STUDIUM DEGRADACE KOSTERNÍCH POZŮSTATKŮ POMOCÍ INFRAČERVENÉ SPEKTROMETRIE

STUDIUM DEGRADACE KOSTERNÍCH POZŮSTATKŮ POMOCÍ INFRAČERVENÉ SPEKTROMETRIE STUDY OF SKELETAL RESIDUES DEGRADATION USING INFRARED SPEKTROSCOPY Anna Vitešníková 1, Lubomír Prokeš 1, Miriam Nývltová Fišáková 2, Eva Drozdová 1, Pavel Kouřil 2, Pavel Stabrava 2, Jana Gryc 2 1) Masarykova univerzita v Brně / Masaryk University in Brno 2) Archeologický ústav Akademie věd ČR v Brně / Istitute of Archaeology of the Academy of Sciences ČR in Brno Úvod Přestože je infračervená spektrometrie metoda užívaná převážně k identifikaci struktury chemických látek, lze ji úspěšně využít i v celé řadě vědních disciplín, mimo jiné také v oblasti antropologie a archeometrie. Z dosud publikovaných studií vyplývá, že pomocí infračervené spektrometrie lze s úspěchem charakterizovat projevy postdepozičních degradačních procesů na kosterních pozůstatcích. Transformace a destrukce kostní tkáně začíná okamžitě po smrti jedince, přičemž míra a charakter destrukce kosti jsou dány zejména působením vnějších faktorů (např. ph, vlhkost a chemické složení půdy, přítomnost mikroorganismů apod.) [HERRMANN NEWESELY 1982]. Interakce kostní tkáně s okolním prostředím se může projevit změnou jejího chemického složení (např. rekrystalizace a rozpuštění hlavní minerální složky kosti tj. hydroxyapatitu (Ca 5 (PO 4 ) 3 (OH)) a následnou mechanickou destrukcí kostní matrice. Specifickým faktorem působícím na kosterní pozůstatky je vysoká teplota, jejímž účinkům je tělo vystaveno při uhoření či cíleném spalování (kremaci). V této práci byla experimentálně ověřena možnost použití infračervené spektrometrie pro studium spálených kosterních pozůstatků, zejména pro rozlišení spálených a nespálených kostí a také odhad teploty a podmínek spalování. Dále byla studována degradace kalcifikované tkáně novověkých kosterních pozůstatků z kovových rakví. Metoda Pro analýzu vzorků kosterních pozůstatků byla použita metoda FTIR (Infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací), jejímž základním principem je absorpce infračerveného záření při průchodu vzorkem, kdy je pohlcená energie využita ke změnám rotačně-vibračních energetických stavů molekuly, v závislosti na změnách jejího dipólového momentu [KLOUDA 2003]. Různé druhy kovalentních vazeb absorbují záření různé vlnové délky. Analytickým výstupem je infračervené spektrum závislost množství absorbovaného infračerveného záření (vyjadřovaného např. jako absorbance) na jeho vlnové délce (vyjadřované zpravidla jako vlnočet, v cm -1 ). Přítomnost spektrálního pásu pro určitý vlnočet svědčí o přítomnosti určitého typu vazby, a tím pádem i o přítomnosti určitých funkčních skupin. Vzorek pro analýzu byl vždy odebrán z kompaktní části kosti. Vzorky byly sušeny při teplotě 85 C po dobu 150 minut. Po vysušení bylo vždy 10 mg smícháno s 100 mg vysušeného bromidu draselného (KBr) a po homogenizaci směsi (třením v achátové misce) z ní byla vylisována tableta. Takto upravený vzorek byl analyzován spektrometrem ATI Mattson (Genesis Series FTIR). Výsledky Degradace kalcifikované tkáně v kovových rakvích Analyzovány byly kosterní pozůstatky příslušníků rodu Dietrichsteinů, které byly vyzvednuty z rodinné hrobky Dietrichsteinů v Mikulově při průzkumu v letech 2001 2003 [DROZDOVÁ 2006]. Jednalo se o fragment blíže neurčené dlouhé kosti knížete Leopolda Ignáce (Vzorek LI, Obr. 1), dále fragment dlouhé kosti knížete Ferdinanda Josefa (Vzorek FJ, Obr. 1) a fragment obratle knížete Waltera Xavera (Vzorek WX, Obr. 1, Obr. 2). Tyto ostatky dietrichsteinských knížat byly velmi špatně zachované, bylo na nich patrné narušení histologické struktury kostní matrice v důsledku transformace její minerální složky hydroxyapatitu. Na povrchu fragmentů kostí byly makroskopicky pozorovatelné výkvěty bílých krystalů. Analýzou metodou FTIR se podařilo prokázat, že se jedná o krystaly brushitu (CaHPO 4. 2 H 2 O), viz infračervené spektrum Obr. 2 (Tab. 1), který vzniká rekrystalizací hydroxyapatitu (v sekvenci hydroxyapatit oktakalciumfosfát brushit, Tab. 2) vlivem nízké hodnoty ph a vysoké vlhkosti prostředí. Kyselé prostředí vzniká při hnití měkkých tkání, proto lze brushit nalézt už v raném stádiu rozkladu kostí [HERRMANN NEWESELY 1982]. Výskyt brushitu byl v minulosti pozorován na kosterních pozůstatcích z chladných, nevětraných krypt s podlahou pod úrovní spodní vody [PROKEŠ 2007]. Brushit tvoří objemné krystaly, které zapříčiňují rozpraskávání kostní tkáně a rozpad osteonů. Tento minerál je také na rozdíl od hydroxyapatitu rozpustný ve vodě, což opět podstatně usnadňuje destrukci kostní tkáně. 24

Muzea, památky a konzervace 2008 Obr. 1: Fragmenty kostí dietrichsteinských knížat s výskytem brushitu Obr. 2: Výskyt brushitu na fragmentu obratle knížete Waltera Xavera Dietrichsteina (Foto: L. Prokeš, Masarykova univerzita) Obr. 3: FTIR spektrum vzorek LI (kn. Leopold Ignác) 25

Vlnočet (cm -1 ) Stanovení 3545 cm -1 + 3490 cm -1 + 3284 cm -1 + 3168 cm -1 + 2955 cm -1 valenční vibrace O H skupin vody (hydrát), případně HPO 4 2-2375 cm -1 + 1722 cm -1 valenční vibrace PO H 1651 cm -1 deformační vibrace O H vody 1217 cm -1 valenční vibrace P O 1137 cm -1 + 1061 cm -1 asymetrická valenční vibrace P O 987 cm -1 symetrické valenční vibrace P O 874 cm -1 + 794 cm -1 asymetrické valenční vibrace P O P 665 cm -1 + 577 cm -1 +525 cm -1 deformační vibrace O P O Tab. 1: FTIR pásy brushitu (JOSHI JOSHI 2003, KUMAR KALAINATHAN 2008) ph 7,0 7,5 (fyziologické) 6,0 7,0 4,5 6,0 Minerál hydroxyapatit oktakalciumfosfát brushit Chemický vzorec Ca 5 (PO 4 ) 3 OH Ca 4 H(PO 4 ). 2 H 2 O CaHPO 4. 2 H 2 O Součin rozpustnosti 5. 10-6 8. 10-4 7.10-4 Tab. 2: Transformace hydroxyapatitu v kyselém prostředí (PROKEŠ 2007) Na kosterních pozůstatcích může být pozorován také výskyt jiného minerálu, vzniklého rekrystalizací hydroxyapatitu, vivianitu (Fe 3 (PO 4 ) 2. 8 H 2 O). Vivianit vzniká v anaerobním a kyselém prostředí (hlavně v podmáčených půdách), v přítomnosti zdroje železa, což mohou být železné předměty nebo půda samotná [PROKEŠ 2007]. Je to bezbarvý průsvitný minerál tvořící tabulovité krystaly, který se na vzduchu (oxidací Fe 2+ na Fe 3+ ) zbarvuje světle modře, případně do temných odstínů modré. Tento minerál byl identifikován na fragmentu subrecentního kravského zubu (Obr. 4, spektrum Obr. 5, Tab. 1), který byl získán při archeologickém výzkumu v Třebíči. Studium termicky podmíněných změn v kostní tkáni Nálezy spálených nebo ohořelých kosterních pozůstatků jsou v archeologických výzkumech poměrně časté. Z antropologického hlediska je u