Mendlova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat

Mendlova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Vyhodnocení kvalitativních parametrů inseminační dávky skotu při různých způsobech její přípravy Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Radek Filipčík, Ph.D. Vypracovala: Bc.Šárka Hanuláková Brno 2011

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Vyhodnocení kvalitativních parametrů inseminační dávky skotu při různých způsobech její přípravy vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne... podpis diplomanta...

PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu své diplomové práce Ing. Radkovi Filipčíkovi, Ph.D, za pomoc a odborné vedení při vypracování této diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Lucii Jarinkovičové za velkou pomoc v laboratoři i cenné rady a paní Heleně Divinové za pomoc při zpracování vzorků.

ABSTRAKT Předmětem této práce bylo srovnání 3 rozdílných způsobů přípravy inseminační dávky. Experiment byl proveden u 50 inseminačních dávek získaných od pěti plemenných býků českého strakatého plemene skotu. Inseminační dávky byly připraveny různým způsobem - rozmražení dávky ve vodní lázni a její následné 5 minutové vystavení teplotě 0 C, rozmražení pejety teplem působícím v sevřené dlani po dobu 15 s a příprava dávky standardní metodou ve vodní lázni. Hodnotila se aktivita ve 4 časech (t = 0, t = 15 min, t = 30 min, t = 60 min). Nejvyšší procento aktivních spermií bylo zjištěno u standardní metody přípravy ID (32,9 %). Procento aktivních spermií po rozmražení dávky a ponechání v chladu činilo 31,3 %. Jako chybná se ukázala metoda rozmražení v dlani, kde byla aktivita spermií pouze 23,8 %. Při hodnocení aktivity po 15 minutách došlo u všech tří metod k poklesu počtu aktivních spermií. Po 30 minutách byly zjištěny téměř srovnatelné hodnoty jako v případě hodnocení aktivity spermií ihned po rozmražení inseminační dávky. Po 60 minutách byl počet aktivních spermií nejvyšší. Druhou částí experimentu bylo hodnocení morfologických změn. Při hodnocení morfologie byly zaznamenány zejména vyšší hodnoty patomorfologických změn na bičících. ABSTRACT The objective of this study was to compare three different methods preparation of insemination dose. The experiment was performed in 50 insemination doses obtained from five bulls of Czech Fleckvieh. Insemination doses were prepared by different methods the thawing of insemination doses in water bath and the subsequent 5 min exposure to 0 C, the second method was the thawing of insemination dose in warm palm and the third method was standard preparation of insemination doses. The activity was evaluated at 4 times (t = 0, t = 15 min, t = 30 min, t = 60 min). The highest percentage of sperm activity was found in the standard method of insemination doses preparation (32,9 %). The percentage of sperm activity after standard thawing and cooling in a fridge was 31,3 %. The worst method was the thawing of insemination doses in the palm. The activity was only 23,8 %. After 15 minutes the activity decreased in all three methods. After 30 minutes the values were simile to those found in the time t = 0. The highest sperm aktivity was found after 60 minutes.. The second part of this experiment was patomorfologic evaluation. It showed especially higher values of patomorfological changes of flagella.

OBSAH 1 ÚVOD...7 2 CÍL PRÁCE...9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED...10 3.1 Biologie býčího spermatu...10 3.1.1 Spermie a její morfologická skladba...10 3.2 Metabolismus spermií...16 3.2.1 Glykolýza...17 3.2.2 Respirace...18 3.3 Motilita spermií...20 3.4 Hodnocení býčího ejakulátu...21 3.4.1 Laboratorní metody určené k vyšetření ejakulátu...22 3.4.2 Morfologické vyšetření ejakulátu...25 3.5 Inseminační dávka...33 3.5.1 Kryokonzervace...33 3.5.1.1 Ředění ejakulátu...35 3.5.1.2 Dlouhodobá konzervace ejakulátu býků...36 4 MATERIÁL A METODIKA...37 4.1 Materiál...37 4.2 Metodika...40 4.2.1 Způsoby přípravy inseminační dávky...40 4.2.1.1 Standardní metoda rozmražení inseminační dávky...40 4.2.1.2 Metoda rozmražení inseminační dávky v dlani...40 4.2.1.3 Metoda 5 min ponechání inseminační dávky při 0 ºC...41 4.2.2 Hodnocení aktivity spermií po rozmražení...41 4.2.3 Barvení spermatu...42 4.2.3.1 Barvení spermatu dle B.T. FARELLYHO...42

4.2.4 Morfologické vyšetření spermatu...42 5 VÝSLEDKY A DISKUZE...44 5.1 Hodnocení aktivity...44 5.2 Patomorfologické hodnocení ejakulátu...53 6 ZÁVĚR...61 7 LITERÁRNÍ PŘEHLED...63

1 ÚVOD Kvalitu plemenného býka nelze vidět jen v plemenné hodnotě, ale také v kvalitě reprodukčních funkcí, které limitují využitelnost i u plemenářsky špičkového samce. O genofond špičkových plemeníků je obrovský zájem a je tedy snahou, aby byli tito plemeníci maximálně využíváni (VĚŽNÍK et al., 2004). Aby mohl být maximálně využit potenciál špičkových plemenných býků, byla do praxe zavedena jedna z nejprogresivnějších metod šlechtění skotu inseminace. Inseminace řídí reprodukční proces a je podmínkou pro masový rozvoj kontroly dědičnosti. Zpětně umožňuje maximální využití nejlépe prověřených plemenných býků v připařování. Při jejím rozšíření lze úspěšně realizovat ústřední plemenářské programy v chovu skotu a podstatně zkrátit cestu k chovnému cíli s možností akcelerace selekčního programu. K rozhodující kvalitativní změně ve využití inseminace došlo však teprve po úspěšném vývoji metod kryokonzervace a dlouhodobého uchování býčího spermatu v prostředí tekutého dusíku a jejím zavedení do široké praxe. Tato technologie otevřela cestu k realizaci zásadních, vpravdě revolučních změn šlechtitelských postupů, umožnila využít optimálně všechny aktuální poznatky genetiky populací a kvantitativních vlastností a zkoncentrovat je do podoby komplexních a vysoce účinných šlechtitelských programů (PETELÍKOVÁ et al., 1998). Inseminace také umožňuje efektivně a racionálně uskutečňovat kontrolu dědičnosti plemeníků podle potomstva. Inseminací se zvyšuje intenzita selekce a selekční tlak, které sehráli významnou úlohu při genetickém pokroku plemen i v minulém období (KADLEČÍK, KASARDA, 2007). Umělé oplodnění je nejvíce používanou metodou genetického inženýrství v chovu skotu. Hlavními výhodami této technologie jsou potenciální genetické zisky, možnost tlumení chorob, bezpečnost a efektivnost nákladů. Umělé oplodnění také poskytuje flexibilitu, ale zahrnuje několik postupných kroků včetně odběru spermatu, jeho zpracování a skladování, zavedení potenciálně plodné spermie do pohlavního ústrojí samice ve správnou dobu a nakonec přísné hodnocení úspěšnosti celého procesu (GARNER, 1991). 7

