Jméno: Obor/ročník: Datum: Cvičení z mammaliologie Protokol č. Téma: Úvod: Odběr a analýza trichologického materiálu Jedním z hlavních znaků savců je srst tvořená různými typy chlupů. Až na výjimky (kytovci) je srst přítomna u všech současných savců. Hlavní funkce srsti je termoregulační, nicméně specializované chlupy mohou být využívány i jinak vibrisy (hmatové chlupy) slouží k orientaci, svazečky zesílených chlupů na chodidlech mohou usnadňovat pohyb na kluzkém povrchu nebo sněhu (z našich druhů např. zajíc nebo kuna lesní), přeměněné chlupy tvořící bodliny slouží k obraně, atd. Srst je složena z chlupů epidermálního původu, které jsou pigmentovány melaniny. Jednotlivé chlupy vyrůstají z váčků (folikulů) a jsou spojeny s mazovými a potními žlázami (tvorba a šíření individuálního pachu je také další velmi důležitou funkcí chlupu). Chlupy mohou být rozlišeny na podsadu (kratší, jemnější, většinou nepoužitelné pro druhovou determinaci) a pesíky (delší, silnější, možné využít pro druhovou determinaci). Obor zabývající se studiem chlupů se nazývá trichologie. Jako významná součást forenzně kriminalistických metod je široce rozpracován především v oblasti studia tělního pokryvu člověka, nicméně trichologické metody se dají velmi dobře využít i při studiu volně žijících savců. Odběr trichologického materiálu se provádí buď z mrtvých (preparovaných) jedinců, nebo živých zvířat. Pro odběr vzorků chlupů např. z kožešin nebo kadavérů existují specifické metodické postupy, vždy ale platí, že se snažíme pro pozdější analýzu odebrat co nejreprezentativnější vzorek. Pokud tedy srst v rámci těla vykazuje barevnou nebo délkovou variabilitu (většinou je např. srst na břiše světlejší a kratší), odebíráme vzorky z různých částí těla (např. hlava, hřbet, břicho, končetiny,...) tak, aby výsledný vzorek byl co nejreprezentativnější. Zaměřujeme se především na pesíky, které mají největší determinační hodnotu, vždy odebíráme jen několik chlupů, pokud je to možné spíš chlupy vytrháváme (např. plochou pinzetou) i s folikulem, pokud to možné není pak srst stříháme. Odebraný vzorek uchováváme v papírovém sáčku nebo svárovém igelitovém pytlíku spolu s kartičkou s identifikačními údaji. Podobným způsobem je možné odebrat vzorek i z odchyceného živého jedince. V případě starších kožešin, nebo dermoplastických preparátů (vycpanin) mohou být jednotlivé chlupy značně poškozené např. chemickým ošetřením, nebo škůdci a jejich determinace tak nemusí být možná! V poslední době se jako velmi perspektivní neinvazivní metoda (nejen) populačních studií uplatňuje využití tzv. chlupových pastí. Jsou to většinou plastové rourky o různém průměru s lepivou ploškou nebo pruhem uvnitř když drobný savec rourkou prolézá, zanechá na ní pár chlupů podle kterých lze provést identifikaci (u nás se tato metoda používá při některých studiích plšíka lískového, nebo křečka). Chlupové pasti se s úspěchem využívají také při studiu větších druhů savců (většinou šelem). V terénu jsou v tomto případě cíleně rozmístěny lepivé pásy, kartáče, případně kusy ztupeného ostnatého drátu buď na stromech, nebo na zvlášť k tomu upravených tyčkách (Obr. 1) a v pravidelných intervalech se zde odebírají a determinují zachycené chlupy. Účinnost takové pasti může ještě zvýšit atraktant (např. u koček výtažek z kozlíku lékařského (Valeriana officinalis) tzv. Valeriánské kapky, nebo u jelenovitých anýz), který cílový druh přitahuje a zvíře se o takto naparfémovaný předmět s oblibou otírá. Chlupy je samozřejmě možné odebírat v terénu i náhodným sběrem zvláště u některých druhů (medvěd, prase divoké), které využívají drbací stromy je to velmi častá metoda (Obr. 2). U chlupů odebraných těmito způsoby v terénu je možné provádět i sofistikované analýzy DNA - v případě, že jsou aspoň u některých chlupů zachovány folikuly nebo podle struktury získané srsti posoudit pohlaví, věk, někdy i zdravotní stav zvířete. Celkově se použití chlupových pastí v případě větších savců využívá především pro studium vzácných a málo početných druhů s velkým teritoriem. Tuto metodu je možné využít i pro zjišťování údajů o (ne)výskytu daného druhu v určitém území (u nás je takto sledován např. výskyt kočky divoké, nebo rysa), většinou v kombinaci s fotopastmi, zjišťováním pobytových znaků apod. Tento studijní materiál byl vytvořen díky podpoře grantu FRVŠ G4 2526/2012. 1