takových kosterních pozůstatků žádoucí sledovat termicky podmíněné morfologické změny (změny velikosti, tvaru, histologické struktury a chemického složení kosti a s tím spojenou změnu zbarvení a mechanických vlastností) [THOMPSON 2004]. Při hodnocení kosterních pozůstatků ze žárových hrobů lze na základě charakteru morfologických změn určit míru poškození ohněm neboli stupeň spálení kosti [viz. např. DOKLÁDAL 1999; HOLCK 1997] a přibližně odhadnout teplotu kremace. Pro přesnější charakterizaci stupně spálení byla v minulosti použita řada fyzikálně-chemických metod, např. termická analýza [LOZANO et al. 2003], FTIR analýza (LEBON et al. 2008, MUNRO et al. 2007] nebo rentgenostrukturní analýza [THOMPSON et al. 2008]. Obr. 4: Výskyt vivianitu na úlomku kravského zubu Obr. 5: FTIR spektrum kravský zub - vivianit První skupinou vzorků, u nichž byly studovány změny v chemickém složení metodou FTIR, byl soubor kosterních pozůstatků pocházejících z archeologického výzkumu hradiště Chotěbuz-Podobora, které je ve starší fázi své slovanské existence datováno do 2. pol. 8. až po přelom 9. 10. století [KOUŘIL 2007]. Z tohoto závěrečného stádia pochází i spálený objekt, v němž byly nalezeny pozůstatky uhořelých hospodářských zvířat: prasete, tří ovcí/koz, březí krávy a psa (Obr. 6) [M. NÝVLTOVÁ-FIŠÁKOVÁ ústní sdělení]. V případě krávy byly k analýze vybrány vzorky z hnědě (kráva H), černě (kráva Č) a bíle (kráva B) zbarvené kostní tkáně. Všechny kosterní pozůstatky ostatních zvířat byly zbarveny bíle. Stupeň spálení kosti byl nejprve určen makroskopicky (podle morfologických vlastností a zbarvení kostní tkáně) s využitím stupnic spálení kosti [DOKLÁDAL 1999; HOLCK 1997; MUNRO et al. 2007; WALKER et al. 2007], viz. Tab. 3 a Tab. 4. 26

Muzea, památky a konzervace 2008 Dokládal 1999 Holck 1997 Kráva H stupeň II (± 300 C) Grade 1 (cca 300 C) Kráva Č stupeň II (± 400 C) Grade 2 (cca 400 C) Kráva B, prase, ovce/koza stupeň V (nad 750 C) Grade 3, resp. 4 (nad 800 C) Tab. 3: Stupeň spálení a odhad kremační teploty kosterních pozůstatků na základě teploty a morfologických změn Munro et al. 2007 Walker et al. 2007 Kráva H 250 300 C cca 250 C Kráva Č cca 350 C 350 400 C Kráva B, prase, ovce/koza cca 700 C cca 900 C Tab. 4: Odhad teploty spálení kosterních pozůstatků na základě zbarvení Následně byla interpretována infračervená spektra, v nichž byla, za účelem studia termicky podmíněných změn v chemickém složení kostí, sledována přítomnost charakteristických absorbčních pásů anorganické i organické složky kosti (Tab. 5, Tab. 6). FTIR indikuje přítomnost vody (postupná redukce OH pásů vody, kolem 400 C zcela vymizí), redukci a posun pásu karbonátu (pás 1400 1500 cm -1, významná redukce kolem 700 800 C), redukci organické složky kosti (zejm. kolagenu) (kolem 300 400 C) [MUNRO et al. 2007]. U dokonale spálených kostí (neobsahujících organickou složku a vodu) dochází při teplotě cca 900 C k rekrystalizačním změnám fosfátu na whitlockit (β-trikalciumfosfát; pás kolem 655 cm -1 ) [LOZANO 2003; THOMPSON 2004]. Z výsledků analýz vyplývá, že teploty spalování zhruba odpovídají teplotám zjištěným odhadem ze zbarvení a stupně přepálení. U kostí, které nebyly dokonale spáleny, tedy hnědé a černé (Obr. 7, Obr. 8) kosti krávy, se vyskytují pásy typické pro organickou složku