ŘÍHA et al. (1999) k tomu doplňuje, že vývoj technologie inseminace se nezastavil. Jsou neustále zdokonalovány metody konzervace spermatu. Jsou rovněž vyvíjeny nové vyšetřovací metody spermatu, které by na základě testům vitro pomáhaly určit oplozovací schopnost spermií in vivo. Perfektní zvládnutí procesu kapacitace a akrozomální reakce býčích spermií, jejich penetrace zonou pellucidou a oplození oocytů plemenic skotu v přesně definovaných laboratorních podmínkách dává naději, že v nedaleké budoucnosti bude rozšířeno spektrum vyšetřovacích metod kvality spermatu o nové postupy, převážně biologického charakteru. 8

2 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo zhodnotit vliv různého způsobu přípravy inseminační dávky na morfologické vlastnosti a aktivitu spermií po rozmražení. Cílem bylo určit, které způsoby negativně ovlivní parametry spermatu a nejsou proto vhodné pro běžné používání v praxi. 9

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Biologie býčího spermatu KLIMENT et al. (1989) popisuje ejakulát jako výměšek pohlavních žláz, který se skládá ze spermií a semenné plazmy. Jeho kvalita záleží na úrovni výživy a výživou ovlivněném metabolismu. Dále uvádí, že se vlastnosti spermatu druhově značně liší, zejména jeho biochemické složení. Z formovaných elementů obsahuje ejakulát kromě spermií ještě odloupané epitelie, leukocyty aj. Největší podíl ejakulátu tvoří voda (90 98 % celkové váhy), z anorganických látek obsahuje sodík, draslík, chlór, fosfor, vápník, síru aj., z organických látek bílkoviny, tuky, cukry a některé fermenty. Chemické složení ejakulátu, jeho množství, koncentrace spermií a jejich životnost jsou závislé na mnoha činitelích, jako je stav výživy, stáří, ustájení, pohyb, pohlavní využití samce aj. (KOMÁREK et al., 1964). Podle MARVANA et al. (2003) se všichni přežvýkavci vyznačují všeobecně malým objemem ejakulátu s velkou koncentrací spermií. 3.1.1 Spermie a její morfologická skladba Spermie tvoří nejdůležitější složku ejakulátu. Jejich velikost a tvar jsou druhově rozdílné. Společným hlavním znakem je pohyblivost a schopnost oplození (JELÍNEK, KOUDELKA et al., 2003). Spermie svou morfologickou stavbou představují buňky připravené k samostatnému životu a cílené funkci. Přenos genetické informace tvoří jádro, které se transformuje strukturálně i tvarově v průběhu spermatheliózy a svým konečným vzezřením udává v podstatě i tvar hlavičky spermie. Doprovodné části jádra spermie, umožňující cílenou funkci pro uplatnění DNA, jsou transformované organely z cytoplazmy spermatid (VĚŽNÍK et al., 2004). GAMČÍK, KOZUMLÍK et al. (1992) doplňují, že spermie má při oplodnění splnit tři základní úlohy: musí aktivně vyhledat vajíčko, proniknout do něho a předat genetickou informaci od otce. Jakmile je porušena jedna z těchto funkcí, nedojde k oplodnění vajíčka. 10

Hlavička spermie Hlavička spermie je 5 10 µm dlouhá a její utváření u jednotlivých druhů je rozdílné. Je ze stran oploštělá, oválného tvaru a její přední část je krytá čepičkou (akrozomem), která je dobře barvitelná. Akrozom je složen z mukopolysacharidů a obsahuje četné enzymy uplatňující se při pronikání spermie do vajíčka a jeho oplození. Hlavičku tvoří především jádro s kondenzovaným chromatinem a obsahujícím deoxyribonukleovou kyselinu nesoucí genetické informace pro vlastnosti nového jedince (JELÍNEK, KOUDELKA et al., 2003). Podle VĚŽNÍKA (2000) se kategorie zbobtnání akrozomu projevila jako významný ukazatel rezistence membránového systému spermií při krátkodobých i dlouhodobých testech. VĚŽNÍK et al. (2004) k tomu dodává, že vnější a vnitřní list akrozomové čepičky tvoří při své bázi intimní spojení obou listů se sníženým obsahem akrozomální hmoty, takže se jeví při barvení jako světlejší a označuje se ekvatoriální segment. Dlouhá osa akrozomu k dlouhé ose hlavičky je rozdílná u jednotlivých druhů zvířat. U býka pokrývá akrozom 52 % dlouhé osy hlavičky spermie. Dále uvádí, že hlavička spermie je ve své posteriorní části tvořena kalíškem jádra. Tento útvar je představován tmelovým materiálem spojujícím jadernou membránu s membránou cytoplazmatickou a vytvářející tak pevnější strukturu, více odolnou než je struktura akrozomu. Membrány anteriorní části hlavičky se podílí na procesu kapacitace a aktivace akrozomálních zymogenů v enzymy především s proteolytickým účinkem funkčně podobným trypsinu. Membrána v postakrozomální oblasti, tedy především v horní části kalíšku jádra se zúčastní fůze spermie s vajíčkem a hraje i úlohu při jeho detekci. Celou hlavičku kryje cytoplazmatická membrána a její integrita je podmínkou rezistence buněk. Na bazální části hlavičky je konkávní vchlípení tzv. implantační rýha, do níž je vklíněna hlavice bičíku. Boční ohraničení implantační rýhy je tvořeno bazálními granuly, která představují fibrilárně uspořádaný chromatin. 11

Bičík spermie Bičík spermie je 50 70 µm dlouhý a představuje pohybové ústrojí spermie. Bičík je spojen s hlavičkou krčkem (centriolovou částí). Bičík spermie je tvořen spojovacím oddílem, hlavním oddílem, a koncovým (terminálním) oddílem (JELÍNEK, KOUDELKA et al., 2003). Hlavice bičíku je vytvořena z proximálního centriolu, který dá vznik implantační ploténce a z přední části distálního centriolu, který dá základ tvorby bičíku. Vzniklá segmentovaná chorda svým tvarem představuje rozšířenou hlavici bičíku a svým zúžením, které vystupuje z implantační jamky, se pevně přikládá k hladkým chordám, kterých je 9 obdobně jako filament centriolového válce a které tvoří chordový obal komplexu osových vláken. Tyto útvary, jak bylo řečeno, vznikají z přední části distálního centriolu, a proto je označován též jako flagelotvorný nebo axonemogenní. Axonema, nebo soubor osových vláken je tvořen dvěma ústředními mikrotubuly, okolo kterých je uspořádáno 9 párů vláken označovaných za dublety, složených z elementu A a elementu B, přičemž A je vlákno plné a B je tvořeno mikrotubulem. Z každého elementu A vystupují dvě styčná ramena k elementu B sousední dublety. Raménka tvoří peptidy (dynein) s ATPázovou aktivitou a takto uvolněná energie je transformovaná do bílkovin (tubuliny) kontraktilních vláken. V průběhu tohoto procesu dochází k prodlužování a zkracování molekulárního uspořádání těchto bílkovin, čímž dochází k přenosům prostorových sil a pohybu bičíku (VĚŽNÍK et al., 2004). Spojovací (mitochondriální) oddíl bičíku navazuje na centriolový oddíl. Je charakterizován přítomností značného podílu mitochondrií. Počet mitochondrií na spojovacím oddílu bičíku se u býka pohybuje kolem 90 kusů (JELÍNEK, KOUDELKA et al., 2003). VĚŽNÍK et al. (2004) k tomu doplňuje, že jedna mitochondrie tvoří cca tři čtvrtiny závitu. Mitochondrie tvoří závitnici o 70 80 závitech s pravotočivým směrem vinutí. KLIMENT et al. (1989) naopak uvádí, že na mitochondriálním oddílu je osové vlákno obalené levotočivě spirálovitě probíhajícím vláknem, tzv. mitochondriální membránou, která tvoří respirační aparát spermie. K mitochondriím dodává, že jsou široké asi 0,12 µm a dlouhé 1,3 µm. Jejích objem je přibližně 1,359 µm 3 a celková plocha 44,5 µm 2. Mitochondriální membrány, které tvoří součást membránového systému spermie, jsou stejně jako celý bičík kryty povrchovou membránou, která má však odlišnou antigenní strukturu od membrány hlavičky spermie. Zatímco hlavička spermie má plazmatickou 12

