné. Morchella esculenta, Morchella crassipes a Morchella spongiola byla vyčleněna v rámci skupiny žlutých smržů. Vyskytují se na spáleništích či jinak narušených půdách, popř. kalamitně na novostavbách. Obr. 4: Fylogram zástupců čeledi Morchellaceae (b) Na obr. 4 jsou zobrazeny výsledky analýzy spolu s daty z genové banky. Rovněž je zde uvedeno místo izolace. Za významnou genetickou odlišnost je považováno více než 95%, což je zvýrazněno. Čeleď Morchellaceae se rozčlenila zprvu na dvě části: Morchella Verpa, Ptychoverpa K prozkoumání a následné genetické analýze byly poskytnuty vzorky z Olomouce, Českého ráje a Slovenska. Na základě sekvenčních dat byly u rodu Ptychoverpa bohemica objeveny dvě geneticky rozdílné skupiny. 35
Obr. 5: Fylogram zástupců řádu Boletales Na obr. 5 je patrné rozčlenění na 3 hlavní fylogenetické skupiny, které zahrnují tyto zástupce: I. Skupina Xerocomellus porosporus, Xerocomellus marekii, Xerocomellus chrysenteron, Xerocomellus pruinatus a Xerocomellus ripariellus 36
II. Skupina Xerocomellus engelii, Xerocomellus rubellus, Xerocomellus armeniacus Podskupina Chalciporus piperatus III. Skupina Aureoboletus gentilis, Boletus moravicus, Xerocomus subtomentosus, Xerocomellus armeniacus var. luteolus, Xerocomellus roztrhankyanus (vzorek neoficiálně pojmenovaný dle Šutary) Výsledky ukazují, že bylo správné vyčlenění rodu Xerocomellus z rodu Xerocomus. Rod Xerocomellus obsahuje dvě geneticky odlišné skupiny. Chalciporus je geneticky bližší rodu Xerocomellus z druhé skupiny, než je tomu v případě skupiny první. Chalciporus tedy spadá do skupiny v rámci rodu Xerocomellus, ale vytváří svoji vlastní podskupinu. Vzorek Boletus moravicus patří pravděpodobně do skupiny Xerocomellus. V případě Xerocomus subtomentosus (DQ131632) došlo k špatnému určení. PCR amplifikace se nezdařila u vzorů Xerocomellus rubellus, Buchwaldoboletus lignicola a Aureoboletus gentilis z důvodu kontaminace DNA inhibitory pocházející ze vzorů. 37
6 DISKUSE V této bakalářské práci byla zkoumána genetická příbuznost čeledi Morchellaceae. Jednotlivé druhy smržů jsou velmi polymorfní, což ztěžuje jejich taxonomické rozlišení (Masaphy et al. 2010). Wipf et al. (1996,1999) se pokusil objasnit systematiku rodu Morchella na základě sekvenčních dat pro ITS regiony jaderné ribozomální DNA (Kellner et al. 2005). Masaphy et al. (2010) a Hansen & Pfister (2006) uvádí rozdílnost mezi Verpa conica a Ptychoverpa bohemica, což se s dosaženými výsledky shoduje. Masaphy et al. (2010) rovněž uvádí příbuznost týkající se dvou rodů, a to Disciotis a Ptychoverpa. Ptychoverpa bohemica je blízce příbuzná s Disciotis venosa (Masapy et al. 2009, Masaphy et al. 2010). Hansen & Pfister (2006) naopak tuto skutečnost popírá. Na základě sekvenčních dat bylo možné smrže rozčlenit na Adnatae (žluté smrže) a Distantes (černé smrže). O Donnell et al. (1997) potvrdil skutečnost, že čeleď Morchellaceae vytváří monofyletický taxon (Kellner et al. 2005). Ze získaných dat došlo k vyčlenění dvou skupin zahrnující Morchella angusticeps a Morchella conica patřící mezi černé smrže. Pilz et al. (2007) k této skupině zařazuje ještě M. elata, která je ale geneticky příbuzná s M. angusticeps, což se shoduje s předloženými výsledky. Adnatae zahrnuje M. spongiola, M. crassipes, M. esculenta (Ondřej et al. 2011), což potvrzuje obr. 3. Ke stejným závěrům dospěl i Kellner et al. (2005). Pilz et al. (2007) k žlutým smržům řadí dále tyto zástupce: M. deliciosa, M. rufobrunnea, M. guatemalensis, M. herediana a rovněž M. esculenta. Binder & Hibbett (2006) dospěli k