a vodu. Z charakteru anorganické složky spekter těchto kostí lze usoudit, že černá kost byla vystavena působení vyšší teploty (cca 400 C) než kost hnědá (200 250 C). V černé kosti byl však zjištěn oproti hnědé kosti větší podíl organické složky (organická složka v hnědé kosti byla pravděpodobně redukována postdepozičními procesy, v černé kosti byla naopak stabilizována karbonizací). Na základě rozdílného zbarvení i odlišností v infračervených spektrech jednotlivých vzorků pocházejících z různých částí skeletu krávy bylo možné usoudit, že jednotlivé části těla nehořely rovnoměrně. Nedokonalé spálení kosterních pozůstatků a zachování karbonizovaných zbytků měkkých tkání je obecně důsledkem omezeného přístupu kyslíku ke kosti během kremace díky specifickému uložení pozůstatků [FAIRGRIEVE 2008]. Důvodem, proč byly některé části skeletu uhořelé krávy spáleny méně než ostatní, je zřejmě velký podíl měkkých tkání bránících přístupu kyslíku a přítomnost velkého množství plodové vody (jednalo se o březí krávu). Intenzita pásu uhličitanu a index krystalinity neboli splitting factor (vypočítaný jako podíl sumy výšek fosfátových píků (603 a 563 cm -1 ) a výšky mezi nimi; rostoucí úměrně s teplotou) ukazuje, že teplota působící na bílé pozůstatky krávy (Obr. 9) byla o něco nižší ve srovnání s pozůstatky ostatních zvířat. Teplota tedy dosahovala cca 800 900 C v případě krávy, u ostatních spíše 900 1000 C (všechny odhady jsou učiněny pouze na základě údajů z literatury, detailnější odhad by vyžadoval provedení experimentů). Analýza tedy potvrdila nerovnoměrné hoření těl v objektu vlivem rozdílného fyzického stavu zvířat a ukázala, že teplota v objektu během požáru dosahovala až na 1000 C. Obr. 6: Pohled na spáleniště chléva (hradisko Chotěbuz Podobora). Jsou zde vyznačeny pozůstatky březí krávy, prasete, tří ovcí a psa. Kráva je v červeném oválu, ovce jsou v oranžových oválech, prase ve žlutém a pes v modrém oválu (Foto: M. Nývltová Fišáková Archeologický ústav AV Brno) Obr. 7: FTIR spektrum vzorku z hnědé kosti krávy 27

Obr. 8: FTIR spektrum vzorku z černé kosti krávy Obr. 9: FTIR spektrum vzorku z bílé kosti Krávy 564, 578, 604 945, 982, 1120 Vlnočet (cm -1 ) Stanovení pásy valenční vibrace O P O fosfátové skupiny trikalciumfosfátu pásy valenční vibrace P O fosfátové skupiny trikalciumfosfátu 710, 874 pásy vibrace O C O karbonátu 1452 1456, 1495 1501, 1547 1451 pásy asymetrické vibrace O C O karbonátu 1412 1414, 1469 1472 pásy asymetrické vibrace O C O karbonátu 1650 pás deformační vibrace H O H vody 3570, 3498 pásy deformační vibrace O H vody 3570 pás valenční vibrace O H hydroxyapatitu Tab. 5: Infračervené pásy stanovované v kosterních pozůstatcích [SHI et al. 2005; LOZANO 2003] Vlnočet (cm -1 ) Stanovení 1200 1000 pásy deformační vibrace C H v aromátech 1450 pás deformační vibrace C H amidů III 1450 pásy skeletální vibrace C=C v aromátech 1550 kombinace valenční vibrace C N a deformační vibrace N H amidů II (proteiny, peptidy) 1580 pás Ar H šestičlenného aromatického kruhu 1650 pás valenční vibrace C=O amidů I (proteiny, peptidy) 3100 2800 pásy valenční vibrace C H 2928, 2857 pásy valenční vibrace C H methylenu 3600 3000 pásy valenční vibrace O H a/nebo N H Tab. 6: Infračervené pásy organických skupin [OUDEMANS et al. 2007; STUART 