membránu původní spermatidy, bičík po penetraci a jeho morfologickém dotváření má povrchovou membránu sestavenou de novo. Zakončení spojovací části bičíku je přesně vymezeno prstencovým trojbokým útvarem o vyšší elektronoptické denzitně, který se připisuje druhé části rozděleného distálního centriolu (VĚŽNÍK et al., 2004). Hlavní oddíl bičíku je nejdelší části nejen bičíku, ale i celé spermie vůbec. V porovnání s mitochondriálním oddílem je hlavní oddíl tenčí. Jeho podkladem je komplex osových vláken (GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al., 1992). Hlavní část nemá výrazné rozdíly ve stavbě, ale je kryta zajímavou fibrózní pochvou. Tento útvar je složen ze dvou longitudálních elementů probíhajících paralelně s osovými vlákny. Z těchto elementů vybíhá oběma směry řada ramen obepínajících osová vlákna a hladké chory. Fibrózní pochva je nejen útvarem strukturálně podporujícím skladbu bičíku, ale svou tvarovou pamětí napomáhá pružnosti bičíku při jeho kmitavém a rotačním pohybu (VĚŽNÍK et al., 2004). Koncový oddíl bičíku měří cca 4 µm a je tvořen pouze osovým vláknem bez chord a fibrózní pochvy (JELÍNEK, KOUDELKA et al. 2003). GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al. (1992) doplňují, že v druhé polovině koncového oddílu jedna z dvojice mikrotubulů zaniká. Přítomné jsou pouze jednoduché mikrotubuly. Jejich počet a uspořádání nejsou konstantní. Celá spermie je pokryta nepřerušovanou dvouvrstevnou cytoplazmatickou membránou, která představuje základní ochranu spermie. Je acidorezistentní, vysoce permeabilní a citlivá na změny osmotického tlaku. Permeabilita membrány umožňuje látkovou výměnu spermií. Na základě poznatku, že cytoplazmatická membrána u živých spermií nepropouští některá barviva (eozin, fluorochromy), a že se permeabilita zvýší u mrtvých spermií, byla vypracována metoda vitálně letálního barvení, umožňující rozlišovat živé a mrtvé spermie. Poškození permeability membrán může nastat při dlouhodobé konzervaci spermií a stát se tak příčinou snížené oplozovací schopnosti spermií (JELÍNEK, KOUDELKA et al., 2003). Ultrastruktura s popisem jednotlivých částí celé spermie je vyobrazena na obr.1. 13

Obr. 1: Ultrastruktura spermie (BART a OKO, 1989, upraveno) 14

Semenná plazma Podle SETCHELLA (1991) je plazma fluidní část spermatu po odstranění spermií centrifugací nebo filtrací. Plazma obsahuje množství látek, které nejsou obvykle nacházeny ve zvířecím organismu a jiné, které jsou v mnohem větších koncentracích než kdekoliv jinde v těle. Mnoho z těchto látek je více spojováno s rostlinným organismem než s živočišným. JELÍNEK, KOUDELKA et al. (2003) uvádí, že obsahuje převážně sekrety přídatných pohlavních žláz. Je to tekutina druhově specifického množství a barvy, rozdílného ph (6,2 7,5) a konzistence. Představuje přirozené prostředí pro spermie, umožňuje jejich výživu a transport v pohlavních orgánech samice. Má relativně stálý osmotický tlak a vyznačuje se velkými pufračními schopnostmi. Obsahuje minerální látky, bílkoviny, cukry, kyselinu citrónovou a askorbovou, četné enzymy a kromě dalších látek i biologicky aktivní složky jako jsou prostaglandiny, estrogeny a androgeny. Podíl semenné plazmy na celkovém objemu ejakulátu je rozdílný. Stejně tak je i rozdílný podíl sekretu jednotlivých přídatných pohlavních žláz na celkovém objemu ejakulátu. U býka činní podíl semenné plazmy 90 %. Plazma rovněž stimuluje pohyb spermií. GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al. (1992) ve své práci uvádí, že se na tvorbě semenné plazmy podílí nadvarle, chámovod, ampule chámovodu, uretrální žlázy, prostata, semenné váčky, Cowperovy žlázy i látky z tekutiny zajišťující transport spermií z varlete do nadvarlete. Sekret nadvarlat je charakteristický vysokou koncentrací vodíkových iontů (ph 5,6 6,6), draslíku a oxidu uhličitého a nízkou koncentrací chloridových iontů, sodíku a zvláště kyseliny citrónové a fruktózy. Tato skutečnost a nižší teplota v nadvarleti udržují u spermií stav anabiózy a oplozovací schopnost i déle než 1 měsíc. Sekret ampulí chámovodu má ph 6 6,5, obsahuje značné množství fruktózy a má vysokou koncentraci kyseliny citrónové. Sekret uretrálních žláz je u všech zvířat více nebo méně alkalický ( ph 7,2-8,5). Upravuje ph uretry, a proto je vylučován v rámci předspermiové frakce, i když často kontaminován již sekrety jiných přídatných pohlavních žláz. Sekret cowperovy žlázy je převážně vypuzován na konci ejakulace a vytváří vaginální zátku v děložním krčku, která brání zpětnému výtoku spermatu. Sekret prostaty je chemicky velmi pestrý. U zvířat s velkým objemem ejakulátu se podílí na 25 až 30 % na celkovém objemu. Je dále charakteristický vysokým obsahem zinku. 15