závěru, že řád Boletales tvoří monofyletický taxon, čemuž odpovídají i předchozí studie (Binder a Bresinsky 2002a, Bruns et al. 1988, Grubisha et al. 2001, Jarosch 2001, Kretzer and Bruns 1999). I přesto, že se zlepšilo celkové rozlišení hlavních skupin Boletales, stále není možné odpovědět na všechny otázky týkající se sesterských vztahů (Binder & Hibbet 2006). Dentinger et al. (2010) rozlišuje skupinu zahrnující rody Boletus, Tylopilus, Porphyrellus a Xerocomus. Dentinger et al. (2010) uvádí bližší příbuznost rodů Boletus a Porphyrellus. Šutara el al. (2009) vyčlenil rod Xerocomellus z rodu Xerocomus, což genetická analýza prokázala. Rod Chalciporus je geneticky příbuzný s rodem Xerocomellus, ale vytváří vlastní podskupinu. 38
7 ZÁVĚR V této práci byly pomocí molekulárně-biologických metod charakterizovány fylogenetická vztahy vybraných zástupců hub. Na základě sekvenčních dat ITS regionů došlo k vyčlenění smržů na Adnatae (žluté smrže) a Distantes (černé smrže). Mezi černé smrže patří Morchella conica, Morchella angusticeps a Morchella elata. U rodu Ptychoverpa bohemica byly objeveny dvě geneticky rozdílné skupiny. Rod Xerocomellus se vyčlenil z rodu Xerocomus. Součástí rodu Xerocomellus je rod Chalciporus, který vytváří vlastní podskupinu. 39
8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Alberts B., Johnson L. & Walter R. R. (1998): Základy buněčné biologie. - Vydavatelství Espero Publishing, Ústí nad Labem. Antonín V. & Hagara, L. (2005): Velký atlas hub. - Vydavatelství Ottovo, Praha. Antonín V. (2006): Encyklopedie hub a lišejníků. - Vydavatelství Libri, Praha. Binder M. & Hibbett D. S. (2006): Molecular systematics and biological diversification of Boletales. - Mycologia, 98 (6): 971-981. Buscot F., Wipf D., Di Battista C., Munch J., Botton B. & Martin F. (1996): DNA polymorphism in morels: PCR/RFLP analysis of the ribosomal spacers and microsatellite-primed PCR. - Mycol. Res. 100 (1): 63-71. Hagara L. (1993): Atlas hub. - Vydavatelství Neografia, Martin. Hansen K. & Pfister D. H. (2006): Systematics of the Pezizomycetes - the operculate discomycetes. - Mycologia, 98 (6): 1029-1040. Kalina T. & Váňa J. (2005): Sinice, řasy, houby, mechorosty a podobné organismy v současné biologii. - Vydavatelství Karolinum, Praha. Kellner H., Renker C. & Buscot F. (2005): Species diversity within the Morchella esculenta group (Ascomycota: Morchellaceae) in Germany and France. - Organism, Diversity & Evolution 5 101-107. Masaphy S., Zabari L. & Goldber D. (2009): New long-season ekotype of Morchella rufobrunnea from northern Israel. - Micologia Aplicada Inernational, 21 (2): 45-55. Masaphy S., Zabari L., Goldberg D. & Jander-Shagug G. (2010): The komplexity of Morchella Systematics: A Case of the Yellow Morel from Israel. - FUNGI Volume 3:2. Nečas O., Svoboda A., Hejtmánek M., Janisch R., Červinka M., Lenhart K. & Kolář Z. (2000): Obecná biologie pro lékařské fakulty. - Vydavatelství H&H, Jihlava. Ondřej V., Havránek P., Kitner M. & Němcová P. (2011): Molecular identification and charactization of the edible and medicinbal Morchellaceae germplasm collection of mulch morels. - Int J Med Mushrooms, 13 (4): 369-375. Pilz D., McLain R., Villrreal-Ruiz L., Berch S., Wurtz T. L., Parks C. G., McFarlane E., Baker B., Molina R. & Smith J. E. (2007): Ecology and Management of Morels Harvested From the Forests of Western North America. - General Technical report PNW-GRT-710. Quian S. S., Stow C. A. & Borsuk M. E. (2003): On Monte Carlo methods for Bayesian interference. - Ecological Modelling 159 269-277. 40