Odebraný trichologický vzorek je následně analyzován laboratorní expertízou. Z odebraných chlupů je možné vytvořit makroskopický preparát uzavřením mezi dvě skleněné tabulky a oblepením textilní páskou, nebo preparát mikroskopický (dočasný nebo trvalý např. v solakrylu). Pokud jsou chlupy delší, stáčíme je na sklíčku vždy do tvaru ležaté osmičky. Tímto způsobem můžeme vytvořit obsáhlou srovnávací sbírku. Vlastní determinace trichologického materiálu se provádí pod mikroskopem pomocí srovnávacího atlasu. Nejdůležitější znaky se nacházejí na kutikule chlupu hodnotíme především tvar a množství kutikulárních šupin, ale také sílu a tvar dřeně, celkový tvar, ztluštění a zbarvení chlupu. Tyto znaky sledujeme většinou na třech částech chlupu bazální, střední a koncové (apikální). Dále je možné hodnotit tvar chlupu na průřezu v těchto třech částech (metodický postup zhotovování řezů je popsán v doporučené literatuře). Mikroskopickou analýzu je vhodné provádět i pomocí mikrofotografie a následného softwarového zpracování (měření). Determinace některých blízce příbuzných druhů jen pomocí trichologického materiálu však může být problematická a pokud není možné provést ještě další analýzy (osteologickou, dentice, DNA), je často i nemožné od sebe takové druhy rozlišit. Doporučená literatura: Teerink B. J. (2003): Hair of West European Mammals. Cambridge University Press Ryan J. (2011): Mammalogy Techniques Manual (2nd Edition). Lulu.com Anděra M., Gaisler J. (2012): Savci České republiky. Academia Dungel J, Gaisler J. (2002): Atlas savců. Academia Horáček I., Anděra M. (2005): Poznáváme naše savce. Nakladatelství Sobotáles Bouchner M.(2001): Stopy. Aventinum Tento studijní materiál byl vytvořen díky podpoře grantu FRVŠ G4 2526/2012. 2
Obr.1: Chlupová past (foto: http://www.beskydy.ivb.cz/) Obr.2: Odběr trichologického materiálu v terénu štětiny prasete divokého zachycené na drbacím stromě poblíž kaliště. (foto: Monika Kukalová) Tento studijní materiál byl vytvořen díky podpoře grantu FRVŠ G4 2526/2012. 3
Úkol č.1: Odběr trichologického materiálu, příprava makroskopického preparátu Materiál a pomůcky: Plochá pinzeta ( na obočí ), svárové pytlíky, preparátová sklíčka (cca 10x10 cm), textilní kobercová páska, nůžky, lihový popisovač Postup: Z vybraných sbírkových položek (kožky, vycpaniny) odebereme trichologický vzorek. Odebíráme vždy několik pesíkových chlupů z hřbetu a břišní části, případně hlavy, končetin, ocasu. Vzorek chlupů umístíme mezi dvě vyčištěná a odmaštěná preparátová skla. Preparát fixujeme oblepením textilní páskou, všechny okraje oblepíme minimálně dvakrát. Preparát označíme v rohu podle pokynů vedoucího cvičení lihovým popisovačem. Výsledky: Do výsledků uvedeme seznam vytvořených preparátů (druhů). Závěr: V Závěru shrneme výsledky (počet vytvořených preparátů). Tento studijní materiál byl vytvořen díky podpoře grantu FRVŠ G4 2526/2012. 4
Úkol č.2: Tvorba mikroskopického preparátu, druhová determinace Materiál a pomůcky: Mikroskop, podložní a krycí skla, preparační nástroje, solakryl, xylen, líh, determinační pomůcky a literatura, poznámky Postup: Z dříve odebraného neznámého trichologického materiálu vytvoříme trvalé preparáty standardní metodou zalitím do solakrylu (před vložením objektu do fixačního média musíme vzorek dokonale odvodnit vzestupnou alkoholovou řadou a xylenem!). Pod mikroskopem vybereme v preparátu reprezentativní chlupy a podle srovnávacího atlasu se pokusíme vzorek determinovat alespoň na úroveň rodu. Výsledky: Do výsledků uvedeme seznam vytvořených preparátů a determinaci druhu (rodu) i skutečný původ vzorku (sdělí vedoucí cvičení). Alespoň jeden preparát zakreslíme. Závěr: V Závěru shrneme úspěšnost determinace. Tento studijní materiál byl vytvořen díky podpoře grantu FRVŠ G4 2526/2012. 5