MARVAN et al. (2003) upřesňuje, že u přežvýkavců je sperma vypuzeno na konci pohlavního aktu jednorázovou ejakulací, kterou předchází vyloučení sekretu bulbouretrálních žláz, který upravuje ph močové trubice. Větší část semenné plazmy tvoří přitom výměšek měchýřkovitých žláz a žláz močové trubice, zatímco podíl sekretu prostaty je poměrně malý. Pro funkční hodnocení spermií je důležité posouzení semenné plazmy jako prostředí, ve kterém se odehrávají veškeré jejich životní pochody (VĚŽNÍK et al., 2000). 3.2 Metabolismus spermií Metabolická aktivita spermií zajišťuje energii, která je utilizována v mechanickém efektu motilitě spermií. Převážná část energie je oxidacemi uvolňována v mitochondriích, v buňce je však spotřebována na různých funkčních místech, u spermií v dubletovém systému bičíku. Jsou dva hlavní metabolické procesy, kterými získávají spermie energii fruktolýza a respirace. Při anaerobním štěpení glukózy vzniká oxidací kyselina pyrohroznová, která přechází dále do reakčního cyklu cyklu trikarbonátových kyselin (Krebsův cyklus). Během tohoto procesu dochází k dalším dehydrogenacím a dekarboxylacím. Zatím co anaerobní štěpení glukózy nemá vyhraněnou buněčnou lokalizaci, jsou buněčné oxidace specificky vázány na strukturu mitochondrií. Oxidace substrátu probíhá postupně postupnou oxidací vodíku řetězcem oxidoredukčních reakcí, které jsou katalyzovány řadou enzymů (VĚŽNÍK et al., 2004). GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al. (1976) dodávají, že zdrojem metabolické energie spermií je především fruktóza, dále kyselina mléčná, intracelulární plazmalogen a další látky, které spermie savců čerpají převážně z prostředí, které je obklopuje, tzn. ze semenné plazmy apod. Energii mohou spermie získávat také oxidací intracelulárních látek (plazmalogenu). Byla však vyslovena domněnka, že k oxidaci intracelulárních látek dochází jen v případech, kdy v prostředí chybějí jiné metabolické zdroje, především cukry, které jsou za aerobních podmínek hlavním pramenem energie z okolního prostředí. Energie uvolňovaná při odbourávání fosforylovaných cukrů se kumuluje v makroenergetických vazbách adenosintrifosfátu (ATP). Pouze 40 % volné energie, která se může uvolnit při přeměně glukózy na kyselinu mléčnou, může být spermiemi využita. Při nedostatku exogenních zdrojů mohou spermie získávat energii pouze oxidací vnitrobuněčných 16

energetických zdrojů (endogenní dýchání). Ztráta energetických zdrojů je rychlá, a proto musí spermie využívat i glycidy, kyselinu mléčnou a plazmalogen v uterinním prostředí, jinak by nemohly uskutečnit proces dekapacitace. Při biochemické neadekvátnosti uterinního prostředí (např. nízká hladiny glukózy u vysokoužitkových krav v poporodním období) se podstatně snižuje doba přežitelnosti spermií v samičím pohlavním ústrojí (KLIMENT et al., 1989). 3.2.1 Glykolýza Je proces, ve kterém spermie býka metabolizují z monosacharidů především glukózu, fruktózu a manózu, z disacharidů maltózu a z polysacharidů v menší míře glykogen viz obr.2. Za anaerobních podmínek je fruktóza rozkládána spermiemi býka enzymy až na kyselinu mléčnou (GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al., 1976). KARLSON (1971) k tomu doplňuje, že také aerobní metabolismus probíhá přes četné stupně glykolýzy a liší se vlastně jen upotřebením redukovaných koenzymů a kyseliny pyrohroznové. Hromadění kyseliny mléčné však způsobuje pokles ph, což vede ke zpomalení a nakonec prakticky až k zastavení glykolýzy a tím ke ztrátě pohybu spermií. Zabrání-li se vzniku příliš vysoké acidity vhodným pufrem, probíhá fruktolýza téměř lineárně, až je prakticky spotřebován veškerý cukr. Spotřeba fruktózy je v průměru uváděna 2 mg/10 9 pohyblivých spermií za hodinu při 37 C. Protože spotřeba fruktózy je úměrná koncentraci a životnosti spermií, je této skutečnosti využíváno jako měřítka motility a životnosti spermií. Glykolytická aktivita spermií se tedy může stanovit podle úbytku cukrů (fotometricky), ale také podle přírůstků kyseliny mléčné (GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al., 1976). 17

Obr. 2: Glykolýza (www.biochem.arizona.edu) SALISBURY a DEMARK (1961) doplňují, že i když je už nějakou dobu známé, že savčí spermie mimo tělo potřebuje ke svému životu redukující cukr obsažený v semenné plazmě, Randez byl pravděpodobně první kdo dokázal, že v anaerobních podmínkách byl substrát s glukózou nezbytný pro udržení životnosti spermie. Spermie bez styku se semennou plazmou rychle umíraly vlivem N 2 pokud nebylo použito anorganického minerálního ředidla s přidanou glukózou. 3.2.2 Respirace Respirace je pochod, při kterém jsou spermie schopny za přítomnosti kyslíku získat energii přeměnou kyseliny mléčné nebo již kyseliny pyrohroznové za vzniku CO 2 a H 2 O (exogenní dýchání). Za přítomnosti kyslíku vstupuje kyselina mléčná do Krebsova cyklu (viz obr.3) trikarbonových kyselin a nehromadí se v prostředí. Za přítomnosti kyslíku mohou spermie získávat energii i oxidací intarcelulárního rezervního materiálu (endogenní dýchání). Dochází-li k aerobnímu metabolismu cukrů od samého začátku, nevzniká kyselina mléčná, ale 18

reakce jde obecně jinou cestou. Při respiraci se vytvoří asi 38 nových markroenergetických fosfátových vazeb a to představuje asi 60 % z celkové volné energie, která se může získat úplným spálením cukru. Proces respirace je asi 19krát efektivnější než anaerobní glykolýza (GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al., 1992). Obr. 3: Krebsův cyklus (www.patf-biokyb.lf1.cuni.cz) 19

3.3 Motilita spermií Motilita spermií, její posouzení a kvalitativní hodnocení, patří mezi nejdůležitější metody vyšetření ejakulátu. Neoddělitelným atributem pohyblivosti je i rychlost pohybu spermií. Proto jsou tyto dvě veličiny většinou zkoumány současně. Rychlost pohybu spermií je citlivým ukazatelem, který dovoluje časně posoudit nastupující vitální degradaci ejakulátu. Většina autorů považuje progresivní pohyb spermií za významný ukazatel pro odhad fertilizační schopnosti semene. Z hlediska funkčního je pohyb spermií nutnou podmínkou jejich průniku do vaječné buňky. Proto je připravenost energie (ATP) výměnou látkovou základní potřebou buněčné vybavenosti každé spermie. Všechny faktory ovlivňující motilitu spermií, ovlivňují i výměnu látkovou a naopak. Při všech formách pohybu biologických organismů spočívá základ v převodu chemické energie v mechanickou. Z toho je zřejmé, že ve svém principu jsou shodné, i když ve svém působení mohou být funkčně odlišné. Efektorem tohoto děje jsou kontraktilní proteiny, které jsou schopny buďto samy nebo spolu s aktivními komponentami využívat ATPázovou aktivitu k získání energie. Dýchací řetězce zabezpečující výměnu látkovou k tvorbě ATP jsou lokalizovány ve vnitřní mitochondriální membráně. V matrix mitochondrií jsou lokalizovány enzymatické systémy cyklu kyseliny citrónové. Úroveň oxido-redukčních aktivit mitochondrií je ukazatelem potenciální energetické zásoby spermií (VĚŽNÍK et al., 2004). KLIMENT et al. (1989) upřesňuje, že pro pohyb spermií, je nezbytný ATP, ale rezervy v buňce vystačí sotva na 30 s pohybu, proto tvorba ATP musí být nepřetržitá. GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al. (1992) dodává, že mechanismus přenosu energie není dosud přesně znám. Předpokládá se, že při hydrolýze adenozintrifosfátu je uvolněná energie transformována do bílkovin kontraktilních vláken bičíku spermie. V průběhu tohoto procesu dochází k prodlužování a zkracování molekulárního uspořádání těchto bílkovin, čímž je vyvolán pohyb bičíku. Hlavička spermie se na metabolických procesech nepodílí. Podle GARNERA (1991) je schopnost pohybu spermií jednou z jejich nejunikátnějších vlastností. Klasické hodnocení motility zahrnuje jak hodnocení procenta motilních spermií, tak i rychlost progresivního pohybu. Přesnost při hodnocení motility vyžaduje pečlivou kontrolu teploty spermatu během přípravy a hodnocení. 20