2004] Analyzován byl také soubor vzorků spálených kostí pocházejících z žárového pohřebiště kultury lužických popelnicových polí (KLPP) nacházejícího se na katastru města Příbor. Během archeologického výzkumu bylo prozkoumáno 89 samostatných hrobů [STABRAVA, rkp. nálezové zprávy]. Pro účely zkoumání spálených kosterních pozůstatků pomocí FTIR byly vybrány následující hrobové celky: H37, H40, H44, H53, H57, H58 a H67. Popelnice byly ve většině případů velmi špatně zachované, kremační pozůstatky byly v ideálním případě zachyceny na dně popelnice, kde často tvořily s uhlíky a hlínou kompaktní krustu (Obr. 10) [STABRAVA, rkp. nálezové zprávy]. Vlastní kosterní pozůstatky byly nalezeny ve fragmentárním stavu, byly zbarveny bíle a jejich povrch byl rozpraskaný (Obr. 11). Infračervená spektra analyzovaných kosterních pozůstatků, pocházejících ze sedmi popelnicových hrobů, vykazují řadu shodných rysů: u všech je pozorovatelná významná redukce pásu vody, zůstal pouze pás OH skupin (3570 cm -1 ) hydroxyapatitu, a významná redukce pásů uhličitanů (Obr. 12). Určující pro odhad kremační teploty je přítomnost pásu β-trikalciumfosfátu (cca 638 cm -1 ), který se objevuje při teplotách nad 800 C [MUNRO et al.]. Teplota zjištěná pro kremace lidí lužické kultury odpovídá 800 900 C, což souhlasí s odhadem J. Wahla (1981), který uvádí pro pravěké 28

Muzea, památky a konzervace 2008 kremace teplotu cca 800 850 C, maximálně 900 C. Takto vysoké hodnoty svědčí o použití značného množství paliva a dokonalém přístupu vzdušného kyslíku, případně o dobře organizované technické stránce kremace. V případě pohřebiště KLPP v Příboře byl prokázán jednotný pohřební ritus a bylo zjištěno, že lidská těla byla spalována při 800 900 C na otevřeném prostranství s dobrým přístupem vzduchu. Závěr Na základě provedených experimentů lze konstatovat, že infračervená spektrometrie je metodou vhodnou pro charakterizaci postmortálních degradačních procesů u kosterních pozůstatků, odrážející charakter prostředí, v němž byly pozůstatky uloženy. Zejména jde o rekrystalizační změny kostní matrice transformaci kostního minerálu na brushit a vivianit. Odraz termicky podmíněných změn kosterních pozůstatků v infračerveném spektru a také přesnější odhad teploty spalování (ve srovnání s dosud užívanými morfologickými postupy) umožňuje nejen detailněji charakterizovat pozůstatky dávných požárů, ale také lépe porozumět technologii kremace pravěkých populací. Literatura Obr. 10: Hrob č. 40 (H40) (Foto: P. Stabrava Společné pracoviště AÚ AV ČR v Brně a SZM v Opavě) Obr. 11: Fragmenty spálených kosterních pozůstatků z hrobu č. 67 Obr. 12: FTIR spektrum spálených kosterních pozůstatků z hrobu č. 37 DOKLÁDAL, M.: Morfologie spálených kostí. Význam pro identifikaci osob. Sborník prací lékařské fakulty 113. Brno 1999. DROZDOVÁ, E.: Dietrichsteinové z Mikulova. Brno 2006. FAIRGRIEVE, S. I.: Forensic cremation, Recovery and Analysis. London New York 2008. JOSHI, V. S. JOSHI, M. J.: FTIR spectroscopic, thermal and growth morphological studies of calcium hydrogen phosphate dihydrate crystals. Crystal Research and Technology 3, 2003, p. 817 821. KLOUDA, P.: Moderní analytické metody. Ostrava 2003. KOUŘIL, P.: Jezdecká elita na hradisku v Chotěbuzi-Podoboře. Těšínsko 50, 2007, č. 1, 5 8. KUMAR, R. A. KALAINATHAN, S.: Growth and characterization of nano-crystalline hydroxyapatite at physiological conditions. Crystal Research and Technology 43, 2008, p. 640 644. HERRMANN, B. NEWESELY, H.: Dekompositionsvorgange Knochens unter langer Liegezeit.1. Die mineralische Phase. Antropologischer Anzeiger 40, 1982, p. 19 31. HOLCK, P.: Cremated Bones. A Medical-Anthropological Study of An Archaeological Material on Cremation Burials. Oslo 1997. LEBON, M. REICHE, I. FRÖHLICH, F. BAHAIN, J. J. FALGUÈRES, C.: Characterization of archaeological burnt bones: contribution of a new analytical protocol based on derivative FTIR spectroscopy and curve fitting of the ν1ν3 PO4 domain. Analytical and Bioanalytical Chemistry 392, 2008, p. 1479 1488. LOZANO, L. F. PEÑA-RICO, M. A. HEREDIA, A. OCOTLÁN-FLORES, J. GÓMEZ-CORTÉS, A. VELÁZQUEZ, R. BELÍO, I. A. BUCIO, L.: Thermal analysis study of human bone. Journal of Materials Science 38, 2003, p. 4777 4782. MUNRO, L. E. et al.: Burning and boiling of modern deer bone: Effects on crystallinity and oxygen isotope composition of bioapatite phosphate Palaeogeography, Palaeoclimatology. Palaeoecology 249, 2007, p. 90 102. PROKEŠ, L.: Posmrtné změny a jejich význam při interpretaci pohřebního ritu. Brno 2007. SHI, J. KLOCKE, A. ZHANG, M. BISMAYER, U.: Thermally-induced structural modification of dental enamel apatite: decomposition and transformation of carbonate groups. 29

European Journal of Mineralogy 17, 2005, p. 769 775. THOMPSON, T. J. U.: Recent advances in the study of burned bone and their implications for forensic anthropology. Forensic Science International 146, 2004, p. 203 205. WAHL, J.: Beobachtungen zur Verbrennung menslicher Leichname. Über die Vergleichbarkeit moderner Kremationen mit prähistorischen Leichenbränden. Archäologisches Korrespondenzblatt 11, 1981. p. 271 279. WALKER, P. L. MILLER, K. W. P. RIHMAN, R.: Time, temperature, and oxygen availibility: an experimental study of the effects of environmental conditions on the color and organic content of cremated bone. The Analysis of Burned Human Remains. Burned Bone 2007, p. 129 135. Summary Infrared spectroscopy is one of the most frequent method used for identification of various materials. This method was used in this study for characterisation of postmortal degradation of skeletal residues. An essential importance for preservation or degradation of bone tissue have the qualities of surrounding soil mainly ph level and humidity. In acidic surroundings the mineral composition of bone hydroxyapatite Ca5(PO4)3OH is gradually melt, which can finally eventuate in decalcification of bone tissue. Another result of the acidic environment is recrystalization of hydroxyapatite into the other mineral called brushit (CaHPO4. 2 H2O). Brushit occurence was approved in bones of Dietrichstein family members, who were buried in a family crypt in Mikulov. A specific factor influencing degradation of bones is high temperature. FTIR spectroscopy can be used to differentiate between burnt or unburnt bones and thanks to this method the temperature of cremation and the burning conditions can be successfully estimated. Bone residues coming from the necropolis in Příbor (the Bronz Age, the Iron Age) and also animal residues from Chotěbuz-Podobora were analysed. 30