Zralé a integritní spermie se prezentují v ejakulátu pohybem, který označujeme jako souosý dopředný progresivní. Aktivita bičíku orientuje pohyb spermie za hlavičkou. V ejakulátu je pohyb spermií nahodilý, neorientovaný. Spermie se velmi rychle přesměrují v případě, že vznikne proudění tekutiny. Rychlost proudění tekutiny ovlivňuje též rychlost pohybu spermií. Při svém pohybu rotují spermie kolem své osy s frekvencí 3 15 otáček za sekundu. U alterovaných spermií postupně mizí rotace a pohyb se stává plochý, přičemž se přímočarý pohyb mění v kruhový (VĚŽNÍK et al., 2004). LOUDA et al. (2001) doplňuje, že s prodlužující se dobou po odběru dochází u ejakulátu k tzv. vitální degeneraci spermií, při které se rychlost přímočarého pohybu zpomaluje a tento se mění na pohyb kruhový, postupně následuje pohyb přerušovaný a trhavý, později pohyb ustává. Progresivní pohyb vpřed za hlavičkou je jedním z nejvýznamnějších ukazatelů oplozovací schopnosti čerstvého ejakulátu. Hodnotí se charakter pohybu, určuje se směr a rozsah kmitů hlavičky spermie. Přímý progresivní pohyb spermií je znakem jejich funkční plnohodnotnosti a vyjadřuje se v procentech. U ejakulátu určených k přímé inseminaci nebo určených ke konzervaci se požaduje minimální aktivita 70 % (LOUDA et al., 2001). 3.4 Hodnocení býčího ejakulátu V provozu inseminačních stanic je nezbytné zajištění pravidelné kontroly kvality spermatu na vysoké odborné úrovni, protože na ní je velká závislost úspěchu inseminace a důvěry chovatelů k této biotechnické metodě v reprodukčním procesu u hospodářských zvířat. Základní vyšetření spermatu probíhá bezprostředně po jeho odběru a kontrola aktivity spermií se provádí rovněž před jeho zamrazením, po rozmrazení, po ukončení karantenizace spermatu a po jeho expedici z banky. Speciální vyšetřovací metody se používají ke kontrole zdravotního stavu býků, při poklesu plodnosti býka, při odchylkách základních ukazatelů spermatu nebo při exportu a importu spermatu. Základní vyšetřovací metody spermatu tvoří metody nezbytně nutné pro vyhodnocení kvality ejakulátu pro jeho zmrazování a použití k inseminaci. Rozdělují se tedy na metody vyšetření čerstvého spermatu po jeho odběru a na metody vyšetření zmrazeného spermatu určeného pro použití k inseminaci (KLIMENT et al., 1989). 21

LOUDA et al. (2007) píše, že ejakulát určený pro účely inseminace se získává pouze od licentovaného plemeníka. Kvalita ejakulátu musí odpovídat požadavkům stanovených normou pro každý druh plemeníků hospodářských zvířat. Hodnocení a zpracování odebraného ejakulátu se provádí ve specializované laboratoři, sterilizované germicidní zářivkou, vyhřáté na 20 25 C. Laboratoř musí být vybavena proti pronikání přímého slunečního světla. Hodnocení a zpracování ejakulátu provádí laborant specialista. Základní vyšetření ejakulátu musí být zahájeno do 10 min po odběru. Vzhledem k tomu, že stanovení oplozovací schopnosti ejakulátu je velmi obtížné, používá se řada zkoušek, kterými se provede komplexní vyšetření a posoudí se jeho vhodnost k dalšímu zpracování a následné inseminaci. V rámci ochrany zvířat před nákazami a hromadnými infekčními i neinfekčními chorobami hraje vyšetření významnou roli. Stále se vyskytuje velký počet inseminačních dávek, jejichž kvalitativní ukazatele neodpovídají provozním podmínkám a hygienickým kritériím (VĚŽNÍK et al., 2000). 3.4.1 Laboratorní metody určené k vyšetření ejakulátu Mezi laboratorní metody určené k vyšetření čerstvého ejakulátu podle LOUDY et al. (2001) patří: MAKROSKOPICKÉ HODNOCENÍ EJAKULÁTU: Objem ejakulátu je variabilní a značně kolísá. Zjišťuje se měřením v kalibrovaném válci nebo vážením na laboratorní automatické váze; Konzistence, zrnitost posuzuje se u každého ejakulátu ve sběrači dopadajícím nebo procházejícím světle; Barva se posuzuje proti světlu. Dobré sperma je barvy bělavé, v některých případech šedobílé, nebo mírně nažloutlé; Pach se posuzuje čichem ve sběrači. Dobré sperma má slabý specifický pach připomínající pach kravského mléka; Cizí přimíseniny dobré sperma má být prosté přimísenin; 22

MIKROSKOPICKÉ HODNOCENÍ EJAKULÁTU: Hodnocení aktivity hodnotí se charakter pohybu, určuje se směr a rozsah kmitů bičíku spermie. U ejakulátů určených k přímé inseminaci nebo ke konzervaci se požaduje minimální aktivita 70 %. Posuzuje se u každého ejakulátu na podložním sklíčku vyhřátém na teplotu 39 C ± 1 C. Posouzení probíhá mikroskopicky při 200 300 násobném zvětšení. Hodnocená jsou minimálně 3 zorná pole a odhadem se stanoví procentické zastoupení spermií pohybujících se vpřed za hlavičkou; Stanovení hustoty koncentrace spermií je dána funkční aktivitou semenotvorného epitelu varlat, věkem, zdravotním stavem, připraveností a technikou odběru. Hodnotí se: fotometricky, hematocytometricky, spermiodenzimetrem podle Karrase nebo odhadem; BIOLOGICKÉ ZKOUŠKY EJAKULÁTU: Testy přežitelnosti jsou důležité pro posouzení biologické hodnoty a oplozovací schopnosti spermií. Mezi výsledky těchto testů a skutečnou plodností byla zjištěna vysoká korelace. Mezi testy přežitelnosti řadíme: krátkodobý tepelný test přežitelnosti a dlouhodobý chladový test přežitelnosti; Zkouška rezistence je ukazatelem odolnosti spermií vůči 1 % roztoku NaCl. Dobré býčí sperma má vykazovat rezistenci 40 000 (stupeň ředění); Zkouška živých spermií na odolnost vůči chladovému šoku touto zkouškou se posuzuje reakce spermií na rychlé zchlazení; Stanovení procenta živých a mrtvých spermií barvením touto biologickou zkouškou se získá obraz o kvalitě ejakulátu. Mrtvé nebo oslabené spermie přijímají barvivo, živé spermie barvivo nepropouští a zůstávají bílé. Málo životaschopné spermie se značně sníženým metabolismem se barví bledě růžově až červeně. Způsoby barvení jsou: barvení eosínem, barvení podle Blooma I., barvení podle Lasleye,barvení podle Blooma II.; 23

Stanovení koncentrace vodíkových iontů kyselost spermatu je výrazem činnosti a zdravotního stavu přídatných pohlavních žláz. Má být stanovena do 15 min po odběru, jelikož se životní pochody spermií mění. Ejakulát býků s ph pod 6,4 nebo nad ph 7,5 má sníženou oplozovací schopnost a k inseminaci se nesmí používat; BIOCHEMICKÉ ZKOUŠKY EJAKULÁTU: Na základě stupně anaerobního nebo aerobního metabolismu spermií se usuzuje na jejich životnost a oplozovací schopnost. Podstatou zkoušky je rychlost anaerobního rozkladu fruktózy obsažené v semenné plazmě. Dehydrogenační zkouška sleduje se rychlost fruktólýzy ve vztahu k počtu pohyblivých spermií. Methylenová modř má v této zkoušce funkci akceptoru vodíku uvolněného při anaerobním štěpení cukru a touto redukcí se mění v bezbarvou leukoformu. Byla prokázána vysoká pozitivní korelace mezi dobou odbarvení methylenové modři a hustotou spermatu, pohyblivostí spermií, jakož i dobrou přežitelností při dlouhodobém chladovém testu i krátkodobém tepelném testu; MIKROBILOGICKÉ VYŠETŘENÍ EJAKULÁTU: Čerstvý ejakulát nesmí obsahovat patogeny ani plísně. Oborové normy připouští maximálně 5000 nepatogenních mikroorganismů v inseminační dávce. Provádí se ve Státním veterinárním ústavu. MĚŘENÍ SPERMIÍ: Účelem je získat podklady pro objektivní posouzení tvaru a velikosti spermií ve vztahu ke stanoveným hodnotám normálních spermií u plemeníků jednotlivých druhů hospodářských zvířat. Mezi tvarem a velikostí spermií, hlavně jejich hlaviček, a oplozovací schopností je vysoká závislost. 24

POUŽITÍ FLUORESCEČNÍ MIKROSKOPIE: Pomocí fluorescenční mikroskopie při barvení spermií fluorochromy je možné provádět morfologické vyšetření spermií a diferencovat živé a mrtvé spermie. Toto metodou je také možné sledovat pohyb spermií v pohlavním traktu plemenice. MORFOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ EJAKULÁTU: 3.4.2 Morfologické vyšetření ejakulátu Ve varlatech plemeníků hlavních zástupců hospodářských zvířat, tedy i býku, je denně vytvořeno až 35 miliard spermií. Ne všechny spermie, které jsou produkovány, jsou normálně vyvinuté. Vliv na tento stav, který platí i za optimálních podmínek, má velká řada faktorů vnějšího i vnitřního prostředí. Skutečnost, že většina ejakulátů slouží jako výstupní biologický materiál pro přípravu inseminačních dávek, stupňuje význam a potřebu morfologického vyšetření ejakulátů plemeníků zařazených do takového provozu. Morfologie spermií má výhodu v přesnosti a preciznosti hodnocení, je jednoduchá, a pokud se týká vybavení, je dosažitelná pro většinu laboratoří (VĚŽNÍK et al., 2000). Tuto skutečnost dokládá ve své práci i VĚŽNÍK et al. (2004), který k tomu doplňuje, že morfologické vyšetření ejakulátu je považováno za neoddělitelné diagnostické kritérium vedle stanovení koncentrace a motility. Při posuzování spermií je pozornost centrována na hlavičku, krček, spojovací část a bičík. Na těchto částech spermií jsou posuzovány odchylky od normální struktury, případně odchylky vzniklé změnou reakce na barvící postupy. Při posuzování nátěrů hodnotíme především poměr normálních spermií k spermiím abnormálně formovaným, jejich kvalitativní změny, přítomnost heterologních buněčných elementů a z nich především nezralé formy germinativních buněk. GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al. (1992) upřesňuje, že morfologicky abnormální spermie můžou ovlivnit plodnost vytvořením defektní zygoty, blokováním fertilizace normálních spermií, příp. omezením pohybu spermií. 25

Pochopení významu specifických poruch spermií a jejich počet zjištěných v ejakulátu umožňuje diagnostikovi stanovit prognózu plodnosti býka a mohlo by ukázat cestu k léčbě býka s abnormální produkcí spermií (BART a OKO, 1989). Hodnocení morfologických změn spermií může přispět ke zjištění příčin neplodnosti plemeníků. Využívá se zdokonalené mikroskopické techniky a různých způsobů barvení. Při vzniku patologických spermií se uplatňuje řada vlivů genetických i negenetických. Podle místa vzniku se změny spermií rozdělují na primární a sekundární. Primární změny vznikají v průběhu spermatogenního cyklu a patří sem (degenerativní formy spermií, změny tvaru hlavičky, změny v nukleoplazmě, změny na akrozómu, tvarové změny bičíku a další vývojové anomálie). Sekundární změny vznikají při dlouhodobém pobytu spermií v ocasu nadvarlete, v průběhu ejakulace, špatnou manipulací s odebraným spermatem a nesprávné přípravě preparátů. Řadíme sem změny hlavičky, změny na akrozómu a torze bičíku (www.ksz.af.czu.cz). Příklady morfologických změn spermií býka jsou vyobrazeny na obr.4. LOUDA et al. (2001) rozděluje patologické formy spermií při posuzování morfologických změn do následujících skupin: Vývojové tvarové anomálie degenerativního charakteru počítáme všechny formy spermií, které se vyvinuly atypicky a nemají normální diferenciaci, hlavičku s akrozómem, spojovací část bičíku a bičík samotný. Nejčastěji jde o atypické útvary hlaviček, kdy hlavička bývá často menší a abnormálně barvitelná. Řadíme sem i takové spermie, u nichž se nevytvořil normální bičík, ale místo bičíku pouze vakovitý nebo kyjovitý tvar, dále spermie s dvojitým, bičíkem nebo se zdvojenou hlavičkou a jiné. V normálním ejakulátu se nesmí vyskytovat více než 5 % těchto změn. Vyšší procento je ukazatelem vážnější poruchy spermiogeneze; Patologické formy ve tvaru hlaviček změny ve tvaru hlaviček jsou nejčastějšími odchylkami při poruchách spermiogeneze a provázejí nejčastěji vznik degenerativních nebo zánětlivých procesů ve varlatech. Viz obr.5 a obr.6. Celkově nemá překročit výskyt těchto anomálií hranici 5 %. Nejčastěji se vyskytují hlavičky zúžené, hruškovité, abnormálně velké, abnormálně malé, asymetrické ovoidní, oválné, citrónovité, dále spermie s abnormální strukturou hlavičky, která může být proláklá, 26

plošná, příliš široká nebo s úzkým klenutím. Všechny tyto změny patří mezi změny primární; Změny na akrozómu u býka s porušenou plodností se často vyskytuje svlečený akrozóm, který někdy nacházíme na roztěrech nedaleko hlaviček spermií. V takovém případě lze předpokládat, že k jejich uvolnění došlo pravděpodobně až po styku se semennou plazmou, protože jinak dochází k jejich resorpci v nadvarletním traktu. Nejčastější anomálií je zbobtnalý akrozóm. K této změně dochází i při manipulaci se spermatem, zejména když se dostane do sběrače voda. Akrozóm obvykle praskne a akrozómová hmota se vylije do prostředí. Mezi další změny vnitřní struktury akrozómu patří dále kondenzace akrozómové hmoty k přednímu okraji hlavičky, zřasení předních okrajů hlaviček, různé granulace v akrozómové substanci a jiné, které bývají obvykle sekundárního charakteru; Změny v zadní části hlavičky jde převážně o změny v nerovné tinktorické schopnosti kalíšku nebo o výskyt různých granulárních tělísek. Viz obr.5 a obr.6; Změny na spojovací části rozpoznání těchto změn vyžaduje již poměrně značné zkušenosti a citlivost oka, aby byly zachyceny jemné změny, mezi které patří hlavně zkrácení spojovací části, její prodloužení, ztluštění, zúžení, přerušení spojovací části v některém úseku, ve kterém probíhá pouze holé osové vlákno nebo rozvázání mitochondriální spirály, která se při bedlivé prohlídce jeví jako vinoucí se nitkovitý závit; Patologické změny na bičících nejčastěji se jedná o stočení bičíku kolem protoplazmatické kapky, obvykle na konci spojovací části bičíku. Může to být stočení do tvaru houslového klíče., zavinutí bičíku do klubka. Řadíme sem i tzv. Dag-defekt, kdy dochází k abnormálnímu vyvinutí bičíku v důsledku toho, že se bičíkové fibrily nevyvinou v uspořádání 2+9+9, ale ve vnějším kruhu obvykle skupina fibril chybí. Tato anomálie je popisovaná jako změna s dědičnou predispozicí. Dále sem patří abaxiální upevnění bičíku, kdy bičík nevychází ze středu, ale z okraje hlavičky a dekapacitace, tj. oddělení hlaviček od bičíků. Viz obr.7. Velmi často však může jít o arteficiální změny, které vznikají při nesprávném zhotovení roztěru; Nezralé spermie jedná se o spermie se zadrženou protoplazmatickou kapkou na krčku nebo v průběhu spojovací části. V ejakulátu býka jich nesmí být více než 2 %. 27

Existují specifické rozdíly u jednotlivých druhů plemeníků. Při vyšším výskytu nezralých spermií je třeba sledovat výskyt dalších vývojových vad; Změny v nukleoplazmě tyto změny se posuzují při použití speciálního barvení, znázorňujícího jadernou substanci. Mezi nejčastější změny patří miliární vakuoly při předním okraji hlavičky, makrovakuoly, nepravidelné uspořádání DNK v jádře nebo slabá barevná reakce nukleoplazmy. V ejakulátu nemá být více než 15 % těchto anomálií; KLIMENT et al. (1989) doplňuje, že speciální morfologické vyšetření spermií slouží ke kontrole: poruch spermiogeneze jako následku degenerativních změn ve varletním parenchymu, způsobených nepřiměřenou a nekvalitní výživou, toxickými nebo infekčními vlivy, traumatickým poškozením, stresovými faktory aj. Dále slouží ke kontrole zánětů varlat, nadvarlat nebo přídatných pohlavních žláz, poruch tvorby a uvolňování gonadotropních a specifických hormonů, hereditárních defektů vázaných na abnormální strukturu spermií, negativního vlivu ředidel nebo některých jejich složek zejména na strukturu cytoplazmatických membrán na hlavičce a bičíku, odolnosti a poškození spermií během ekvilibrace nebo během zmrazování a uchování zmrazeného spermatu při nízkých teplotách, odolnost spermií v genitálních sekretech říjících se samic. KLIMENT et al. (1989) dále uvádí, že se nejčastěji používá světelná mikroskopie. Při procesu fixace a barvení může však dojít ke vzniku četných artefaktů, a proto každá laboratoř by měla pro komparaci těchto artefaktů požívat dvě různé techniky. 28

Obr. 4: Morfologické změny na spermiích býka (VĚŽNÍK et al., 2004, upraveno) 29

Obr. 5: Patologické změny na hlavičkách u býčích spermií (VĚŽNÍK et al., 2004, upraveno) 30

Obr. 6: Patologické změny na hlavičkách u býčích spermií (VĚŽNÍK et al., 2004, upraveno) 31

Obr. 7: Patologické změny bičíků spermií (VĚŽNÍK et al., 2004, upraveno) 32

3.5 Inseminační dávka Inseminační dávka vyrobená ze spermatu daného plemeníka obsahuje několikanásobně vyšší počet spermií, než je potřebné tzv. oplozovací minimum. Inseminační stanice, kde byla dávka vyrobena, garantuje dodržování všech technologických postupů při její výrobě. Každý ejakulát sloužící k výrobě inseminačních dávek je posuzován jako samostatná biologická jednotka, je prověřován předepsanými laboratorními zkouškami, na základě kterých se stanoví stupeň ředění. Aktivita vyrobených inseminačních dávek je prověřována po zmrazení, dále po určité době uložení v kontejneru na dané inseminační stanici. Výstupní kontrolou před jeho expedicí z inseminační stanice se znova ověří aktivita, přežitelnost teplotním testem a čitelnost údajů na pejetách, ve kterých je inseminační dávka uložena (LOUDA et al., 2008). GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al. (1992) upřesňuje, že semeno býka určené k inseminaci se neposuzuje jen podle výsledků jedné zkoušky, ale vychází se z komplexních výsledků mnoha laboratorních zkoušek. U skotu naprostou většinu využití semene k přípravě inseminačních dávek tvoří jeho dlouhodobá konzervace. V současné době je inseminační dávka připravena v ředěném zmrazeném stavu v pejetách. Inseminační dávka je uchovávána při teplotě -196 ºC. Semeno určené ke zpracování musí odpovídat ČSN 46 7111, při vyšších nárocích je vhodné znát kvalitu ejakulátu na základě funkční testů spermií. Inseminační dávky jsou připravovány převážně v pejetách o objemu 0,25 ml. Koncentrace spermií v připravované spermatické suspenzi musí odpovídat výsledné koncentraci v inseminační dávce 12 milionů aktivních spermií po rozmrazení. Proto ředění semene k přípravě inseminačních dávek musí odpovídat aktivitě spermií v ejakulátu a předpokládané aktivitě po rozmrazení (VĚŽNÍK et al., 2000). 3.5.1 Kryokonzervace Technologie kryokonzervace semene přinesla revoluční změnu a umožnila jeho dlouhodobé uchovávání a otevřela prostor pro kvalitativně zcela nové a nesporně účinnější formy systematického šlechtění (ŘÍHA et al., 1999). 33

GORDON (2004) dodává, že kvalita zmrazeného semene je samozřejmě důležitý faktor určující koncepci cen skotu v zemědělství. Nedílnou součástí konzervace spermatu v praxi je jeho ředění. Způsob ředění a způsob konzervace se vzájemně podmiňují a do určité míry ovlivňují i použitou metodu vlastního úkonu inseminace plemenic. Vliv vnějšího prostředí při konzervaci spermatu se projevuje zejména v tom, že proti přirozeným podmínkám musí spermie překonat teplotní změny, ochlazení a znovuzahřátí, na které nejsou vyzbrojeny. Hromaděním a působením vlastních zplodin výměny látkové dochází ke změně ph, k vyčerpání výživných látek ještě před zavedením spermatu do pohlavních orgánů plemenice, k dalšímu nežádoucímu působení semenné plazmy na spermie, ke změně metabolických pochodů při zvyšování a snižování teplot, k rychlejší ztrátě elektrického náboje a k aglutinaci spermií, popř. k působení přemnožené bakteriální mikroflóry a k působení světelného a jiného záření. Účelem ředění spermatu je vytvořit vhodné podmínky pro sperma, aby mohlo být maximálně využito při zachování jeho oplozovací schopnosti. Na vitalitu a fertilitu mají rozhodný vliv jak způsob ředění, tak i metoda konzervace ředěného ejakulátu (KLIMENT et al., 1989). Stejný názor zastávají ve své publikaci také GAMČÍK, KOZUMPLÍK et al. (1992), kteří doplňují, že po dobu životních procesů v ejakulátu dochází k hromadění kyseliny mléčné a mnoha jiných škodlivých produktů metabolismu, které intoxikují prostředí a způsobují smrt pohlavních buněk. Tento jev se nazývá autointoxikace. Intenzita autointoxikačních procesů přímo závisí na teplotě okolního prostředí, stupně okysličení a koncentrace aktivních spermií. Po dobu života spermie v ní probíhají heterointoxikační procesy, které nastupují v okamžiku, kdy se nahromadí toxické produkty metabolismu rozmnožující se mikroflóry v ejakulátu. Dle LOUDY et al. (2001) je cílem konzervace ejakulátu zachování jeho životaschopnosti a dobré oplozovací schopnosti. Dále pak vlivem odpovídajícího ředění vyrobit maximální počet inseminačních dávek s takovým počtem aktivních spermií, který odpovídá biologickým požadavkům pro zajištění úspěšného oplození koncepce. Obvykle se požaduje, aby inseminační dávka býka po rozmražení obsahovala 10 milionů aktivních spermií při aktivitě spermií v inseminační dávce minimálně 30%. U některých zvláště cenných býků zlepšovatelů s výjimečně dobrou plodností lze počet spermií v inseminační dávce snížit za předpokladu, že bude dosahováno dobrého zabřezávání po první inseminaci. 34

3.5.1.1 Ředění ejakulátu Dle LOUDY et al. (2001) se ředěním vytváří podmínky pro přežívání spermií mimo organismus. Proces ředění má být zahájen do 15 min po odběru. Ředění předchází makroskopické a mikroskopické posouzení. Teplota ředidla i ředěného ejakulátu musí být stejná ± 1 C. Ředidlo se vždy přidává do ejakulátu určeného k ředění postupně za neustálého míchání. Používané sklo musí být sterilní a předehřáté. Ředidlo by mělo splňovat následující vlastnosti: být energetickým zdrojem pro spermie; mít dobrou pufrovací schopnost; malý obsah elektrolytu; zajišťovat požadovaný osmotický tlak; ph odpovídající požadavkům býčího ejakulátu; nesmí být toxické; musí být sterilní; musí být ekonomicky dostupné; Složení ředících roztoků lze podle KLIMENTA et al. (1989) rozdělit do tří skupin podle účinnosti: Extendory slouží pouze k zvětšení objemu semene, které se používá bezprostředně, tj. v čerstvém stavu; Protektory kromě zvětšení objemu semene zajišťují zdroj výživy a ochranu spermií v prostředí mimo organismus po delší dobu; Implementory jsou v podstatě protektory, ke kterým byly přidány látky působící na pohlavní orgány samic a ovlivňující příznivě pasáž spermií a proces oplození; 35

LOUDA et al. (2001) dále uvádí, že k ředění spermatu se používá odzkoušených ředidel domácích, např. žloutko laktózového ředidla, případně výrobou připravená komplexní ředidla nakoupená a běžně užívaná v zahraničí na bázi Tris, Triladyl nebo Laiciphos, Biociphos atd. Rozhodnutí o účelnosti, množství a typu antibiotik vydává andrologická stanice. Použití stejných ředidel dokládá ve své publikaci také LOUDA a HEGEDÜŠOVÁ (2009). Jako nejčastěji použitá ředidla uvádí ředidlo Tris a žloutko laktózové. 3.5.1.2 Dlouhodobá konzervace ejakulátu býků Zavedení dlouhodobé konzervace býčího spermatu do praxe významným způsobem přispělo k zjednodušení a zlepšení inseminačního provozu. Snížil se počet býků potřebných k inseminaci. Rozhodujícím přínosem pro dlouhodobou konzervaci ejakulátu bylo poznání kryokonzervačního účinku glycerinu na přežívání savčích spermií objevené v roce 1949. K dokonalosti metod přispělo i použití tekutého dusíku jako chladícího média. V průběhu zmrazování a rozmrazování spermií dochází ke složitým procesům přeměny skupenství vody a koncentrace roztoků v buňce i mimo ní a tím i k zatížení buněčné membrány. Důsledkem těchto procesů je přežívání jenom určitého počtu spermií (30 50 %). V průběhu zmrazování a rozmrazování spermatu nastávají v podstatě dva kritické momenty a to tzv. solution effects a tvorba nitrobuněčného ledu. Solution effects nastávají převážně při pomalém zchlazování, zatímco nitrobuněčný led se tvoří při velmi rychlém zchlazování spermií. Obecně je voda obsažená v ředidle i ve spermiích přemísťující se a měnící se v led považována za letální faktor. Solution effect začíná v průběhu mražení spermatu, při kterém dochází k vytlačování vody ze spermie, které zvyšuje koncentrace solí a postupně dochází k dehydrataci spermie. Pokud je průběh mražení příliš rychlý, voda nestačí spermii opustit. Voda, která zůstane v buňce, tvoří ledové krystaly. Rychlost mražení -10 C až -20 C za minutu z 0 C na -50 C se jeví jako optimální. Glycerol pak tvoří přirozenou ochranu proti solution effect, redukuje je, ale nevylučuje (LOUDA et al., 2001). LOUDA et al. (2001) rovněž dodává, že nejrozšířenější metodou dlouhodobé konzervace spermatu ve světě je metoda francouzská, při které se semeno mrazí a uchovává v pejetách s objemem spermatu 0,25 0,50 cm 3. 36